專利名稱：：里氏木霉α-淀粉酶增強(qiáng)玉米淀粉的糖化的制作方法里氏木霉a-淀粉酶增強(qiáng)玉米淀粉的糖化本申請要求2007年3月14日提交的美國臨時申請60/906,811和2007年3月14日提交的美國臨時申請60/906,812的優(yōu)先權(quán)，其中每份文件通過引用的方式完整地并入本文作為參考。序列表也附上了包含SEQIDNO:1-7的序列表，其中所述序列表通過引用的方式完整并入本文作為參考。提供了來自里氏木霉(7Wc/io^nmir"se/)的生麥芽糖a-淀粉酶(TrAA)、編碼所述酶的核酸和包含所述核酸的宿主細(xì)胞。使用TrAA的方法包括將淀粉糖化成富含葡萄糖的糖漿。
背景技術(shù)：
：高果糖的玉米糖漿(HFCS)是具有高果糖含量和與糖可比甜度的加工形式的玉米糖漿，從而使得利用HFCS作為軟飲料和其他加工食品中的糖替代物。HFCS目前代表一項十億美元的產(chǎn)業(yè)。產(chǎn)生HFCS的方法多年來已經(jīng)從酸水解發(fā)展至一系列酶催化的反應(yīng)。(1)液化首先使用a-淀粉酶(EC3.2.1.1)將含有30-40%w/w干燥固體(ds)的淀粉懸液降解成麥芽糖糊精。a-淀粉酶是催化隨機(jī)切割內(nèi)部a-l，4-D-糖苷鍵的內(nèi)切水解酶。因為液化一般在高溫例如90-100。C進(jìn)行，所以對該步驟而言，優(yōu)選熱穩(wěn)定的a-淀粉酶，如來自芽孢桿菌(Bacillussp.)的a-淀粉酶。(2)糖化通常使用葡糖淀粉酶和/或生麥芽糖a-淀粉酶來催化在液化后形成的麥芽糖糊精的非還原性末端水解，釋放D-葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖。脫支酶如支鏈淀粉酶可以用來輔助糖化。糖化一般在酸性條件下在升高的溫度例如60。C，pH4,3進(jìn)行。在該工藝中使用的葡糖淀粉酶一般從真菌獲得，例如在Optidex⑥L400中使用的黑曲霉(^^/^7/"swZge/0葡糖淀粉酶(AnGA)或灰腐質(zhì)霉(/f"/mV^/"gn&")葡糖淀粉酶(HgGA)。目前用于本申請的生麥芽糖a-淀粉酶包括植物淀粉酶和來自米曲霉(^s/^f^7/附^vwe)的a-淀粉酶(澄解酶⑧L的活性成分)。糖化可以用來產(chǎn)生高麥芽糖或富含葡萄糖的糖漿。(3)異構(gòu)化當(dāng)需要更甜的產(chǎn)物時，富含葡萄糖的糖漿可以進(jìn)一步加工以產(chǎn)生果糖。葡萄糖至果糖的異構(gòu)化由葡萄糖異構(gòu)酶催化并且產(chǎn)生約42%(w/v)果糖、50-52%葡萄糖、和其他糖的混合物。額外的操作最終可以產(chǎn)生例如具有42%、55%或90%果糖含量的商品級HFCS。所述a-淀粉酶和葡糖淀粉酶直接添加至玉米糖漿的工藝批料(processbatch)并且不重復(fù)利用。另一方面，將葡萄糖異構(gòu)酶固定在糖混合物從中通過的柱子上。該葡萄糖異構(gòu)酶柱重復(fù)使用直至所述酶失去它們活性的大部分。糖化步驟是HFCS生產(chǎn)的限速步驟。糖化一般進(jìn)行48-72小時，在所述時間上眾多真菌葡糖淀粉酶失去它們的大部分活性。此外，盡管生麥芽糖a-淀粉酶和葡糖淀粉酶均可以用來催化糖化，然而所述酶一般在不同的最適pH和溫度處操作。例如，生麥芽糖a-淀粉酶一般具有至少pH5.0的最適pH和低于55。C的最適溫度，而AnGA—般具有pH4.0-4.5的最適pH和約60°C的最適溫度。這兩種酶在反應(yīng)條件上的差異導(dǎo)致必需調(diào)節(jié)pH和溫度，這延緩了整個工藝并且可能導(dǎo)致不溶性直鏈淀粉聚集物形成。當(dāng)降低所述pH時，將使任何殘余的細(xì)菌a-淀粉酶失活；然而所述細(xì)菌a-淀粉酶可以后來由酸穩(wěn)定的a-淀粉酶替代。理想地，該糖化步驟產(chǎn)生具有組成為約95-97%w/w葡萄糖、1-2%w/w麥芽糖和0.5-2%w/w異麥芽糖的糖漿。這種富含葡萄糖的糖漿可以用于上文步驟(3)的異構(gòu)化反應(yīng)中或用于產(chǎn)生結(jié)晶葡萄糖。這些高的葡萄糖濃度不容易實現(xiàn)。例如，里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)相對于AnGA或HgGA提供了改善的比活性；但是，TrGA產(chǎn)生具有一般約88。/。w/v最終葡萄糖濃度的產(chǎn)物。此外，糖漿中的高葡萄糖濃度促使葡萄糖轉(zhuǎn)化成麥芽糖和麥芽三糖。因此，本領(lǐng)域需要制備HFCS的改良方法，該方法包括使用a-淀粉酶的糖化步驟,其中所述a-淀粉酶具有與利用真菌葡糖淀粉酶相容的最適pH和最適溫度。還需要可以在更少時間中催化糖化的a-淀粉酶。此外，需要這樣的a-淀粉酶，其可以實現(xiàn)這些目的，同時在糖化后產(chǎn)生具有約96%w/w葡萄糖濃度的糖漿。發(fā)明簡述本領(lǐng)域中這些和其他需要由來自里氏木霉(TrAA)的生麥芽糖a-淀粉酶滿足。提供了所述酶、所述酶的變體和編碼核酸。也提供表達(dá)TrAA的宿主細(xì)胞。TrAA有利地在多個工藝，尤其在液化后形成的麥芽糖糊精的糖化中使用。在一個實施方案中，TrAA單獨(dú)使用或與其他酶如支鏈淀粉酶組合在麥芽糖生產(chǎn)工藝中使用。TrAA有利地在相對低的pH和高溫催化麥芽糖產(chǎn)生，從而允許使用與真菌葡糖淀粉酶例如AnGA相容的反應(yīng)條件。此外，TrAA產(chǎn)生的便利性使TrAA比當(dāng)前用于麥芽糖生產(chǎn)的a-淀粉酶更經(jīng)濟(jì)。在另一個實施方案中，TrAA用在產(chǎn)生高濃度葡萄糖的糖化工藝中。TrAA有利地抑制從葡萄糖形成麥芽低聚糖的逆反應(yīng)，從而使得加工的玉米淀粉混合物中的葡萄糖濃度達(dá)到約96%w/v高的濃度。此外，該葡萄糖濃度可以在比該反應(yīng)僅用葡糖淀粉酶催化時的更少時間中實現(xiàn)。在一個實施方案中，葡糖淀粉酶隨TrAA添加。例如，該葡糖淀粉酶可以是真菌葡糖淀粉酶，如TrGA;或者可以是添加葡糖淀粉酶的摻合物，如TrGA、HgGA和AnGA的組合。因此，一個目的是提供分離的多肽，所述多肽包含(i)SEQIDNO:3的第21-463位殘基或(ii)里氏木霉a-淀粉酶(TrAA)的變體，其中該變體具有a-淀粉酶活性并與SEQIDNO:3的第21-463位殘基具有至少80%、至少卯％或至少95%的氨基紗列同一性。例如，與SEQIDNO:3的第21-463位殘基相比，該變體可以具有l(wèi)-10個氨基酸替代、插入或缺失。備選地，該多肽可以包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:3的第21-463位殘基，即缺少信號序列的成熟多肽序列。該多肽可以包含來自除里氏木霉之外的物種的信號序列。在一個實施方案中，所述多肽是糖基化的。還可以純化所述分離的多肽。另一個目的是提供編碼上文多肽的多核苷酸。該多核苷酸可以包含SEQIDNO:2，即一個cDNA序列。還提供分離的mRNA，其中將SEQIDNO:2中的T殘基替代為U(尿嘧咬)殘基。另一個目的是提供包含以上多核苷酸的載體和包含該載體的細(xì)菌細(xì)胞。也提供了表達(dá)該多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞在一個實施方案中是木霉屬(7Wdi0rflfe/7fmsp.),尤其里氏木霉(r.reew/)。此宿主備選地可以是RL-P37分離林、絲狀真菌細(xì)胞、曲霉屬(Ay/^/^7/wsp.)、鐮孢屬8口.)或青霉屬(尸《附'"7//"附sp.)。曲霉屬宿主細(xì)胞可以是構(gòu)巢曲霉(y4印w7/ws1"to/fl"5)、泡盛曲霉(/!fl觸附or/)、米曲霉(Aorj;，)、棘孢曲霉(Aflc"fe"似s)、黑曲霉(AwZger)或日本曲霉(Ayopow/c附)。鐮孢屬宿主細(xì)胞可以是尖鐮孢菌CF"^iWw附似戸/wr"附)或茄腐鐮孢菌(F.m/朋i)。該宿主細(xì)胞還可以表達(dá)編碼異源性葡糖淀粉酶(即與該宿主細(xì)胞不相同的物種的葡糖淀粉酶)的核酸。該葡糖淀粉酶例如可以是灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶。該宿主細(xì)胞備選或額外地可以不表達(dá)宿主細(xì)胞內(nèi)源性葡糖淀粉酶。另一個目的是提供糖化淀粉的方法，包括向液化淀粉溶液添加上文所述的多肽，和糖化液化淀粉溶液。所述多肽可以以每公噸干燥固體約0.3-1kg添加至液化淀粉溶液。液化淀粉溶液可以是約20-35%w/w干燥固體的液化淀粉漿液。該方法還可以包括添加葡糖淀粉酶至液化淀粉溶液的步驟，其中糖化所述液化淀粉溶液產(chǎn)生了富含葡萄糖的糖漿。該富含葡萄糖的糖漿中的葡萄糖濃度可以達(dá)到至少約97%w/wds。葡萄糖在該富含葡萄糖的糖漿中的最大濃度可以從添加所述多肽至液化淀粉溶液的約24小時內(nèi)實現(xiàn)。該葡糖淀粉酶可以從植物、真菌或細(xì)菌衍生。例如，該葡糖淀粉酶可以是里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)、黑曲霉葡糖淀粉酶(AnGA)或灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HgGA)。該葡糖淀粉酶可以從曲霉屬、泡盛曲霉、米曲霉的真菌、籃狀菌屬(7V/ffro附j(luò);c&ssp.)、埃默森籃狀菌(r.e附mwi/i)、T./eyc"似ww51、71.fifw/WMft、嗜熱籃狀菌(7:幼e/vm/^i7"^、梭菌屬(C7^加V/,"附s/.)、解淀粉熱梭菌(C1幼er附o"附j(luò);/(7(vftcw附)或熱石J(/fb氛梭菌r(C幼^7W0/tj^/fY^M^iin'cw附)^f生。該葡糖淀粉酶可以按照約0.02-2.0GAU/gds或約0.1-1.0GAU/gds的量添加。可以額外地添加其他酶，包括但不限于脫支酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、或它們的組合。糖化淀粉的方法還可以包括發(fā)酵糖化的淀粉溶液以產(chǎn)生乙醇。液化淀粉溶液可以在約40。C至約60°C。液化淀粉溶液可以處在約pH4.0至約pH6.0或約pH4.2至約pH4.8。又一個目的是提供淀粉加工組合物，其中所述的淀粉加工組合物包含上述多肽和任選地包含葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、p-淀粉酶、不是TrAA的真菌a-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、異淀粉酶、或它們的組合。另一個目的是提供包含在溶液或在凝膠中的上述多肽的烘烤用組合物。烘烤的方法包括添加權(quán)利要求46的烘烤用組合物至待烘烤的物質(zhì)并烘烤該物質(zhì)。再一個目是提供織物退漿組合物，其包含在水溶液中的所述多肽，并且任選地還有另一種酶。使織物退漿的方法包括將所述退漿組合物與織物接觸，持續(xù)足以使該織物退漿的時間。附圖簡述所附附圖并入且構(gòu)成本說明書的一部分，并且說明多個實施方案。在所述圖中圖l描述了TrAA在葡糖淀粉酶存在下以優(yōu)于單獨(dú)由葡糖淀粉酶所實現(xiàn)的效率催化糖化工藝的能力。y-軸顯示在pH4.2，60°C24小時糖化工藝后所產(chǎn)生的葡萄糖(DP1)的重量百分?jǐn)?shù)。此反應(yīng)由1.0kg/mtds葡糖淀粉酶(GA)單獨(dú)催化或與所示量的kg/mtdsTrAA組合的GA催化。應(yīng)當(dāng)指出添加lmg酶至含有32o/。干燥固體的50mL溶液例如意指該溶液含有1mg酶/16gds或0.0625kg/mtds。圖2描述TrAA在低pH催化麥芽糖產(chǎn)生的能力。y-軸顯示在55°C由0.5kg/mtdsTrAA催化的24小時麥芽糖生產(chǎn)工藝后所產(chǎn)生的麥芽糖(DP2)的重量百分?jǐn)?shù)。該反應(yīng)的pH顯示在x-軸上。圖3描述TrAA以可比于澄解酶⑧L(Clarase⑧L)的效率催化麥芽糖產(chǎn)生的能力。在y-軸上顯示48小時麥芽糖生產(chǎn)工藝后所產(chǎn)生的麥芽糖(DP2)的重量百分?jǐn)?shù)。在x-軸上顯示用來催化該反應(yīng)的酶。"澄解酶"在pH5.5，55。C的10SKBU/gds澄解酶⑧L。"10TrAA":在pH4.5，60。C的10SKBU/gds里氏木霉a-淀粉酶。"15TrAA"和"20TrAA"分別代表在pH4.5，60。C的15SKBU/gds和20SKBU/gds的TrAA。"20TrAA+PU"4戈表添加0.25kg/mtds支鏈淀粉酶至處于pH4.5，60。C的20SKBU/gdsTrAA。圖4描述在最適量的支鏈淀粉酶情況下由TrAA催化的麥芽糖生產(chǎn)工藝。y-軸顯示在0.5kg/mtdsTrAA存在下，在pH4.6，58。C48小時后所產(chǎn)生的麥芽糖(DP2)的重量百分?jǐn)?shù)。x-軸顯示添加至該反應(yīng)的以kg/mtds為單位表示的支鏈淀粉酶的量。圖5顯示SDS-PAGE解析的蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)來自一小份表達(dá)TrAA的培養(yǎng)細(xì)胞(泳道l)或來自純化的TrAA(泳道2)。分子量標(biāo)記在泳道M中顯示。圖6A顯示作為pH函數(shù)的純化TrAA的a-淀粉酶相對活性(以任意單4立)，4吏用Ceralpha試齊寸(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Wicklow，Ireland;目錄號K-CERA)作為底物。圖6B顯示作為溫度函數(shù)的純化TrAA的a-淀粉酶相對活性(以任意單位)，使用相同的人工底物。圖7A和圖7B是SEQIDNO:l-7的序列表發(fā)明詳述提供了來自里氏木霉的真菌a-淀粉酶。TrAA提供優(yōu)于目前所用a-淀粉酶的幾個優(yōu)勢。首先，TrAA在相對低的pH和高溫有活性，從而允許此酶與真菌葡糖淀粉酶在相同的反應(yīng)條件下組合使用。這避免必需將糖化反應(yīng)作為分批法運(yùn)行，在所述分批法中必須重調(diào)pH和溫度以最佳地利用a-淀粉酶或葡糖淀粉酶。其次，與支鏈淀粉酶組合時，TrAA以與常用的更昂貴的酶(如澄解酶⑧L)相同的效率催化麥芽糖產(chǎn)生。1.定義和縮寫根據(jù)這份詳述的描述，以下縮寫和定義適用。應(yīng)當(dāng)指出如本文中所用，單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)稱謂，除非上下文清楚地說明并非如此。因此，例如，對"一種酶"的指稱包括多種此類酶，并且對"該配方"的指稱包括對一個或多個配方和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物的指稱等。除非本文另外定義，本文中所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同意義。下文提供以下術(shù)語。l丄定義"淀粉酶"意指能夠催化淀粉降解的酶，這只是其中之一。通常，a-淀粉酶(EC3.2.1.1;a-D-(l—4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定義為以隨機(jī)方式切割淀粉分子內(nèi)部a-D-(1—4)0-糖苷鍵的內(nèi)切作用酶。相反，外切作用解淀粉酶，如生麥芽糖a-淀粉酶(EC3.2.1.133);p-淀粉酶(EC3丄1.2;和a-D_(l—4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)從底物的非還原性末端切割淀粉分子。p-淀粉酶、a-葡糖苷酶(EC3.2.1.20;a-D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3;a-D-(l—4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和產(chǎn)物特異性淀粉酶可以從淀粉產(chǎn)生特定長度的麥芽低聚糖。葡糖淀粉酶從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原性末端釋放葡糖基殘基。葡糖淀粉酶也催化a-l，6和a-l，3鍵水解，盡管速率比a-l，4鍵'l"曼得多。體酶"意指具有已經(jīng)從野生型a-淀粉酶的氨基酸序列修飾而來的氨基酸序列的a-淀粉酶蛋白。如本文中所用，"親本酶"、"親本序列"、"親本多肽"、"野生型a-淀粉酶蛋白"和"親本多肽"意指a-淀粉酶變體多肽以之為基礎(chǔ)的酶和多肽，例如里氏木霉a-淀粉酶。"親本核酸"意指編碼該親本多肽的核酸序列。野生型a-淀粉酶天然地存在，"a-淀粉酶變體"與野生型a-淀粉酶在成熟蛋白質(zhì)的氨基酸殘基方面不同，即其中所述成熟蛋白質(zhì)無信號序列。該a-淀粉酶變體可以是含有異源性a-淀粉酶多肽的融合蛋白。例如，該a-淀粉酶蛋白可以包含與另一種a-淀粉酶的信號肽連接的成熟a-淀粉酶蛋白。，'變體"涉及多肽和核酸。術(shù)語"變體"可以與術(shù)語"突變體"彼此交換使用。變體分別包括在氨基酸或核苷酸序列中的一個或多個位置處插入、替代、顛換、截短和/或倒位。變體核酸可以包括與能夠同本文中所述核苷酸序列雜交的序列互補(bǔ)的序列。例如，變體序列與能夠同本文中所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件(例如50。C和0.2xSSC(lxSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0))下雜交的序列互補(bǔ)。更具體地，術(shù)語"變體"包括與能夠在高嚴(yán)格條件(例如65°C和0.1xSSC)下同本文中所述核苷^列雜交的序列互補(bǔ)的序列。如本文中所用，術(shù)語"表達(dá)"指基于基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。"分離的"意指該序列至少基本上不含與所述序列天然關(guān)聯(lián)并在自然界中存在的至少一種其他組分。"純化"意指該材料處于相對純的狀態(tài)，例如，至少約卯％純，至少約95%純或至少約98%純。"熱穩(wěn)定的，，意指該酶在暴露于升高的溫度后仍保留活性。酶(如a-淀粉酶)的熱穩(wěn)定性由其半壽期(t,/2)度量，其中一半的酶活性在半壽期期間喪失。在定義的條件下通過測量殘余淀粉酶活性計算半壽期值。"pH范圍"意指酶從跨度為5個或更多個pH單位的酸性條件至堿性條件顯示催化活性的能力。如本文中所用，"pH穩(wěn)定的"涉及酶在寬pH范圍內(nèi)保留活性的能力。如本文中所用，"氨基酸序列"與術(shù)語"多肽"和/或術(shù)語"蛋白質(zhì)"同義。在一些情況下，術(shù)語"氨基酸序列，，與術(shù)語"肽，，同義；在一些情況下，術(shù)語"氨基一列"與術(shù)語"酶"同義。如本文中所用，"核苷酸序列"或"核酸序列"指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其變體、同源物(homologues)、片段和4汙生物。該核苷酸序列可以是基因組、合成或重組來源的并且可以是雙鏈或單鏈，無論代表有義鏈或反義鏈。如本文中所用，術(shù)語"核苷酸序列"包括基因組DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。"同源物"意指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有某種程度同一性或"同源性"的實體。"同源序列"包括與另一個序列具有某個百分?jǐn)?shù)例如80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性的多核苷酸或多肽。百分同一性是指在比對時比較這兩個序列中相同的堿基或氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。當(dāng)在氨基酸序列中與主題序列相比，替代、缺失或添加了氨基酸，則氨基酸序列是不相同的。百分序列同一性通常相對于主題蛋白的成熟序列進(jìn)行測量，即例如在翻譯后修飾以除去信號序列之后進(jìn)行。一般而言，同源物將包含與主題氨基酸序列相同的活性部位殘基。同源物也保留了生麥芽糖a-淀粉酶活性，盡管所述同源物可以具有與主題蛋白質(zhì)不同的酶特性。如本文中所用，"雜交"包括一條核酸鏈通過堿基配對作用與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過程，以及如在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)中那樣進(jìn)行的擴(kuò)增過程。a-淀粉酶變體核酸可以作為單鏈或雙鏈DNA或RNA、RNA/DNA異雙鏈體或RNA/DNA共聚物存在。如本文中所用，"共聚物"指包含核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸這兩者的單個核酸鏈。所述a-淀粉酶變體核酸可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化以進(jìn)一步提高表達(dá)。如本文中所用，"合成的，，化合物通過體外化學(xué)合成或酶合成產(chǎn)生。它包括但不限于以針對宿主生物如甲基營養(yǎng)酵母-畢赤酵母(Pichia)、漢遜酵母(Hansenula)、鏈霉菌(Streptomyces)和木霉(例如里氏木霉)或所選其他表達(dá)宿主的最佳密碼子使用所產(chǎn)生的a-淀粉酶變體核酸。如本文中所用，"轉(zhuǎn)化細(xì)胞，，包括已經(jīng)利用重組DNA技術(shù)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包括細(xì)菌細(xì)胞和真菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化一般通過插入一個或多個核苷酸序列至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。插入的核苷酸序列可以是異源性核苷酸序列，即對于待轉(zhuǎn)化細(xì)胞而言不是天然的序列，如融合蛋白。如本文中所用，"有效連接，，意指所述組分處在使它們以預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。例如，與編碼序列有效連接的調(diào)節(jié)序列以這樣的方式連接，從而在與所述調(diào)控序列相容的條件下實現(xiàn)該編碼序列的表達(dá)。如本文中所用，"生物活性的"指與天然存在序列具有相似結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)功能或生物化學(xué)功能的序列，盡管不必是相同程度。術(shù)語"絲狀真菌，，指真菌亞門(Eumycotina)的全部絲狀形式。參見Alexopoulos，INTRODUCTORYMYCOLOGY,Wiley，NewYork(1962)。這些真菌的特征是具有包含幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)雜多糖的細(xì)胞壁的營養(yǎng)菌絲體。絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳上不同于酵母。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲延伸進(jìn)行，并且碳代謝是專性需氧的。絲狀真菌的親本細(xì)胞可以是木霉屬(7Wc/^^r附asp.)例如里氏木霉(先前分類為長枝木霉(r./owg幼mc/r/flr"附)并且目前也稱作紅褐肉座菌(/^/^C7Tfl、綠色木霉(T.viride)、康氏木霉(r.A:柳/"gi1〕、哈茨木霉(r.A"c'朋w附)；青霉屬(尸《"/"7//"附sp.);腐質(zhì)霉屬(^""/mco/flsp.)，伊Ji口特異腐質(zhì)霉(H.insolens)和灰腐質(zhì)霉(H.grisea);金抱霉屬(C^，os/)o"'w附sp.)例如C./wc^ioivmse;粘帚霉屬(G7/oc/"力M附sp.);曲霉屬(^印e/^,7/"ssp.)例如米曲霉(Ao^"e)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(Aflw"附on);鐮孢屬(F附ar/"wsp.);脈孢菌屬(7Ve"mspomsp.);肉座菌屬廣外"cmi8卩.)和棵胞殼屬(￡>肌."http://"sp.)的細(xì)胞。還參見Imiis等，Science228:21-26(1985)。如本文中所用，術(shù)語"淀粉"指包含植物的復(fù)雜多糖碳水化合物的任意物質(zhì)，所述的復(fù)雜多糖碳水化合物包含分子式(C6HK)05)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任意數(shù)字。術(shù)語"顆粒淀粉"指生的，即未烹煮的淀粉，例如，還沒有進(jìn)行糊化的淀粉。如本文中所用，術(shù)語"糖化"指淀粉至葡萄糖的酶轉(zhuǎn)化。術(shù)語"液化"指淀粉轉(zhuǎn)化中水解糊化淀粉以產(chǎn)生低分子量可溶性糊精的階段。術(shù)語"聚合度(DP)"指給定糖中脫水吡喃型葡萄糖單元的數(shù)目(n)。DPI的實例是單糖葡萄糖和果糖。DP2的實例是二糖麥芽糖和蔗糖。如本文中所用，術(shù)語"干燥固體含量"(ds)指漿液中基于干燥重量百分?jǐn)?shù)的總固體。術(shù)語"漿液"指含有不溶性固體的7jC質(zhì)混合物。術(shù)語"DE"或"葡萄糖當(dāng)量"定義為作為糖漿中總碳水化合物的一部分的還原糖即D-葡萄糖的百分?jǐn)?shù)。短語"同時糖化和發(fā)酵(SSF)"指生物化學(xué)品生產(chǎn)中的一個工藝，其中微生物如產(chǎn)乙醇^:生物和至少一種酶如TrAA或其變體在相同的工藝步驟中存在。SSF指例如在相同反應(yīng)容器中將顆粒淀粉底物同時水解成包括葡萄糖在內(nèi)的糖和將糖發(fā)酵成醇。如本文中所用，"產(chǎn)乙醇微生物"指具有將糖或寡糖轉(zhuǎn)化成乙醇的能力的微生物。1.2.縮寫除非另外說明，使用以下縮寫ADA偶氮二甲酰胺AnGA黑曲霉葡糖淀粉酶ATCC美國典型培養(yǎng)物保藏中心BBASpezymeBBA1500L卩-淀粉酶cDNA互補(bǔ)的DNADE葡萄糖當(dāng)量DEAE二乙氨基乙醇DNA脫氧核糖核酸DNS3，5-二硝基水楊酸DPn具有n個亞單元的聚合度ds干燥固體EC酶分類酶學(xué)委員會EDTA乙二胺四乙酸FGSCG173AGAGAUHFCSHFSSHPLCHgGAHSkbLATLBLUMOPSmRNAmtPCRPEGPPmPURT-PCRSDSDS誦PAGESKBU/g真菌遺傳學(xué)貯藏中心在第173位置處的甘氨酸(G)殘基替代為丙氨酸(A)殘基，其中氨基酸由本領(lǐng)域通常已知的單字母縮寫命名葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶活性單位高果糖的玉米糖漿基于高果糖淀粉的糖漿高效液相色譜灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶高^l(DPn,其中n>3)千堿基地衣芽孢桿菌CB./i'c/^肌/c/M&)a-淀粉酶LuriaBertani肉湯脂肪酶單位，是每單位質(zhì)量酶的磷脂酶活性的計量單位3-(n-嗎啉代)丙磺酸信使核糖核酸公噸(IOOOkg)聚合酶鏈反應(yīng)聚乙二醇百萬分之...支鏈淀粉酶或支鏈淀粉酶單位逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)Sabouraud葡萄糖肉湯十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳每克千燥固體的a-淀粉酶單位。一個a-淀粉酶單位在測試條件下每小時使1.0g極P艮糊精底物糊精化lxSSC0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0SSF同時糖化和發(fā)酵TE10mMTris，pH7.4，1mMEDTATrAA里氏木霉a-淀粉酶TrGA里氏木霉葡糖淀粉酶w/v重量/體積w/w重量/重量YM酵母麥芽提取物肉湯微升2.里氏木霉a-淀粉酶(TrAA)和其變體提供了包含SEQIDNO:3的分離和/或純化的多肽。這種多肽是包含20個氨基酸前導(dǎo)序列的野生型里氏木霉a-淀粉酶(TrAA)。在一個實施方案中，TrAA是所述多肽的成熟形式，其中切除了所述20個氨基酸的前導(dǎo)序列，從而該多肽的氨基末端始于SEQIDNO:3的第21位置處的天冬氨酸(D)殘基。還提供了編碼多肽的核酸，其中所述多肽包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:3的第21-463位氨基酸殘基。在一個實施方案中，編碼TrAA的核酸是包含SEQIDNO:l的基因組DNA;在另一個實施方案中，該核酸是包含SEQIDNO:2的cDNA。如本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解，遺傳密碼具有簡并性，意指在一些情況下多個密碼子可以編碼相同的氨基酸。核酸包括編碼TrAA或其變體的基因組DNA、mRNA和cDNA。除了野生型里氏木霉a-淀粉酶(TrAA)外，還提供其變體，其中所述變體因替代、插入或缺失一個或多個氨基酸而與SEQIDNO:3中所示的野生型TrAA序列不同。例如，變體a-淀粉酶可以包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35或40個氨基酸1奮飾，例如1-10個氨基酸替代，同時保留生麥芽糖a-淀粉酶活性。該變體TrAA可以保留比野生型TrAA更高或更低的比活性。所述變體與"同源物"同義。提供了編碼所述變體多肽的變體核酸。變體核酸包括編碼所述變體多肽的全部核酸。2.1.TrAA變體的表征酶變體可以以其核酸和一級多肽序列、以三維結(jié)構(gòu)建模和/或以其比活性為特征來描述。TrAA變體的額外特征例如包括穩(wěn)定性、pH范圍、氧化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。在一個方面，所述TrAA變體以高于野生型TrAA的水平表達(dá)，同時保留野生型TrAA的性能特征?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測定法評估表達(dá)水平和酶活性。在另一方面，變體表現(xiàn)了相對于野生型酶的改良性能特征，如在高溫(即70-120。C)和/或極端pH(即pH4.0至6.0或pH8.0至ll.O)時提高的穩(wěn)定性。表達(dá)特征意指當(dāng)變體在特定宿主細(xì)胞中產(chǎn)生時此變體的改變的表達(dá)水平。表達(dá)通常涉及使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，經(jīng)給定量的時間后從發(fā)酵肉湯可回收的活性變體的量。表達(dá)也可以涉及在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生或由此宿主細(xì)胞分泌的變體的量和速率。表達(dá)也可以涉及編碼所述變體酶的mRNA的翻譯速率。與親本a-淀粉酶相比，TrAA變體也可以具有改變的氧化穩(wěn)定性。例如，降低的氧化穩(wěn)定性可能在淀粉液化組合物中是有利的。該變體TrAA可以比野生型a-淀粉酶具有更高熱穩(wěn)定性。此類TrAA變體有利于用在要求溫度升高的烘烤或其他工藝中。例如，熱穩(wěn)定性TrAA變體可以在約55°C至約80。C或更高溫度降解淀粉。熱穩(wěn)定性TrAA變體可以在暴露于高達(dá)約95°C的溫度之后仍保留其活性。本文中所述的a-淀粉酶變體多肽也可以相對于親本酶具有這樣的突變，其中所述突變延長半壽期達(dá)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，尤其在約55。C至約95°C或更高的升高溫度上，尤其在約80°C如此。在一個實施方案中，該TrAA變體可以在80°C或更高溫度上加熱約1-10分鐘。該TrAA變體多肽進(jìn)一步地可以在親本多肽的信號序列中或在TrAA親本多肽中其他位置包含突變。例如，該TrAA變體可以是包含異源性多肽，如來自地衣芽孢桿菌(LAT)的信號肽的融合蛋白形式，其中所述的異源性多肽與TrAA融合以促進(jìn)表達(dá)的蛋白質(zhì)從細(xì)菌宿主細(xì)胞分泌?？梢耘c序列。在一個實施方案中，異源性序列包括允許從表達(dá)的變體TrAA切除該異源性序列的蛋白g感位點(diǎn)。在一個方面，由所述核酸編碼的TrAA變體多肽具有與親本序列相同的pH穩(wěn)定性。在另一方面，該TrAA變體包含出于該酶的最終商業(yè)目的而賦予更大的pH穩(wěn)定性范圍或轉(zhuǎn)變該pH范圍至所需范圍的突變。例如，在一個實施方案中，該TrAA變體可以在約pH4.5至約pH10.5降解淀粉。與親本多肽相比，該TrAA變體多肽可以在相同條件下具有更長的半壽期或更高的活性(取決于測定法)或該TrAA變體可以具有與親本多肽相同的活性。該a-淀粉酶變體多肽也可以在相同pH條件下與親本多肽相比具有約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更長的半壽期。備選地或此外，該TrAA變體可以在相同pH條件下與親本多肽相比具有更高的比活性。在另一方面，提供了與編碼本文中所述任意TrAA變體的核酸互補(bǔ)的核酸。另外，提供能夠與該互補(bǔ)物雜交的核酸。在另一個實施方案中，在本文所述方法和組合物中使用的序列是合成序列。它包括但不限于為在宿主生物如甲基營養(yǎng)酵母-木霉、畢赤酵母和漢遜酵母中表達(dá)而以最佳密碼子使用所制備的序列。3.TrAA和其變體的產(chǎn)生在一個實施方案中，野生型TrAA在里氏木霉菌林中表達(dá)并且任選地在使用前分離。在另一個實施方案中，將野生型TrAA在表達(dá)后純化。使用技術(shù)人員熟知的技術(shù)，選出了以高水平表達(dá)野生型TrAA的特別有用的里氏木霉菌林。高水平表達(dá)可以是每升培養(yǎng)基約12-20g、約14-18g/L或約16-19g/L的TrAA或其變體。在其他實施方案中，野生型TrAA或其變體在宿主細(xì)胞中重組地表達(dá)。TrAA基因可以例如美國zi^開申請?zhí)?007/0004018和2006/0094080中所述那樣克隆和表達(dá)。重組表達(dá)的酶在一些實施方案中，微生物進(jìn)行基因工程化以表達(dá)TrAA或其變體。合適的宿主細(xì)胞包括例如可以是曲霉屬、木霉屬、鐮孢屬或青霉屬菌林的絲狀真菌細(xì)胞。特別合適的真菌宿主細(xì)胞包括構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、綠色木霉(r.ww^)、尖鐮孢菌和茄腐鐮孢菌。曲霉屬菌林在Ward等，Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738-743(1993)和Goedegebuur等，Curr.Gene.41:89-98(2002)中披露。在一個特別合適的實施方案中，宿主是以相對高的水平例如15-20g/L產(chǎn)生TrAA的里氏木霉菌林。合適的里氏木霉是已知的，并且非限制性實例包括ATCCNo.13631、ATCCNo.26921、ATCCNo.56764、ATCCNo.56765、ATCCNo.56767和NRRL15709。在一些實施方案中，宿主菌抹是RL-P37的4汙生物，其在Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnology20:46-53(1984)中披露。當(dāng)TrAA或其變體在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)時，表達(dá)的TrAA在一個特別合適的實施方案中具有如在野生型TrAA中所發(fā)現(xiàn)的相同糖基化模式。特別合適的宿主細(xì)胞包括根據(jù)美國專利號5，874，276和WO05/001036(GenencorInternational,Inc.)中所述的方法工程化設(shè)計的里氏木霉宿主細(xì)胞。在其他實施方案中，該宿主細(xì)胞是具有失活的天然基因例如基因缺失的基因工程宿主細(xì)胞。例如，可以使用已知方法如美國專利號5,246,853、美國專利號5，475，101和WO92/06209中所述的那些方法失活真菌宿主細(xì)胞中的一個或多個基因?；蚴Щ羁梢酝ㄟ^完全或部分缺失、通過插入失活或通過使得基因無法為其預(yù)定目的發(fā)揮作用的任意其他方法實現(xiàn)，如阻止該基因表達(dá)功能性蛋白質(zhì)。失活的基因可以包括例如編碼纖維素分解酶如內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維二糖水解酶的基因，例如eM/、cM2、"http://、eg/2和^/丄在一個實施方案中，當(dāng)宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞、尤其是里氏木霉宿主細(xì)胞時，失活并且尤其缺失c6/^、cM2、"W和②/2基因。在美國專利號5，874，276和WO05/001036中給出和描寫了具有四重缺失的蛋白質(zhì)的特別合適的里氏木霉宿主細(xì)胞。在另一個實施方案中，美國專利號5,650,322披露了例如在cbhl基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37的衍生菌林。在另一個實施方案中，合適的宿主細(xì)胞包括選自枯草芽孢桿菌(ia"7/附s&/fo)、地衣芽孢桿菌CB.//cAefM/or/w&)、遲緩芽孢桿菌(及/e"似s)、短小芽孢桿菌(5.6"v的、嗜熱脂肪芽胞桿菌CB.Weflm幼er附o/7/h7附)、嗜堿芽胞桿菌CB."汰"/0/^//附)、解淀粉芽孢桿菌(必."附j(luò);/C/^e/"cie船)、凝結(jié)芽孢桿菌CB.coflgw/"/w)、環(huán)狀芽孢桿菌(及"Vtm/(i附)、燦爛芽胞桿菌(及/""似s)、蘇云金芽孢桿菌(5.狄wri"gie附&)、變鉛青鏈霉菌(Are/;to附F"/f'wW朋^或鼠灰鏈霉菌(51.wwW"附)的革蘭氏陽性細(xì)菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，其中所述的革蘭氏陰性細(xì)菌是大腸桿菌(EscAmcA/flco/,)或假單胞菌屬(i^M^卿M似)物種。在一些實施方案中，將宿主細(xì)胞進(jìn)行基因工程化以表達(dá)具有如下氨基酸序列的TrAA變體，其中所述的氨基酸序列與野生型TrAA具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些實施方案中，編碼TrAA或其變體的多核苷酸具有SEQIDNO:2的核酸序列或與SEQIDNO:2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99。/。序列同一性的核酸序列。在其他實施方案中，表達(dá)TrAA或其變體的宿主菌林也進(jìn)行基因工程化以表達(dá)異源性GA。3.2.栽體在一些實施方案中，構(gòu)建了在宿主細(xì)胞中待表達(dá)的DNA構(gòu)建體，其包含編碼TrAA或其變體的核酸。編碼TrAA的代表性核酸包括SEQIDNO:l和2。在一個實施方案中，該DNA構(gòu)建體由表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞，其中所述的表達(dá)載體包含與TrAA編碼序列有效連接的調(diào)節(jié)序列。載體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時能夠整合至真菌宿主細(xì)胞基因組并復(fù)制的任意載體。FGSC菌林目錄列出了合適的栽體。參見www.fgsc.net上的密蘇里大學(xué)FGSC菌林目錄(2007年1月17日最新修改)。合適的表達(dá)和/或整合載體的額外實例在Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryP簡，ColdSpringHarbor,NewYork(2001);Bennett等，MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI,AcademicPress,SanDiego(1991)，第396-428頁和美國專利號5，874，276中提供。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC謂和pENTR/D、pDON1^201、pDONRTM221、pENTRTM、pGEM3Z和pGEM4Z。用在細(xì)菌細(xì)胞中的合適質(zhì)粒例如包括允許在大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制的pBR322和pUC19以及允許在芽孢桿菌屬(BacilIus)中復(fù)制的pE194。在一些實施方案中，編碼TrAA或其變體的核酸與允許在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子有效連接。該啟動子可以從編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因衍生。優(yōu)選地，該啟動子用于木霉屬宿主中。啟動子的合適非限制性實例包括c6/^、cM2、化//和％/2啟動子。在一個實施方案中，該啟動子是對宿主細(xì)胞為天然的一種啟動子。例如，當(dāng)里氏木霉是宿主時，該啟動子是天然的里氏木霉啟動子。在一個實施方案中，該啟動子是里氏木霉啟動子，它是以登錄號D86235在GenBank登錄的一種誘導(dǎo)型啟動子。"誘導(dǎo)型啟動子，，是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)作用下有活性的啟動子。在另一個實施方案中，啟動子是對宿主細(xì)胞為異源的一種啟動子。有用啟動子的其他實例包括來自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子。參見Nunberg等，Mol.Cell.Biol.4:2306-2315(1984)和Boel等，EMBOJ.3:1581-1585(1984)。在一些實施方案中，編碼序列與信號序列有效連接。編碼信號序列的DNA可以是與待表達(dá)的TrAA基因天然連接的DNA序列。例如，該編碼性DNA可以包含編碼SEQIDNO:5的TrAA信號序列的核苷酸序列SEQIDNO:4。在其他實施方案中，該編碼性DNA不包含SEQIDNO:4，其中SEQIDNO:4以編碼來自里氏木霉以外的物種的信號序列的核苷酸序列替代。在這個實施方案中，編碼信號序列的多核苷酸緊鄰于編碼多肽的多核苷酸的上游并與之形成可讀框。在額外的實施方案中，包含在待導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞的DNA構(gòu)建體或載體中的信號序列和啟動子序列從相同來源衍生。例如，在一些實施方案中，信號序列是與cbhl啟動子有效連接的cbhl信號序列。在一些實施方案中，所述表達(dá)載體也包括終止序列。在一個實施方案中，該終止序列和啟動子序列從相同來源衍生。在另一個實施方案中，該終止序列與宿主細(xì)胞同源。特別合適的終止子序列是從木霉屬菌株且尤其里氏木霉衍生的cM/。其他有用的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子。參見上文Nunberg等(1984)和上文Boel等(1984)。在一些實施方案中，表達(dá)載體包括選擇標(biāo)記。合適選擇標(biāo)記的實例包括賦予抗微生物藥(例如潮霉素或博來霉素)抗性的那些選擇標(biāo)記。營養(yǎng)選擇標(biāo)記也是適合的并且包括amdS、argB和pyr4。在用于轉(zhuǎn)化木霉的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的。例如，參見BIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI,Finkelstein等編輯，Butterworth畫Heinemann，Boston,Mass.(1992)，第6章；和Kinghorn等，APPLIEDMOLECULARGENETICSOFFILAMENTOUSFUNGI,BlackieAcademicandProfessional,Chapman和Hall,倫敦(1992)。在一個實施方案中，該選擇標(biāo)記是編碼乙酰胺酶的amdS基因；它允許轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在作為氮源的乙酰胺上生長。在Kelley等，EMBOJ.4:475-479(1985)和PenttHa等，Gene61:155-164(1987)中描述了使用構(gòu)巢曲霉"附dS基因作為選擇標(biāo)記。包含具有編碼TrAA或其變體的多核苷酸的DNA構(gòu)建體的合適表達(dá)載體可以是能夠在給定宿主生物中自主復(fù)制或整合入宿主DNA的任意載體。在一些實施方案中，該表達(dá)載體是質(zhì)粒。在一些實施方案中，構(gòu)思了兩個類型的表達(dá)栽體以獲得基因表達(dá)。第一表達(dá)栽體包含其中啟動子、TrAA編碼區(qū)和終止子均源自待表達(dá)基因的DNA序列。在一些實施方案中，通過缺失不想要的DNA序列(例如編碼不想要的結(jié)構(gòu)域的DNA)獲得基因截短，以使待表達(dá)的結(jié)構(gòu)域處在自身的轉(zhuǎn)錄性和翻譯性調(diào)節(jié)序列控制下。第二類型的表達(dá)栽體是預(yù)裝配的并且含有高水平轉(zhuǎn)錄所需要的序列和選擇標(biāo)記。在一些實施方案中，將TrAA基因或其部分的編碼區(qū)插入這種通用目的表達(dá)栽體，從而該編碼區(qū)處在此表達(dá)構(gòu)建體的啟動子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制下。在一些實施方案中，將基因或其部分插入強(qiáng)WW啟動子的下22游。用來連接DNA構(gòu)建體的方法和將該構(gòu)建體插入合適載體的方法是本領(lǐng)域熟知的，其中所迷的DNA構(gòu)建體包含編碼TrAA或其變體的多核苷酸、啟動子、終止子和其他序列。連接通常通過在便利限制性位點(diǎn)處的連接反應(yīng)完成。如此類位點(diǎn)不存在，則根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸接頭。例如，參見上文Sambrook(2001)和上文Bennett等(1991)。另外，可以使用本領(lǐng)域熟知的已知重組技術(shù)構(gòu)建載體。已知方法可以用來獲得具有一個或多個失活基因的真菌宿主細(xì)胞，如美國專利號5，246，853;美國專利號5，475，101和WO92/06209中披露?；蚴Щ羁梢酝ㄟ^完全或部分缺失、通過插入失活或通過使得基因無法為其預(yù)定目的發(fā)揮作用的任意其他方法實現(xiàn)，從而阻止該基因表達(dá)功能性蛋白質(zhì)?？梢匀笔б呀?jīng)克隆的來自木霉屬或其他絲狀真菌宿主的任意基因，例如，cbhl、cbh2、egll和egl2基因。在一些實施方案中，基因缺失可以通過將待失活的目的基因的一種形式借助本領(lǐng)域已知的方法插入質(zhì)粒而完成。該缺失質(zhì)粒隨后在目的基因編碼區(qū)內(nèi)部的適宜限制性酶位點(diǎn)處進(jìn)行切割，并且將基因編碼序列或其部分替代為選擇標(biāo)記。來自待缺失基因的基因座的側(cè)翼DNA序列(例約0.5至2.0kb之間)仍留在標(biāo)記基因的任意一側(cè)。適宜的缺失質(zhì)粒通常會具有單一限制性酶位點(diǎn)，其中所述限制性酶位點(diǎn)能夠?qū)⒑兴鋈笔Щ虻钠?包括側(cè)翼DNA序列和選擇標(biāo)記基因)作為單一線性段除去。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和培養(yǎng)DNA構(gòu)建體或栽體導(dǎo)入宿主細(xì)胞包括技術(shù)，如轉(zhuǎn)化；電穿孔；核內(nèi)微量注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染(例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)；與磷酸鉤DNA沉淀物孵育；DNA涂敷微粒的高速轟擊；和原生質(zhì)體融合。一般轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，參見上文Ausubel等(1987)，第9章；上文Sambrook等(2001)和Campbell等，Curr.GeneU6:53-56(1989)。木霉中異源蛋白質(zhì)的表達(dá)例如在美國專利號6,022,725;美國專利號6,268,328;Harkki等，EnzymeMicrob.Technol.13:227-233(1991);Harkki等，BioTechnol。7:596-603(1989);EP244,234;EP215,594;以及在Leong與Berka編輯的MOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY中第129-148頁Nevalainen等，"木霉的分子生物學(xué)和其表達(dá)同源和異源基因的用途"，MarcelDekkerInc.,NewYork(1992)中描述。對于曲霉菌林轉(zhuǎn)化，還參考Cao等，Science9:991-1001(2000)。在一個實施方案中，用其中編碼TrAA或其變體的核酸穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞染色體的載體系統(tǒng)構(gòu)建遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體隨后通過已知技術(shù)純化。在一個非限制性實例中，包括tf/^/S標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化滑、而不是粗糙外形的環(huán)狀菌落。此外，在一些情況下如下進(jìn)行又一個穩(wěn)定性試驗，即通過在固體非選擇性培養(yǎng)基(例如缺少乙酰胺的培養(yǎng)基)上培育所述轉(zhuǎn)化體，從這種培養(yǎng)基收獲孢子并隨后確定在含有乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長的這些孢子的百分?jǐn)?shù)。本領(lǐng)域已知的其他方法可以用來選擇轉(zhuǎn)化體。在一個具體實施方案中，制備用于轉(zhuǎn)化的木霉包括從真菌菌絲體制備原生質(zhì)體。參見Campbell等，Curr.Genet.16:53-56(1989)。在一些實施方案中，菌絲體從萌發(fā)的無性孢子獲得。所述菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶處理，從而產(chǎn)生原生質(zhì)體。原生質(zhì)體因懸浮介質(zhì)中存在滲透穩(wěn)定劑受到保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂等。通常，這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M和1.2M之間變動，例如可以在該懸浮介質(zhì)中使用1.2M山梨醇溶液。宿主木霉菌林?jǐn)z入DNA依賴于鈣離子濃度。通常，在攝取溶液中使用約10-50mM之間的CaCl2。額外的合適化合物包括緩沖系統(tǒng)，如TE緩沖液(10mMTris，pH7.4;1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0和聚乙二醇。認(rèn)為聚乙二醇使細(xì)胞膜融合，因而使介質(zhì)的內(nèi)容物送遞至木霉菌林的細(xì)胞漿。這種融合往往引起多個拷貝的質(zhì)粒DNA整合至宿主染色體。通常，木霉的轉(zhuǎn)化使用已經(jīng)進(jìn)行透化處理的原生質(zhì)體或細(xì)胞，一般以105至1()7個/mL的密度，尤其是2xl()6個/mL。將適宜溶液(例如，1.2M山梨醇和50mMCaCl2)中的體積100jiL的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞與目的DNA混合。通常，將高濃度的PEG添加至所述攝取溶液。0.1至1體積的25%PEG4000可以添加至原生質(zhì)體懸液；然而，添加約0.25體積至該原生質(zhì)體懸液是有用的。添加劑，如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀等也可以添加至該攝取溶液以促進(jìn)轉(zhuǎn)化。類似方法可用于其他真菌宿主細(xì)胞。例如，參見美國專利號6，022，725和6,268,328，兩者均通過引用方式并入本文作為參考。通常，該混合物隨后在大約0。C孵育10至30分鐘時間。隨后將另外的PEG添加至該混合物以進(jìn)一步增強(qiáng)目的基因或DNA序列的攝取。通常以5至15倍于轉(zhuǎn)化混合物體積的體積添加25%PEG4000;然而，更大和更小的體積可以是適合的。25%PEG4000—般約10倍于轉(zhuǎn)化混合物的體積。在添加PEG后，轉(zhuǎn)化混合物在室溫或在冰上孵育，隨后添加山梨醇和CaCl2溶液。該原生質(zhì)體懸液隨后又添加至熔化的等分量生長培養(yǎng)基。這種生長培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化體生長。通常，細(xì)胞在含有生理鹽和營養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，參見Pourquie等，BIOCHEMISTRYANDGENETICSOFCELLULOSEDEGRADATION,Aubert等編輯，AcademicPress(1988),第71-86頁；和Ilmen等，Appl.Environ.Microbiol.63:1298-1306(1997)。常見商業(yè)制備的培養(yǎng)基例如酵母麥芽提取物(YM)肉湯、LuriaBertani(LB)肉湯或Sabouraud葡萄糖(SD)肉湯也是適合的。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件是適合的，例如，培養(yǎng)物在大約28。C在適宜的培養(yǎng)基中于搖動培養(yǎng)箱或發(fā)酵罐內(nèi)溫育直至實現(xiàn)所需水平的TrAA或其變體表達(dá)。對于給定絲狀真菌的優(yōu)選培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的并且例如可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和真菌遺傳學(xué)貯藏中心(FGSC)獲得。在已經(jīng)建立真菌生長后，使細(xì)胞暴露于有效引起或允許TrAA或其變體表達(dá)的條件。3.4.TrAA活性的鑒定為評價宿主細(xì)胞中TrAA或其變體的表達(dá)，測定法可以測量表達(dá)的蛋白質(zhì)、相應(yīng)的mRNA或生麥芽糖a-淀粉酶活性。例如，合適的測定法包括RNA印跡法和DNA印跡法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合i^反應(yīng))和使用適宜標(biāo)記的雜交探針的原位雜交。合適的測定法也包括測量樣品中的TrAA活性，例如通過直接測量培養(yǎng)基中還原糖如葡萄糖的測定法。例如，葡萄糖濃度可以使用葡萄糖試劑盒No.l5-UV(SigmaChemicalCo.)或儀器如Technicon自動分析儀確定。葡糖淀粉酶活性可以通過3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測試。見Goto等，Biosci.BiotechnolBiochem.58:49-54(1994)。通常，由木霉屬或曲霉屬宿主表達(dá)的TrAA在培養(yǎng)基中具有大于每升l克蛋白質(zhì)(g/L)、大于2g/L、大于5g/L、大于10g/L、大于20g/L或大于25g/L的濃度。在一個實施方案中，由木霉屬或曲霉屬宿主表達(dá)的TrAA或其變體是糖基化的，即，該TrAA或其變體包含糖基部分。在一個特別合適的實施方案中，糖基化模式與野生型TrAA中存在的糖基化模式相同。3.5.用于純化TrAA的方法通常而言，細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的TrAA或其變體被分泌至培養(yǎng)基并且可以進(jìn)行純化或分離，例如，通過除去來自細(xì)胞培養(yǎng)基的不想要的組分。在一些情況下，TrAA或其變體可以從細(xì)胞裂解液回收。在這類情況下，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員例行使用的技術(shù)，從產(chǎn)生酶的細(xì)胞中純化該酶。實例包括但不限于親和層析法、離子交換層析法(包括高分辯率離子交換)、疏水相互作用層析法、雙相分配法、乙醇沉淀法、反相HPLC、在二氧化硅或陽離子交換樹脂(例如DEAE)上的層析法、聚焦層析法、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀法和^吏用例如S印hadexG-75的凝膠過濾法。發(fā)酵在一些實施方案中，表達(dá)TrAA或其變體的真菌細(xì)胞在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下培育。經(jīng)典的分批發(fā)酵是一個封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組分在發(fā)酵伊始:&定并且在發(fā)酵期間不作更改。在發(fā)酵開始時，用所需生物接種培養(yǎng)基。在該方法中，允許發(fā)酵進(jìn)行而不添加任何組分至該系統(tǒng)。一般，分批發(fā)酵就碳源添加而言視為一個"批次"，并且往往嘗試控制下述因素，如pH和氧濃度。該分批系統(tǒng)的代謝物和生物質(zhì)組成經(jīng)常變化直至停止發(fā)酵之26時。在分批培養(yǎng)物中，細(xì)胞從靜止滯后期推進(jìn)至高速生長對數(shù)期并最終至穩(wěn)定期，在穩(wěn)定期生長速率下降或停頓。若不處理，穩(wěn)定期中的細(xì)胞最終死亡。通常而言，在對數(shù)期的細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)物的大量產(chǎn)生。對所述標(biāo)準(zhǔn)分批培養(yǎng)系統(tǒng)的一種合適變化是"補(bǔ)料分批發(fā)酵"系統(tǒng)。在典型分批培養(yǎng)系統(tǒng)的這種變化中，！^酵進(jìn)行而增量地添加底物。當(dāng)分解代謝物阻抑可能抑制細(xì)胞代謝時和當(dāng)希望在培養(yǎng)基中具有有限量的底物時，補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)是有用的。測量補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)中的實際底物濃度是困難的，并且因而基于可度量因素如pH、溶解氧和廢氣如C02的分壓進(jìn)行估計。分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵是本領(lǐng)域常見且熟知的。連續(xù)發(fā)酵是一種開放系統(tǒng)，其中連續(xù)地添加定義的發(fā)酵培養(yǎng)基至生物反應(yīng)器并且同時取出等量的條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵通常使培養(yǎng)物保持在其中細(xì)胞主要處于對數(shù)期生長的恒定高密度。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)整影響細(xì)胞生長和/或產(chǎn)物濃度的一個或多個因素。例如，在一個實施方案中，將限制性營養(yǎng)物如碳源或氮源保持在固定速率上并且允許調(diào)節(jié)全部其他參數(shù)。在其他系統(tǒng)中，可以連續(xù)地變更影響生長的眾多因素，同時通過培養(yǎng)基濁度測量的細(xì)胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)盡力保持穩(wěn)定狀態(tài)生長條件。行平衡。調(diào)節(jié)營養(yǎng)物和生長因素用于連續(xù)發(fā)酵工藝的方法以及使產(chǎn)物形成率最大化的技術(shù)是工業(yè)微生物領(lǐng)域已知的。4.TrAA和其變體的組合物和用途通過上述方法產(chǎn)生和純化的TrAA和其變體用于多種工業(yè)用途。在一個實施方案中，TrAA和其變體用于淀粉轉(zhuǎn)化工藝中，尤其用于已經(jīng)發(fā)生液化的淀粉的糖化工藝。所需的終產(chǎn)物可以是可通過淀粉底物的酶轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生的任意產(chǎn)物。例如，所需產(chǎn)物可以是富含麥芽糖的糖漿，其可以用在其他工藝中，如HFCS的制備中。備選地，該產(chǎn)物可以是富含葡萄糖的糖漿，例如所迷的富含葡萄糖的糖漿可以直接用作結(jié)晶葡萄糖的來源或可以轉(zhuǎn)化成眾多的其他有用產(chǎn)物，如抗壞血酸中間體(例如葡糖酸；2-酮基-L-古洛糖酸；5-酮基-葡糖酸和2，5-二酮基葡糖酸)；1，3-丙二醇；芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有機(jī)酸(例如乳酸、丙酮酸、琥珀酸、異檸檬酸和草酰乙酸)；氨基酸(例如絲氨酸和甘氨酸)；抗生素；酶；維生素和激素。在又一個實施方案中，所述淀粉轉(zhuǎn)化工藝可以在設(shè)計旨在產(chǎn)生燃料用或飲料用醇(即飲用醇)的發(fā)酵工藝之前或同時進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以在產(chǎn)生這些終產(chǎn)物中使用的多種發(fā)酵條件。TrAA和其變體也用在制備食物的組合物和方法中。TrAA和其變體的這些不同用途在下文更詳細(xì)地描述。淀粉底物的制備本領(lǐng)域普通技術(shù)人員十分清楚可以用來制備淀粉底物的可用方法，以用在本文所披露的方法中。例如，有用的淀粉底物可以從塊莖、根、莖、豆科植物、禾谷植物或完整谷粒獲得。更具體地，顆粒淀粉可以從玉米、玉米穗、小麥、大麥、黑麥、谷子、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、稻、豌豆、菜豆(bean)、香蕉或馬鈴薯獲得。玉米含有約60-68%淀粉；大麥含有約55-65%淀粉;谷子含有約75-80%淀粉；小麥含有約60-65%淀粉;并且精米含有70-72%淀粉。特別構(gòu)思的淀粉底物是玉米淀粉和小麥淀粉。來自谷粒的淀粉可以是研磨或完整的，并且包括玉米固形物，如谷粒(kernd)、糠麩和/或玉米穗。該淀粉可以是高度精制的生淀粉或來自淀粉精制工藝的原料。多種淀粉可商業(yè)地獲得。例如，玉米淀粉可從Cerestar、Sigma和KatayamaChemicalIndustryCo.(日本)獲得；小麥淀粉可從Sigma獲得；甘薯淀粉可從WakoPureChemicalIndustryCo.(日本)獲得；并且馬鈴薯淀粉可從NakaariChemicalPharmaceuticalCo.(日本)獲得。淀粉底物可以是來自研磨完整谷粒的粗制淀粉，其含有非淀粉部分，例如，胚芽渣(germresidues)和纖維。研磨可以包括濕法研磨或干法研磨。在濕法研磨中，將完整谷粒浸泡在水或稀酸中以將谷粒分解成組成部分，如淀粉、蛋白質(zhì)、胚芽、油、谷粒纖維。濕法研磨高效地分離胚芽和粗粉(即淀粉顆粒和蛋白質(zhì))并且尤其適用于生產(chǎn)糖漿。在干法研磨中，將完整谷粒研磨成細(xì)粉并在不篩分該谷粒的情況下加工成其組成部分。因此除淀粉之28外，干法研磨的谷粒還包含顯著量的非淀粉碳水化合物。大部分乙醇來自干法研磨。備選地，待加工的淀粉可以是高度精制的淀粉純度(starchquality),例如，純度至少90%、至少95%、至少97%或至少99.5%。淀粉的糊化和液化如本文中所用，術(shù)語"液化"或"使液化"意指淀粉借以轉(zhuǎn)化成粘度較低及鏈更短的糊精的工藝。通常，這個工藝包括淀粉的糊化，同時或隨后添加a-淀粉酶，盡管任選地可以添加額外的誘導(dǎo)液化的酶。在一些實施方案中，如上述制備的淀粉底物與水混合成漿。該淀粉漿液可以含有干燥固體重量百分?jǐn)?shù)約10-55%、約20-45%、約30-45%、約30-40%或約30-35%的淀粉。例如，a-淀粉酶(EC3.2.1.1)可以用計量泵添加至該漿液。一般用于本申請的a-淀粉酶是熱穩(wěn)定的細(xì)菌a-淀粉酶，如地衣芽孢桿菌a-淀粉酶。例如，通常以每千克淀粉干物質(zhì)約1500單位供應(yīng)該a-淀粉酶。為優(yōu)化a-淀粉酶的穩(wěn)定性和活性，將該漿液的pH調(diào)節(jié)至約pH5.5-6.5并且一般添加約lmM釣(約40ppm游離鉤離子)。其他a-淀粉酶可能需要不同條件?？梢酝ㄟ^在后續(xù)反應(yīng)步驟中降低pH或從漿液中除去釣使液化后漿液中殘留的細(xì)菌a-淀粉酶失活?？梢詫⒌矸蹪{液及所述a-淀粉酶連續(xù)地泵過由蒸汽加熱至105°C的噴射式蒸煮鍋。糊化在這些條件下迅速發(fā)生，并且酶活性連同相當(dāng)大剪切力開始水解淀粉底物。在噴射式蒸煮鍋中的停留時間極短暫。部分糊化的淀粉可以送入一系列保持在100-105。C的容納管并維持5分鐘以完成糊化工藝。在收集槽中在90-100V:或更高溫度上持續(xù)約1至2小時完成了成為所需DE的水解。這些收集槽可以含有折流板以防止回流混合。如本文中所用，術(shù)語"次級液化"指初級液化(加熱至卯-100。C)后的液化步驟，此時^f吏所述漿液冷卻至室溫。該冷卻步驟可以是30分鐘至180分鐘，例如90分鐘至120分鐘。如本文中所用，術(shù)語"次級液化的分鐘"指從開始次級液化至測量葡萄糖當(dāng)量(DE)時刻止消逝的時間。從上述工藝產(chǎn)生的液化淀粉一般含有約98。/。的^J瞎和約2%的麥芽糖及0.3%的D-葡萄糖。此液化淀粉一般處于具有約10-50%ds;約10-45%;約15-40%;約20-40%;約25-40%;或約25-35%ds的漿液形式。糖化葡萄糖糖漿或麥芽糖糖漿的產(chǎn)生使用TrAA和其變體，任選在另外的酶存在下，此液化淀粉可以糖化成葡萄糖糖漿或麥芽糖糖漿。糖化的產(chǎn)物的精確組成取決于所用的酶組合，以及所加工的顆粒淀粉類型。有利地，使用所提供的TrAA和其變體可獲得的葡萄糖糖漿可以含有約96%w/w的D-葡萄糖。目前在任意糖化條件組合下可獲得的葡萄糖的最大量是約95-97%。該葡萄糖糖漿可以在濃縮后直接用于產(chǎn)生高果糖糖漿或用于產(chǎn)生結(jié)晶葡萄糖。同樣有利地，使用所提供的TrAA和其變體可獲得的麥芽糖糖漿可以含有超過60%w/w的麥芽糖。通常而言，TrAA或其變體將以每公噸干燥固體約0.01-1kg酶的量添加至顆粒淀粉底物的漿液。在一些實施方案中，以0.1-5kg/mtds或0.3-1kg/mtds或者以約0.5kg/mtds添加TrAA或其變體。TrAA或其變體的比活性可以是約10,000-80,000SKBU/g酶或約15,000-60,000SKBU/g或約15,000-30,000SKBU/g。TrAA或其變體可以以純化酶的形式添加至漿液。備選地，TrAA或其變體可以作為分離酶的溶液添加。在一個實施方案中，TrAA或其變體以細(xì)胞提取物的形式添加，其中所述的細(xì)胞提取物從表達(dá)該TrAA或其變體的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。在另一個實施方案中，TrAA或變體以宿主細(xì)胞的形式添加，其中所述的宿主細(xì)胞表達(dá)TrAA或其變體并將其分泌至反應(yīng)介質(zhì)中，從而將酶持續(xù)地提供至反應(yīng)。在這個實施方案中，表達(dá)TrAA或其變體的宿主細(xì)胞也可以表達(dá)除TrAA或其變體之外用來催化糖化的另一種酶。例如，宿主細(xì)胞(例如里氏木霉或黑曲霉)可以經(jīng)工程化以共表達(dá)TrAA或其變體以及葡糖淀粉酶，例如TrGA或HgGA。在一個實施方案中，該宿主細(xì)胞^Li^因修飾，從而不表達(dá)宿主細(xì)胞內(nèi)源性葡糖淀粉酶。葡萄糖糖漿在一個方面，TrAA和其變體用在產(chǎn)生富含葡萄糖的糖漿的糖化工藝中。為產(chǎn)生葡萄糖糖漿，TrAA或其變體一般隨葡糖淀粉酶(EC3.2丄3)(例30如AMGTM葡糖淀粉酶)一起添加。如表l、圖1中所示并且在下文實施例中所討論，在葡糖淀粉酶存在下受TrAA或其變體催化的糖化工藝可以產(chǎn)生接近或超過97。/。的葡萄糖濃度。有利地，最大葡萄糖濃度可以在比該反應(yīng)僅用葡糖淀粉,化時的更少時間中實現(xiàn)。在一個實施方案中，最大葡萄糖濃度在12小時、24小時或36小時中實現(xiàn)。見實施例中的表2和相關(guān)文字。特別有利地，TrAA和其變體抑制從葡萄糖至麥芽低聚糖的逆反應(yīng)，從而使所述最大葡萄糖濃度保持比常規(guī)糖化工藝中更長的時間。見表2。在一些實施方案中，所述最大葡萄糖濃度在達(dá)到該最大濃度后保持約12小時或約24小時。一種示例性葡糖淀粉酶是具有優(yōu)異比活性和熱穩(wěn)定性的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)和其變體。見美國7>開申請?zhí)?006/0094080、2007/0004018和2007/0015266(GenencorInternational,Inc.)。TrGA的合適變體包括具有葡糖淀粉酶活性和與野生型TrGA具有至少80%、至少卯％或至少95%序列同一性的那些變體。TrAA和其變體有利地提高在受TrGA催化的糖化工藝中所產(chǎn)生的葡萄糖的產(chǎn)率。當(dāng)不添加TrAA或其變體，TrGA—般在pH4,3產(chǎn)生含約88。/。葡萄糖的溶液；然而，當(dāng)添加TrAA或其變體至該反應(yīng)時，TrAA和TrGA的混合物大量產(chǎn)生具有更高(例如94%)葡萄糖濃度的溶液。備選地，該葡糖淀粉酶可以是從植物、真菌或細(xì)菌衍生的另一種葡糖淀粉酶。例如，所述葡糖淀粉酶可以是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶或其變體(例如，Boel等，EMBOJ.3:1097-1102(1984)、WO92/00381和WO00/04136(NovoNordiskA/S))和泡盛曲霉葡糖淀粉酶(例如，WO84/02921(CetusCorp.))。構(gòu)思的其他曲霉屬葡糖淀粉酶包括具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的變體，例如，G137A和G139A(Chen等，Prot.Eng.9:499-505(1996));D257E和D293E/Q(Chen等，Prot.Eng.8:575-582(1995));N182(Chen等，Biochem.J.301:275-281(1994));A246C(Fierobe等，Biochemistry,35:8698-8704(1996));和在位置A435和S436中具有Pro殘基的變體(Li等，ProteinEng.10:1199-1204(1997))。構(gòu)思的其他葡糖淀粉酶包括籃狀菌屬(rfl/flfWMj;"s)葡糖淀粉酶，尤其從埃默森籃狀菌(7:e附erw附7)(例如，WO99/28448(NovoNordiskA/S)、7./^cWtow附(例如，美國專利號RE32，153(CPCInternational,Inc.))、r.f/w/wwri或嗜熱籃狀菌(r.幼e/7m^/^7附)(例如，美國專利號4，587，215)衍生。構(gòu)思的細(xì)菌葡糖淀粉酶包括來自梭菌屬(Cfo拚認(rèn)"附)、尤其解淀粉熱梭菌(C.,/^r附ofl附j(luò);/o(^/c"附)(例如，EP135，138(CPCInternational,Inc.)和熱石克化氫梭菌(C.例如，WO86/01831(MichiganBiotechnologyInstitute))的葡糖淀粉酶。合適的葡糖淀粉酶包括從米曲霉衍生的葡糖淀粉酶，如與WO00/04136(NovoNordiskA/S)的SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列具有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或甚至卯％同源性的葡糖淀粉酶。商業(yè)化葡糖淀粉酶也是合適的，如AMG200L;AMG300L;SANSUPER和AMGTME(來自Novozymes);OPTIDEX300(來自GenencorInternational,Inc.);AMIGASE預(yù)和AMIGASETMPLUS(來自DSM);G-ZYMEG900(來自EnzymeBio-Systems)和G-ZYMEG990ZR(低蛋白酶含量的黑曲霉葡糖淀粉酶)。葡糖淀粉酶一般以0.02-2.0GAU/gds或0.1-1.0GAU/gds(例如0.2GAU/gds)的量添力口?？梢耘cTrAA或其變體使用的其他合適酶包括脫支酶，如異淀粉酶(EC3.2.1.68)。脫支酶可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的有效量添加。支鏈淀粉酶(EC3.2丄41)例如Promozyme⑧也是合適的。一般以100U/kgds添加支鏈淀粉酶。其他合適的酶包括蛋白酶，如真菌蛋白酶和細(xì)菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括從曲霉屬如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉屬(Mucor)(例如，米赫毛霉(M.附/e虹/))和根霉屬(i^/^/ms)獲得的那些真菌蛋白酶。其他合適的酶包4舌但不限于纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶和角質(zhì)酶。液化通常以連續(xù)工藝進(jìn)行，而糖化往往以分批工藝進(jìn)行。糖化一般在約60。C溫度和pH約4.0-4.5(例如pH4.3)最有效，這需要冷卻液化淀粉并調(diào)節(jié)其pH。糖化可以例如在約40。C、約50。C或約55°C至約60。C之間的溫度進(jìn)行。糖化通常在攪拌罐內(nèi)進(jìn)行，這可能花費(fèi)幾小時以填充罐或倒空罐。酶一般在攪拌罐灌滿時以相對于干燥固體的固定比率添加或在灌充階段開始時以單劑量添加。產(chǎn)生葡萄糖糖漿的糖化反應(yīng)一般運(yùn)行約24-72小時或24-28小時或尤其是24或更少的小時，例如20-21小時。當(dāng)已經(jīng)達(dá)到最大DE時，例如通過加熱至85。C持續(xù)5分鐘終止該反應(yīng)。進(jìn)一步孵育將產(chǎn)生較低的DE，最終至約卯DE，原因在于積累的葡萄糖以熱動力平衡方式再聚合成異麥芽糖。作為總?cè)芙馇г锕腆w的百分?jǐn)?shù)，葡萄糖的終產(chǎn)率可以是至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、970/0或98%。在一個實施方案中，在連續(xù)工藝中產(chǎn)生葡萄糖，并且基本上全部葡萄糖用來產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。4.3.2.麥芽糖糖漿在另一方面，TrAA或其變體在產(chǎn)生高麥芽糖糖漿的工藝中使用。在TrAA和其變體提供的優(yōu)勢當(dāng)中包括能夠在相對低的pH使用TrAA和其變體。在圖2中描述了用于產(chǎn)生麥芽糖(DP2)的TrAA的代表性的pH依賴性。因為糖化一般在酸性條件下升高的溫度，例如60。C，pH4,3進(jìn)行，所以TrAA或其變體在這些條件下的高活性有利地允許在對糖化中所用的其他酶(如葡糖淀粉酶)為最佳的條件下使用TrAA或其變體。用TrAA或其變體產(chǎn)生的高麥芽糖糖漿具有有利的特性。使用TrAA或其變體實現(xiàn)的麥芽糖濃度可比于或高于用常規(guī)生麥芽糖酶如BBA或真菌a-淀粉酶-澄解酶⑧L所實現(xiàn)的麥芽糖濃度。見表3和表4以及圖2。在一個實施方案中，麥芽糖的濃度達(dá)到約50%至約62%的干燥固體百分?jǐn)?shù)。在另一個實施方案中，麥芽糖的濃度達(dá)到約55%、約60%或約61%至約62%。此外，使用TrAA獲得的高麥芽糖糖漿可以含有濃度約8-9%的葡萄糖，而在可比較條件下(例如使用澄解酶⑧L)產(chǎn)生的常規(guī)高麥芽糖糖漿一般具有約4-5%的葡萄糖濃度。見表3。相對高的葡萄糖產(chǎn)率有利地導(dǎo)致利用TrAA或其變體產(chǎn)生的高麥芽糖糖漿比利用常規(guī)酶產(chǎn)生的高麥芽糖糖漿更甜。TrAA或其變體可以在至少一種其他酶存在下由自身催化高麥芽糖糖漿的產(chǎn)生。與TrAA或其變體使用的特別合適的酶是支鏈淀粉酶。支鏈淀33粉酶的添加顯著提高麥芽糖的產(chǎn)率，如表5和圖3中所示。添加的支鏈淀粉酶量可以是約0.1kg/mtds、約0.25kg/mtds或約0.5kg/mtds。在一個實施方案中，添加所述量的支鏈淀粉酶以使該反應(yīng)中所產(chǎn)生的麥芽糖增加最多。表5中的數(shù)據(jù)表明在下文實施例中附表5的文本中所指出的用來產(chǎn)生麥芽糖的特定條件下，當(dāng)支鏈淀粉酶的濃度是約0.25kg/mtds時，所述支鏈淀粉酶對麥芽糖形成的影響最大。適于與TrAA或其變體使用的其他酶包括細(xì)菌p-淀粉酶(例如BBA)、其他真菌a-淀粉酶(例如澄解酶⑧L)或葡糖淀粉酶。其他合適的酶包括蛋白酶，如真菌蛋白酶和細(xì)菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括從曲霉屬如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉屬如米赫毛霉；和根霉屬獲得的那些真菌蛋白酶。其他合適的酶包括但不限于纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、異淀粉酶和角質(zhì)酶。P-淀粉酶(EC3.2.1.2)是外切作用生麥芽糖淀粉酶，其催化1，4-a-糖苷鍵水解成支鏈淀粉和相關(guān)葡萄糖聚合物，因而釋放麥芽糖，P-淀粉酶已經(jīng)從多種植物和微生物分離。參見Fogarty等PROGRESSININDUSTRIALMICROBIOLOGY,第15巻，第112-115頁(1979)。這些卩-淀粉酶具有范圍從40°C至65。C的最適溫度和范圍從約4，5至約7.0的最適pH。構(gòu)思的P-淀粉酶包括但不限于來自大麥的P-淀粉酶SpezymeBBA1500、SpezymeDBA,Optima,ME、Optima,BBA(Ge醒corInternational,Inc.);和NovozymTMWBA(NovozymesA/S)。HFCS生產(chǎn)和發(fā)酵在一個實施方案中，用TrAA、其變體或包含TrAA或其變體的酶摻合物處理所產(chǎn)生的可溶性淀粉水解產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化成基于高果糖淀粉的糖漿(HFSS),如高果糖的玉米糖漿(HFCS)。這種轉(zhuǎn)化可以使用葡萄糖異構(gòu)酶、尤其固定在固體支持物上的葡萄糖異構(gòu)酶實現(xiàn)。將pH提高至約6.0至約8.0例如pH7.5，并且通過離子交換除去Ca2+。合適的異構(gòu)酶包括Sweetzyme、IT(NovozymesA/S);G-zymeIMGI和G-zymeG993、Ketomax、G-zymeG993、G-zymeG993液體和GenSweetIGI。異構(gòu)化之后，該混合物一般含有約40-45%的果糖，例如42%的果糖。在另一個實施方案中，所述可溶性淀粉水解產(chǎn)物，尤其富含葡萄糖的糖漿，通過所述水解產(chǎn)物與發(fā)酵生物一般在約32°C溫度，如30°C至35。C接觸進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醇、檸檬酸、谷氨酸單鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸4丐、葡糖酸鉀、葡萄糖酸-5-內(nèi)酯和異抗壞血酸鈉。糖化和發(fā)酵工藝可以以同時糖化和發(fā)酵(SSF)工藝進(jìn)行。發(fā)酵任選地可以包括乙醇的后續(xù)純化和回收。在發(fā)酵期間，肉湯或"啤酒(beer)"的乙醇含量可以達(dá)到至少約8%、至少約12%或約16%乙醇?？梢詫⒃撊鉁麴s以產(chǎn)生富集(例如純度96%)的乙醇溶液。此外，由發(fā)酵產(chǎn)生的C02可以用C02滌氣器收集、壓縮并銷售用于其他用途，例如碳酸々欠料或干冰生產(chǎn)。來自發(fā)酵工藝的固體廢棄物可以作為富含蛋白質(zhì)的產(chǎn)品(例如家畜飼料)使用。產(chǎn)乙醇微生物包括表達(dá)醇脫氬酶和丙酮酸脫羧酶的酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和細(xì)菌(例如，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis))。在一些實施方案中，該產(chǎn)乙醇微生物表達(dá)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，為使木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的酶。酵母的商業(yè)來源包括REDSTAR(RedStar);FERMIOL(DSMSpecialties)和SUPERSTART(Alltech)。在一個實施方案中，表達(dá)異源性葡糖淀粉酶和/或TrAA或其變體的真菌細(xì)胞在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下培育。經(jīng)典的分批發(fā)酵是一個封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組分在發(fā)酵伊始設(shè)定。也就是說，允許發(fā)酵進(jìn)行而不添加任何組分至該系統(tǒng)。在分批培養(yǎng)物中，細(xì)胞從靜止滯后期推進(jìn)至高速生長對數(shù)期并最終至穩(wěn)定期，在穩(wěn)定期生長速率下降或停頓。通常，在對數(shù)期的細(xì)胞負(fù)責(zé)葡糖淀粉酶和/或TrAA或其變體的大量異源性產(chǎn)生。該工藝的一種變化是"補(bǔ)料分批發(fā)酵，，系統(tǒng)，其中隨發(fā)酵進(jìn)行而增量地添加底物。當(dāng)分解代謝物阻抑可能抑制細(xì)胞代謝時和當(dāng)希望在培養(yǎng)基中具有有限量的底物時，補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)是有用的。通過可度量因素如pH、溶解氧和廢氣如co2的分壓的變化來估計補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)中的實際底物濃度。分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵是本領(lǐng)域常見且熟知的。連續(xù)發(fā)酵是一種開放系統(tǒng)，其中連續(xù)地添加定義的發(fā)酵培養(yǎng)基至生物35反應(yīng)器并且同時取出等量的條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵通常使培養(yǎng)物保持在其中細(xì)胞主要處于對數(shù)期生長的恒定高密度。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)整細(xì)胞生長和/或產(chǎn)物濃度。例如，在一個實施方案中，將限制性營養(yǎng)物如碳源或氮源保持在固定速率上并且允許調(diào)節(jié)全部其他參數(shù)。因為生長維持在穩(wěn)定狀態(tài)上，所以因抽取培養(yǎng)基所致的細(xì)胞損失應(yīng)當(dāng)針對該發(fā)酵中的細(xì)胞生長速率進(jìn)行平衡。優(yōu)化連續(xù)發(fā)酵工藝和使產(chǎn)物形成率最大化的方法是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域熟知的。用于烘烤和食品制備的組合物和方法對于面粉用于烘烤和食物生產(chǎn)的商業(yè)和家庭用途而言，重要的是維持面粉中適宜水平的a-淀粉酶活性。過高的活性水平可以產(chǎn)生粘稠和/或夾生并且因而不可銷售的產(chǎn)品。a-淀粉酶活性不足的面粉可能不含有對于適度酵母功能而言足夠的糖，從而產(chǎn)生干燥、多屑的面包或烘烤產(chǎn)品。因此，可以將單獨(dú)或與另一種a-淀粉酶組合的TrAA或其變體添加至面粉以增強(qiáng)面粉中的內(nèi)源性a-淀粉酶活性水平。所述TrAA或其變體在該實施方案中可以在淀粉存在下具有例如30-90。C，40-80。C，40-50。C，45-65。C或50-60。C范圍的最適溫度。1。/?？扇苄缘矸廴芤褐械淖钸mpH可以例如在pH4.5至6之間。谷物如大麥、燕麥、小麥以及植物組分如玉米、酒花和稻也用于釀造，即工業(yè)釀造和家庭釀造。釀造中所用的組分可以是非麥芽化(unmalted)或可以是麥芽化的(malted)，即部分萌發(fā)的，導(dǎo)致酶(包括a-淀粉酶)的水平提高。為成功釀造，需要有足夠水平的a-淀粉酶活性以確保適宜水平的糖用于發(fā)酵。因此，可以將單獨(dú)或與另一種a-淀粉酶組合的TrAA或其變體添加至用于釀造的組分中。如本文中所用，術(shù)語"面粉"意指磨制或研磨的谷粒。術(shù)語"面粉"還可以意指已經(jīng)被碾碎或搗碎的西米或塊莖產(chǎn)物。在一些實施方案中，面粉也可以含有除研磨或搗碎的谷物或植物物質(zhì)之外的組分。盡管不意圖是限制性的，額外組分的實例是膨脹劑。谷粒包括小麥、燕麥、黑麥和大麥。塊莖產(chǎn)物包括木薯面粉、木薯粉和蛋糕粉。術(shù)語"面粉，，也包括碎玉米粉、玉米粉(maize-meal)、稻粉、全麥粉、自發(fā)粉、木薯面粉、木薯粉、碎稻、富強(qiáng)粉和蛋糕粉。如本文中所用，術(shù)語"原料(stock)"意指被碾碎或破碎的谷粒和植物組分。例如，用于啤酒生產(chǎn)中的大麥?zhǔn)且呀?jīng)被粗略研磨或碾碎以產(chǎn)生適于生產(chǎn)發(fā)酵用漿的稠度的谷物。如本文中所用，術(shù)語"原料，，包括處于碾碎或粗磨形式的任意前述類型的植物和谷物。本文中所述的方法可以用來確定面粉或原料中的a-淀粉酶活性水平。TrAA或其變體也可以單獨(dú)或與其他淀粉酶組合添加以防止或遲滯老化，即烘烤產(chǎn)品的屑粒硬化。防老化的淀粉酶量一般將在每千克面粉0.01-10mg酶蛋白(例如0.5mg/kgds)的范圍內(nèi)?？梢耘cTrAA或其變體組合使用的額外防老化淀粉酶包括內(nèi)切淀粉酶(endo-amylase),例如來自芽孢桿菌屬的細(xì)菌內(nèi)切淀粉酶。所述額外的淀粉酶可以是另一種生麥芽糖a-淀粉酶(EC3.2.1.133),例如來自芽孢桿菌屬。Novamy鵬是來自嗜熱脂肪芽胞桿菌菌林NCIB11837的一種示例性生麥芽糖a-淀粉酶并且在Christophersen等，Starch50:39-45(1997)中描述。防老化內(nèi)切淀粉酶的其他實例包括從芽孢桿菌如地衣芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌衍生的細(xì)菌a-淀粉酶。所述防老化淀粉酶可以是外切淀粉酶，如P-淀粉酶，例如，來自植物來源，如大豆；或來自微生物來源，如芽孢桿菌。包含TrAA或其變體的烘烤用組合物還可以包含磷脂酶。所述磷脂酶可以具有A!或A2活性以從磷脂中除去脂肪酸，形成溶血磷脂。它可以具有或不具有脂肪酶活性，即對甘油三酯底物的活性。該磷脂酶一般具有30-90。C(例如30-70。C)范圍的最適溫度。添加的磷脂酶可以是動物來源的，例如來自胰腺(例如?；蜇i胰腺)、蛇毒或蜂毒。備選地，該磷脂酶可以源自微生物，例如來自絲狀真菌、酵母或細(xì)菌，如以下屬或種，曲霉屬，黑曲霉；網(wǎng)柄菌屬(/)&0^^//"附)、盤基網(wǎng)柄菌(Z).cfcco/fifeww);毛霉屬、爪唾毛霉(M^"vfl/i/c附)、高大毛霉(M:wwc^ifo)、細(xì)孢毛霉(M.sw6ft7&s/附附)；鏈孢霉屬(A^"r仍/7oni)、粗糙鏈孢霉(7V:cm^");根毛霉屬(/^Zw附M"小微小根毛霉(及./;"w7/"s);根霉屬(及/i&o/i肌)、少根根霉(及.fl/r/^附)、曰本37根霉(及.y"/w附cMS)、旬枝根霉(及.sto/ow(/J^);核盤菌屬CSc/^y^/m")、大豆核盤菌(51./幼erri朋")；毛癬菌屬(7Wd印^to")、紅色毛癬菌(r.ra6rww);維氏核盤菌屬(『&&^>1|7|)、核盤菌(『.sc/erw/c"附)；芽孢桿菌屬CBfld//"s)、相當(dāng)大芽孢桿菌(5.w"加en"附)、枯草芽孢桿菌(及s"M7/s);檸檬酸桿菌屬(Oo^c&r)、弗氏檸檬酸桿菌(C./""wrfi7);腸桿菌屬(￡>ife6""c)、產(chǎn)氣腸桿菌(JS".^rage"ey)、陰溝腸桿菌(Ec/o"cm);愛德華菌屬(jEWnwYfe,Wto)、遲緩愛德華菌(E似r甴)；歐文氏菌屬(￡^/>^/^&//")、草生歐文氏菌(五./^rWco/fl);埃西氏菌屬(fi^&Wc/h'a)、大腸桿菌；克雷伯氏菌屬(^/^:^//")、肺炎克雷伯氏菌(A;/7"e"附o"/tfe);變形桿菌屬(尸卬te"力、普通變形桿菌(尸.v"/gflW力；普羅威登斯菌屬(/VoviVfewcf'a)、斯氏普羅威登斯菌(戶.W做WiT);沙門氏菌屬(Salmonella)、鼠傷寒沙門氏菌(51.妙/r,附w/歸)；沙雷氏菌屬OSemi,/fl)、液化沙雷氏菌(51./'Xfls"e"力、粘質(zhì)沙雷氏菌(51./mifCMce附)；志賀氏菌屬(Shigella)、福氏志賀菌(S，y7d"^7〕；鏈霉菌屬(A"/7to柳j;cM)、紫紅鏈霉菌vzW"^m^r);耶爾森氏菌屬(y^w'm'")、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Kew^m^//rioi);鐮孢屬、尖鐮孢CF.o平戸謂)(菌抹DSM2672)。所述磷脂酶以改善焙烤后開始期間尤其頭24小時期間面包柔軟度的量添加。磷脂酶的量一般在每千克面粉0.01-10mg酶蛋白(例如0.1-5mg/kg)的范圍內(nèi)。也就是說，磷脂酶活性通常將在20-1000脂肪酶單位(LU)/kg面粉的范圍內(nèi)，其中脂肪酶單位定義為以阿拉伯膠作為乳化劑并且以三丁精作為底物，在30。C，pH7.0每分鐘釋放lpmol丁酸所需的酶量。面團(tuán)的組合物通常包含小麥全粉或小麥粉和/或其他類型的全粉、面粉或淀粉，如玉米粉、玉米淀粉、黑麥全粉、黑麥粉、燕麥粉、燕麥全粉、大豆粉、高粱全粉、高粱粉、馬鈴薯全粉、馬鈴薯粉或馬鈴薯淀粉。所述面團(tuán)可以是新鮮的、冷凍的或半烘烤的(par-baked)。面團(tuán)可以是膨松面團(tuán)或待進(jìn)行發(fā)酵的面團(tuán)。面團(tuán)可以以多種方式，如通過添加化學(xué)膨脹劑(例如碳酸氫鈉)或通過添加發(fā)酵劑，即發(fā)酵面團(tuán)進(jìn)行發(fā)酵。面團(tuán)也可以通過添加合適的酵母培養(yǎng)物如釀酒酵母(面包酵母)培養(yǎng)物，例如釀酒酵母市售菌抹進(jìn)行發(fā)酵。該面團(tuán)也可以包含其他常規(guī)面團(tuán)成分，例如蛋白質(zhì)，如乳粉、面筋和大豆；卵(例如，全蛋、卵黃或卵白)；氧化劑如抗壞血酸、溴酸鉀、碘酸鉀、偶氮二甲酰胺(ADA)或過硫酸銨；氨基酸如L-半胱氨酸；糖；或鹽，如氯化鈉、乙酸4丐、硫酸鈉或硫酸鈣。面團(tuán)還可以包含脂肪，例如甘油三酯，如顆粒脂肪或短鏈脂肪。面團(tuán)還可以包含乳化劑，如甘油單酯或甘油二酯、甘油單酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油單酯的乳酸酯、甘油單酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、或溶血卵磷脂。尤其，面團(tuán)可以在不添加乳化劑的情況下制作。任選地，額外的酶可以與所述防老化淀粉酶和磷脂酶一起使用。所述額外的酶可以是第二種淀粉酶，如淀粉葡糖苷酶、p-淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或所述額外酶可以是肽酶，尤其外肽酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶，尤其戊聚糖酶如木聚糖酶、蛋白酶、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶例如WO95/00636中披露的蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)、分支酶(l,4-a-葡聚糖分支酶)、4-a-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(糊精糖基轉(zhuǎn)移酶)或氧化還原酶，例如過氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂加氧酶、L-氨基酸氧化酶或糖氧化酶。所述額外酶可以是來自任意來源，包括來自哺乳動物和植物，并且特別來自微生物(細(xì)菌、酵母或真菌)，并且可以通過本領(lǐng)域常規(guī)使用的技術(shù)獲得。木聚糖酶一般是微生物來源的，例如，衍生自細(xì)菌或真菌，如曲霉菌株，尤其棘孢曲霉、黑曲霉(參考WO91/19782)、泡盛曲霉(例如，WO91/18977)或塔賓曲霉(A.tubingensis)(例如，WO92/01793);來自木霉菌林，例如里氏木霉；或來自腐質(zhì)霉菌株，例如特異腐質(zhì)霉(例如，WO92/17573)。Pentopan⑧和Novozym384@是從里氏木霉產(chǎn)生的市售木聚糖酶制備物。所述淀粉葡糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡糖苷酶(如AMG)。其他有用的淀粉酶產(chǎn)品包括GrindamylA1000或A5000(可從丹麥GrindstedProducts獲得)和AmylaseH或AmylaseP(可從荷蘭Gist-Brocades獲得)。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，尤其黑曲霉葡萄糖氧化酶(如200880008186.8示例性脂肪酶可以從嗜熱絲孢菌屬(77^i7M0挑j;ces)(腐質(zhì)霉屬)、根毛霉屬、假絲酵母屬(CVi"^^)、曲霉屬、根霉屬或假單胞菌屬菌林、尤其從疏棉狀嗜熱絲孢菌(7%^7MW^M/fl"wg/"os—(柔毛腐質(zhì)霉(/Tw附/a/fl/朋"一仍"))、米赫根毛霉(及/rfeo附wcw附Ze/rei)、南極假絲酵母(Cfl"AV/tfa"tor"Zca)、黑曲霉、德氏才艮霉(i/r&o/;MS1^fewfl/0或少根根霉或洋蔥假單胞菌(/^"flfowwi"sce/m"'fl)衍生。在具體的實施方案中，該脂肪酶可以例如是從如WO88/02775中所述南極假絲酵母(Om力V/a做似rcrica)衍生的脂肪酶A或脂肪酶B或該脂肪酶可以從例如EP238,023中所述的米赫根毛霉(及/^o附"cw/wi'We/)或例如EP305,216中所述的柔毛腐質(zhì)霉(好"附Zco/a/flMWg/朋stf)或例如EP214,761和WO89/01032中所述的洋蔥假單胞菌(Psewflto附ow肪C印fldtf)衍生。該方法可以用于從具有柔軟或易碎特征的面團(tuán)制備的任意類型烘烤產(chǎn)品，即白色、淺色或深色類型烘烤產(chǎn)品。烘烤產(chǎn)品實例是面包，尤其白色全麥面包或黑麥面包，一般為塊狀或棍狀形式，如但不限于法國長棍式面包(Frenchbaguette-typebread)、口袋面包(pitabread)、墨西哥薄餅、蛋糕、烙餅、餅干、小甜餅(cookies)、餡餅皮、脆皮面包、饅頭、皮薩餅等。在另一個實施方案中，TrAA或其變體可以在預(yù)混料(pre-mix)中使用，所述的預(yù)混料包含面粉和防老化淀粉酶、磷脂酶和磷脂。該預(yù)混料可以含有其他面團(tuán)改進(jìn)和/或面包改進(jìn)添加劑，例如，包括上文提及的酶的任意添加劑。在一個方面，該TrAA或其變體是包含防老化淀粉酶和磷脂酶的酶制品的組分，用作烘烤添加劑。酶制品任選地處于顆狀或結(jié)塊粉劑形式。該制品可以具有窄的粒徑分布，超過95。/。(重量)的粒子處在25至500nm范圍內(nèi)。顆粒劑和結(jié)塊粉可以通過常規(guī)方法制備，例如通過將TrAA或其變體噴到流化床制粒機(jī)中的載體上。該載體可以由具有合適粒徑的顆粒性核組成。該載體可以是可溶性或不溶性的，例如鹽(如NaCl或疏酸鈉)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨醇)、淀粉、稻、玉米粗磨粉或大豆。另一個方面構(gòu)思了對包含TrAA或其變體的粒子即a-淀粉酶粒子的包封。為制備經(jīng)包封的a-淀粉酶粒子，使所述酶與足量的食品級脂質(zhì)接觸以懸浮全部a-淀粉酶粒子。如本文中所用，食品級脂質(zhì)可以是不溶于水但溶于非極性有機(jī)溶劑如烴或乙醚中的任意天然有機(jī)化合物。合適的食品級脂質(zhì)包括但不限于，飽和或不飽和的脂肪或油形式的甘油三酯。組成飽和甘油三酯的脂肪酸和其組合的實例包括但不限于丁酸(衍生自乳脂肪)、棕櫚酸(衍生自動物和植物脂肪)和/或硬脂酸(衍生自動物和植物脂肪)。組成不飽和甘油三酯的脂肪酸和其組合的實例包括但不限于棕櫚油酸(衍生自動物和植物脂肪)、油酸(衍生自動物和植物脂肪)、亞油酸(衍生自植物油)和/或亞麻酸(衍生自亞麻籽油)。其他合適的食品級脂質(zhì)包括但不限于從上文討論的甘油三酯衍生的甘油單酯和甘油二酯、磷脂和糖脂。將所述食品級脂質(zhì)、尤其處于液體形式的食品級脂質(zhì)與粉末形式的a-淀粉酶粒子以這樣的方式接觸，從而所述脂質(zhì)材料覆蓋至少大多數(shù)(例如100。/。)a-淀粉酶粒子的至少一部分表面。因此，每個a-淀粉酶粒子獨(dú)立地包封在脂質(zhì)中。例如，向全部或基本上全部a-淀粉酶粒子提供薄的、連續(xù)的脂質(zhì)包封膜。這可以通過如下方式實現(xiàn)，首先將一定量的脂質(zhì)傾入容器，并隨后混入a-淀粉酶粒子，從而所述脂質(zhì)徹底濕潤每個a-淀粉酶粒子的表面。在短暫的攪拌時間后，回收在其表面攜帶大量脂質(zhì)的經(jīng)包封a-淀粉酶粒子。如此應(yīng)用至a-淀粉酶粒子的包封層的厚度可以通過選擇所用脂質(zhì)的類型和在需要時通過重復(fù)該操作旨在建立更厚的膜進(jìn)行控制。經(jīng)充填的遞送載體(loadeddeliveryvehicle)的貯存、操作和摻入可以借助包裝的混合物(packagedmix)進(jìn)行。這種包裝的混合物可以包含所述經(jīng)包封的a-淀粉酶。然而，該包裝的混合物還可以含有制造商或面包師所需要的額外成分。在經(jīng)包封的a-淀粉酶已經(jīng)摻入面團(tuán)后，面包師繼續(xù)進(jìn)行用于產(chǎn)品的正常生產(chǎn)工藝。包封a-淀粉酶粒子的優(yōu)勢是雙重的。首先，對那些熱不穩(wěn)定酶而言，食品級脂質(zhì)保護(hù)所述酶在烘烤工藝期間免于熱變性。結(jié)果是，雖然a-淀粉酶在發(fā)酵和烘烤階段期間得到穩(wěn)定并得到保護(hù)，但在最終烘烤物品中a-淀粉酶從該保護(hù)性包衣中釋放出來，從而a-淀粉酶水解聚葡聚糖中的糖苷鍵。所述經(jīng)充填的遞送載體也提供該活性酶持續(xù)釋放至烘烤物品。也就是說，在烘烤工藝后，從保護(hù)性包衣中以抵抗老化機(jī)制并且因而降低老化速率的速率持續(xù)釋放活性a-淀粉酶。通常，應(yīng)用至a-淀粉酶粒子的脂質(zhì)的量可以從所述a-淀粉酶總重量的幾個百分?jǐn)?shù)至該重量的許多倍之間變化，這取決于該脂質(zhì)的本質(zhì)、該脂質(zhì)應(yīng)用至a-淀粉酶粒子的方式、待處理面團(tuán)混合物的組成和所涉及面團(tuán)揉混操作的劇烈程度。經(jīng)充填的遞送載體，即經(jīng)脂質(zhì)包封的酶，以有效量添加至用來制備烘烤物品的成分，旨在延長此烘烤物品的貯存期限。面包師計算如上文所述制備的經(jīng)包封a-淀粉酶的量，其中需要所述的量以實現(xiàn)想要的防老化作用。基于所包封的酶的濃度和a-淀粉酶對所指定面粉的比例，計算所需的經(jīng)包封a-淀粉酶的量。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)寬泛的濃度是有效的，然而如已經(jīng)討論那樣，可觀察到的防老化改善并不與a-淀粉酶濃度線性對應(yīng)，不過在某些最低水平以上，a-淀粉酶濃度的大幅提高產(chǎn)生微弱的進(jìn)一步改善。具體烘烤生產(chǎn)中實際使用的a-淀粉酶濃度可能比必需的最小量高得多，目的是為面包師提供針對由該面包師疏忽所致低估誤差的某些保障。酶濃度的下限由面包師希望實現(xiàn)的最小防老化作用決定。制備焙烤物品的方法可以包括a)制備脂質(zhì)包被的a-淀粉酶粒子，其中基本上全部a-淀粉酶粒子均被包被；b)混合含有面粉的面團(tuán)；c)在所述混合結(jié)束前添加脂質(zhì)包被的a-淀粉酶粒子至該面團(tuán)并在所述脂質(zhì)包衣從a-淀粉酶上消去前終止混合；d)使面團(tuán)醒發(fā)；和e)焙烤該面團(tuán)以提供烘烤物品，其中所述a-淀粉酶在混合、醒發(fā)和烘烤階段沒有活性而在烘烤物品中有活性。經(jīng)包封的a-淀粉酶可以在混合循環(huán)期間(例如接近混合循環(huán)結(jié)束時)添加至面團(tuán)。在混合階段中的某個時間點(diǎn)添加經(jīng)包封的a-淀粉酶，其中該時間點(diǎn)允許經(jīng)包封的a-淀粉酶充分地擴(kuò)散至整個面團(tuán)；然而，在所述保護(hù)性包衣從a-淀粉酶粒子上被剝離之前終止所述混合階段。取決于面團(tuán)的類型及體積和混合作用及速度，在任何位置處可能需要1至6分鐘或更多時間以將經(jīng)包封的a-淀粉酶混合入所述面團(tuán)，不過平均需要2至4分鐘。因此，幾個變量可決定確切的操作。首先，經(jīng)包封的a-淀粉酶的量應(yīng)當(dāng)具有足以使經(jīng)包封的a-淀粉酶擴(kuò)散至整個面團(tuán)混合物的總體積。若經(jīng)包封a-淀粉酶的制備物是高度濃縮的，可能需要添加額外的油至該預(yù)混物，隨后將所述經(jīng)包封的a-淀粉酶添加至面團(tuán)。配方和生產(chǎn)方法可能需要具體修改；然而，當(dāng)從面團(tuán)中扣除25%在面包面團(tuán)配方中規(guī)定的油并且用作濃縮的經(jīng)包封a-淀粉酶的載體時，其中接近混合循環(huán)結(jié)束時添加，則通常可以產(chǎn)生良好結(jié)果。在面包或其他烘烤制品，尤其具有低脂肪含量的那些烘烤制品(例如法式面包)中，含大約1。/。干面粉重量的經(jīng)包封a-淀粉酶混合物足以使經(jīng)包封a-淀粉酶恰當(dāng)?shù)嘏c面團(tuán)混合。合適百分?jǐn)?shù)的范圍是寬泛的并且取決于配方、成品和個人面包師的生產(chǎn)方法學(xué)要求。第二，經(jīng)包封的a-淀粉酶混懸劑應(yīng)當(dāng)以足夠時間添加至混合物，以便完全混入面團(tuán)，但不是持續(xù)這樣的時間，以至于過度機(jī)械作用從經(jīng)包封的a-淀粉酶粒子上剝離保護(hù)性脂質(zhì)包衣。7.織物退漿組合物及用途還構(gòu)思了^f吏用TrAA或其變體處理織物(例如使織物退漿)的組合物和方法。織物處理方法是本領(lǐng)域熟知的(例如見美國專利號6，077，316)。例如，在一個方面，通過一種方法改善了織物的觸感和外觀，所述的方法包括使該織物與溶液中的TrAA或其變體接觸。在一個方面，該織物在壓力下用所述溶液處理。在一個方面，在織物的織造期間或之后或在退漿階段或一個或多個額外的織物加工步驟期間應(yīng)用TrAA或其變體。在織物的織造期間，紗線暴露于相當(dāng)大的才幾械應(yīng)力。在機(jī)械織機(jī)上織造之前，經(jīng)紗往往用上漿淀粉或淀粉衍生物涂敷以提高其拉伸強(qiáng)度并防止斷裂。TrAA或其變體可以在織造期間或之后應(yīng)用，以除去這些上漿淀粉或淀粉衍生物。在織造后，TrAA或其變體可以用來在進(jìn)一步加工該織物之前除去上漿涂層，以確保均勻和耐洗滌的結(jié)果。TrAA或其變體可以單獨(dú)地或與其他退漿化學(xué)試劑和/或退漿酶一起作為洗滌添加劑例如在含水組合物中使用，旨在使織物(包括含棉織物)退漿。TrAA或其變體也可以在用于靛藍(lán)染色的牛仔布織物和服裝上產(chǎn)生石磨水洗外觀的組合物和方法中使用。對于衣服制造，可以將織物裁切并縫制成衣服或服裝，隨后對其進(jìn)行整理。特別地，已經(jīng)為制造粗斜紋牛仔布開發(fā)了不同的酶整理方法。牛仔布服裝的整理通常始于酶退漿步驟，在該步驟期間服裝受到解淀粉酶作用以賦予織物柔軟度并使棉更容易進(jìn)行后續(xù)的酶整理步驟。TrAA或其變體可以在整理牛仔布服裝(例如"生物石磨水洗法")、酶退漿和賦予織物柔軟度的方法和/或整理工藝中使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見可以對所使用的組合物和方法作出各種修改和變化而不脫離預(yù)期用途的精神和范圍。因此，若所述修改和變化處在所附權(quán)利要求書及其等同物的范圍內(nèi)，則它們是本發(fā)明的修改和變化。實施例實施例1:1.1TrAA基因的克隆使用BIO101FastPrep⑧系統(tǒng)，根據(jù)供應(yīng)商(Qbiogene，Inc"Irvine，CA)描述的方法，從馬鈴薯葡萄糖肉湯(DifcoTM目錄號254920)中液體培養(yǎng)物的菌絲團(tuán)分離里氏木霉QM6a的染色體DNA。使用Quick離心柱(Qiagen，Inc.，Valencia,CA;目錄號28106)純化所述DNA。使用根據(jù)美國能源部聯(lián)合基因組研究所的里氏木霉基因組數(shù)據(jù)庫中的預(yù)測核苷,列設(shè)計的具有TrAA特異序列的引物，正向引物NSP331(SEQIDNO:6:ATGAAGCTCCGGTACGCTCTCC)和反向引物NSP332(SEQIDNO:7:TCACGAAGACAGCAAGACAATGGGC)分離TrAA基因。所述引物在5，末端側(cè)翼分布有GatewayattB序列(InvitrogenCorp"Carlsbad,CA)。使用里氏木霉QM6a染色體DNA作為才莫板。PCR混合物含有以下成分4nL正向引物(10ftM);4jiL反向引物(10jiM);1jiL模板DNA(500ng/fiL);2jiLdNTP混合物(10mM);10jiL10xCx緩沖液和0.5pLPfuTurboCx熱啟動DNA聚合酶(Stratagene，LaJollaCA;目錄號600410)。添加去離子水至100pL總體積。PCR方案如下初始變性98°C30秒；分別變性98°C10秒；復(fù)性68°C30秒；延伸72°C45秒，30個循環(huán)；和終末延伸步驟72。C10分鐘。PCR片段通過在1%瓊脂糖中電泳進(jìn)行分析。使用凝膠提取純化試劑盒(Qiagen目錄號28706)分離具有預(yù)期大小的片段。將PCR片段克隆至Gateway⑧進(jìn)入載體pDONR201并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5aMaxEfficiency細(xì)胞(Invitrogen目錄號18258012)。測定所插入DNA的核苷酸序列，從中推導(dǎo)TrAA基因的基因組DNA序列(SEQIDNO:l)。1.2里氏木霉的轉(zhuǎn)化和發(fā)酵/TrAA的表達(dá)含有TrAA基因的載體DNA重組至里氏木霉表達(dá)載體pTrex3g，該載體在WO2006/060062中詳細(xì)描述。使用PDS-1000/Hdium系統(tǒng)(Bio畫RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA;目錄號165-02257)的粒子轟擊法，將所得表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至從RL-P37衍生的里氏木霉宿主菌林，具有多個基因缺失(Acbhl、Acbh2、Aegll、Aegl2,即"四重缺失，，；參見WO92/06184和WO05/001036)。下文概述此方案，并且參考WO05/001036的實施例6和11。制備了來自里氏木霉四重缺失菌林的孢子懸液(大約5x108個孢子/mL)。將100-200nL孢子懸液涂布在極限培養(yǎng)基(MM)乙酰胺培養(yǎng)基平板的中心。MM乙酰胺培養(yǎng)基是0.6g/L乙酰胺；1.68g/LCsCl;20g/L葡萄糖；20g/LKH2P04;0.6g/LCaCl2.2H20;痕量元素溶液；20g/LNoble瓊脂；pH5.5。1000X痕量元素儲液含有5.0g/LFeS04.7H20;1.6g/LMnS04H20;1.4g/LZnS047H20和1.0g/LCoCl2.6H20。隨后使該孢子懸液在MM乙酰胺培養(yǎng)基的表面上干燥。轉(zhuǎn)化按照制造商說明書進(jìn)行。簡而言之，在微量離心管中放置60mg的M10鵠粒子。添加1mL乙醇，并將該溶液靜置15秒。將粒子以15,000轉(zhuǎn)/分鐘離心15秒。除去乙醇，并將鎢粒子用無菌dH20洗滌3次，隨后添加250fiL的50%(v/v)無菌甘油。在微量離心管中放置25fiL鎢粒子懸液。隨后添加以下溶液，伴以連續(xù)渦旋5jiL(100-200ng/jiL)質(zhì)粒DNA、3秒。除去上清液，并將粒子用200jiL的100。/。乙醇洗滌并離心3秒。除去上清液，添加24nL的100。/。乙醇并通過抽吸混合，隨后取出8jiL的粒子等份樣并置于干燥器中大載體圓盤的中心上。一旦鴒/DNA溶液變干，將大載體圓盤置于轟擊室中，并放置具有孢子的MM乙酰胺平板，并根據(jù)制造商說明書開展轟擊操作。在用鎢/DNA粒子轟擊鋪板的孢子后，將平板在30°C溫育。轉(zhuǎn)化的菌落轉(zhuǎn)移至MM乙酰胺培養(yǎng)基的新鮮平板并在30。C溫育。1.3表達(dá)的TrAA的a-淀粉酶活性的展示在MM乙酰胺平板上生長5日后，顯示穩(wěn)定形態(tài)的轉(zhuǎn)化體接種含有30mLProflo培養(yǎng)基的250mL搖瓶。Proflo培養(yǎng)基含有30g/La-乳糖；6.5g/L(NH4)2S04;2g/LKH2P04;0.3g/LMgS047H20;0.2g/LCaCl2;痕量元素溶液；2mL/L10%吐溫80;22.5g/LProFlo棉籽粉(TradersProtein,Memphis,TN);和0.72g/LCaC03。伴以140轉(zhuǎn)/分鐘搖動，在28。C生長2日后，將10%的Proflo培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有30mL限定乳糖的培養(yǎng)基的250mL搖瓶。限定乳糖的培養(yǎng)基的組成是5g/L(NH4)2S04;33g/LPIPPS緩沖液；9g/L酪蛋白氨基酸；4.5g/LKH2S04;1.0g/LMgS047H20;5mL/LMazuDF60-P消泡劑(MazurChemicals,IL);痕量元素溶液；pH5.5。消毒后，添加40mL/L40%(w/v)乳糖溶液至該培養(yǎng)基。限定乳糖的培養(yǎng)基搖瓶在28°C，140轉(zhuǎn)/分鐘溫育4-5曰。通過離心去除菌絲體，并且分析上清液的總蛋白(BCA蛋白質(zhì)測試試劑盒，PierceCA;目錄號23225)。使用Ceralpha試劑(亞節(jié)基封閉的對硝基苯基麥芽庚糖香)(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Wicklow,Ireland;目錄號K-CERA)作為底物，測試a-淀粉酶活性。培養(yǎng)上清液的樣品與適宜體積的2X含還原劑的上樣緩沖液混合，并且使用NUPAGENovex10%Bis-Tris凝膠，利用MESSDS運(yùn)行緩沖液，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)用SimplyBlueTMSafeStain(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色。在圖5，泳道l中顯示來自培養(yǎng)上清液的粗樣品的蛋白質(zhì)染色圖鐠。顯而易見該宿主量約47kDa，如與泳道M中的分子量標(biāo)記比較所確定。估計這種TrAA的純度是約89%。1.4TrAA基因產(chǎn)物的生物化學(xué)表征在3L培養(yǎng)物中生長表達(dá)TrAA的轉(zhuǎn)化體。宿主細(xì)胞將TrAA以約15-20g/L濃度分泌至該培養(yǎng)物。使用具有IO，OOODa分子量截止值的超濾裝置(PallCorp.,OmegaTMMembrane,目錄號OS010clO)濃縮培養(yǎng)物濾液。使用AKTA探索者100FPLC系統(tǒng)(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)純化粗酶制備物。用25mMTris，pH6.0平衡HiPrep16/10FFQ-Sepharose柱(AmershamBiosciences,目錄號17-5190-01),并且用100mMNaCl，25mMTris，pH6.0從該柱洗脫蛋白質(zhì)。使用Cbind200樹脂(Novagen目錄號701212-3)并且利用含有500mMNaCl的50mMTrispH7.0作為洗脫緩沖液，開展第二個親和層析步驟。進(jìn)行該親和純化后，TrAA可以通過如上所述的超濾再次濃縮。通過SDS-PAGE分析純化的TrAA,并且在圖5，泳道2中顯示結(jié)果。估計這種TrAA的純度是約98%。"f吏用Ceralpha試齊寸(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Wicklow,Ireland;目錄號K-CERA)作為底物，確定該基因產(chǎn)物的a-淀粉酶活性的pH和溫度曲線。在測試條件下，如圖6A中所示，TrAA顯示約pH5-6的最適pH，并且如圖6B中所示，TrAA顯示約42。C的最適溫度。實施例2:TrAA用于提高由葡糖淀粉酶在低pH催化的糖化反應(yīng)中葡萄糖的產(chǎn)率。TrAA(批號GCI2004017/018-UF)如實施例1的1.3節(jié)中所述進(jìn)行純化。葡糖淀粉酶來自GA-L，批號901-042卯-001(GenencorInternational,Inc.),其活性為385GAU/g。底物由如下制備的液化淀粉底物組成745g生玉米淀粉用水稀釋以產(chǎn)生32%w/wds的漿液。添加熱穂、定的細(xì)菌a-淀粉酶SpezymeEthyl(GenencorInternational,Inc.)批號107-04107-001至濃度0.3kg/mtds，并且溶液在92°C液化25分鐘。使用本領(lǐng)域熟知的方法，開展硪試驗以測量殘余淀粉濃度。將液化淀粉冷卻至60。C并用20%v/v硫酸調(diào)節(jié)pH至4.2。以下文所示濃度添加TrAA和Optimax4060，并且反應(yīng)在60。C進(jìn)行30小時。在該反應(yīng)結(jié)束時，在用HPLC級水1:40稀釋樣品并用0.45微米濾器過濾該樣品后，使用HPLC確定由反應(yīng)產(chǎn)生的DPn。對于HPLC分析，將20^iL樣品注射至PhenomenexRezexROA-有機(jī)酸(H+)柱并且在60。C于HPLC級水的流動相中，在16分鐘運(yùn)行中解析。通過折射率的變化測量洗脫液中的產(chǎn)物(DPn)。表1顯示從代表性反應(yīng)中獲得的DPn;圖1描述作為本實驗中所用酶濃度的函數(shù)的DP1產(chǎn)生。可以見到，TrAA在葡糖淀粉酶存在下比僅有葡糖淀粉酶本身時產(chǎn)生了具有更高葡萄糖濃度的富含葡萄糖的糖漿。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實施例3:由TrAA和葡糖淀粉酶催化的糖化反應(yīng)比僅由葡糖淀粉酶催化的反應(yīng)在更短的時間中達(dá)到更高水平的葡萄糖。如實施例2中所述，將液化的生玉米淀粉制備為32%ds的漿液。將此液化淀粉冷卻至60°C并調(diào)節(jié)pH至4.2，隨后以表2中所示的濃度添加酶。如實施例1的1.3部分中所迷，制備了TrAA(批號GCI12004017/018-UF)。以385GAU/g提供作為GA-L(批號901-042卯-001)的葡糖淀粉酶。如上文實施例2中所示，在反應(yīng)結(jié)束時測量DPn。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實施例4:TrAA也用于糖化反應(yīng)中提高麥芽糖的產(chǎn)率。如以下實驗中測定，TrAA在相對低的pH展示生麥芽糖活性。底物由液化淀粉底物組成，其中所述的液化淀粉底物如實施例2中所述制備，除了生玉米用7jC稀釋以產(chǎn)生30%w/wds漿液，向所迷底物添加0.25kg/mtds的SpezymeEthyl(GenencorInternational,Inc.,批號107-04107-001)。在92。C液化25分鐘后，將液化淀粉冷卻至55°C并用20%v/v硫酸調(diào)節(jié)pH。如上文實施例2中所述測量DPn。圖2描述了由0.5kg/mtdsTrAA(批號GCI12004017/018-UF)催化反應(yīng)48小時后DP2生產(chǎn)的pH依賴性。如圖2中所示，TrAA在pH5.0至5.5顯示最佳活性；然而，TrAA在4.5至6.0的pH范圍內(nèi)也顯示幾乎最佳的活性。該實驗表明TrAA在4.5的相對低pH是高活性的。實施例5:TrAA可以催化產(chǎn)生DP2到這樣的水平，該水平與用生麥芽糖真菌a-淀粉酶-澄解酶⑧L(GenencorInternational,Inc.)所獲得的那些水平是可比較的。根據(jù)上述實施例1中所述的方法，從里氏木霉產(chǎn)生并純化TrAA。用于本實驗的TrAA(批號150906)顯示約18,000SKBU/g的比活性。還測試了與OptimaxL-1000(GenencorInternational,Inc.，批號107-04224-001)形式的支鏈淀粉酶組合的TrAA，其中所述的支鏈淀粉酶具有約1040PU單位/g的比活性。本實驗中澄解酶⑧L(批號107-04330-001)的比活性是約41,000SKBU/g。液化淀粉如實施例2中所述制備并調(diào)節(jié)至55°C，pH5.5或60。C,pH4.5。以下文所示濃度添加酶，并且反應(yīng)在所示溫度進(jìn)行48小時。在啟動反應(yīng)后24小時和48小時時，使用實施例2中所述的方法測量反應(yīng)期間產(chǎn)生的DPn。表3顯示從代表性反應(yīng)中獲得的DPn;圖3描述糖化反應(yīng)48小時后，獲得的作為酶濃度(單位SKBU/g)函數(shù)的DP2濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>合的情況下產(chǎn)生富含麥芽糖的糖漿，所述富含麥芽糖的糖漿具有比用澄解酶⑧L所獲得的DPI濃度具有更高的DPI濃度約11%w/wds對約4%w/wds。因此，該實驗顯示TrAA可以在低pH用來產(chǎn)生高麥芽糖糖漿，其中所述糖漿含有與用澄解酶⑧L獲得麥芽糖水平可比較的麥芽糖水平，以及更高水平的葡萄糖。實施例6:在低pH使用時，TrAA顯著地超過其他常規(guī)的生麥芽糖淀粉酶，如以下實驗中所示。所用的實驗條件與實施例5中相同，除了該反應(yīng)在58。C，pH4.6進(jìn)行和由0.2kg/mtdsBBA(卩-淀粉酶；批號05189-001)，0.2kg/mtds澄解酶L(批號9016231002)或0.5kg/mtdsTrAA(批號GCI2004017/018-UF)催化DPn生產(chǎn)之外。如表4中所示，在TrAA存在下，獲得了較BBA或澄解酶⑧L存在下明顯更高的DP2濃度。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>實施例7:TrAA催化的DP2生產(chǎn)因添加支鏈淀粉酶而顯著提高。在以下實驗中，實-驗條件與實施例5中所述相同，除了該反應(yīng)在58。C，pH4.6進(jìn)行之外。以表5中所示的濃度添力口OptimaxL-1000(GenencorInternational,Inc.;批號卯16167004，1165PU/g)形式的支鏈淀粉酶。該反應(yīng)在58。C，pH4.6進(jìn)行所示的時間段。如表5中所示，0.1-0.25kg/mtds支鏈淀粉酶截至48小時明顯地提高由TrAA催化的DP2產(chǎn)生。圖4描述在本實施例中所述的各種條件下在48小時時形成的DP2。表5:TrAAPUTpH時間%%%%DE(。c)(小時)DPIDP2DP3HS0.5kg/mtds無584.6247.244.820.127.947489.251.616.822.3500.5kg/mtds0.1kg/mtds584.6246.744.921.526.9474810.461.822.45.3570.5kg/mtds0.25kg/mtds584.6247.849.423.619.2504810.861.722.05.5570.5kg/mtds0.5kg/mtds584.6247.550.325.017.2514810.360.922.95.956本文中提到的全部參考文獻(xiàn)通過引用的方式完整并入本文作為參考用于全部目的。權(quán)利要求1.分離的多肽，其包含(i)SEQIDNO3的第21-463位殘基或(ii)里氏木霉(Trichodermareesei)α-淀粉酶(TrAA)的變體，其中所述變體具有α-淀粉酶活性并與SEQIDNO3的第21-463位殘基具有至少80％氨基酸序列同一性。2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述變體與SEQIDNO:3的第21-463位殘基具有至少90%序列同一性。3.權(quán)利要求2的分離的多肽，其中所述變體與SEQIDNO:3的第21-463位殘基具有至少95%序列同一性。4.權(quán)利要求l的分離的多肽，其中與SEQIDNO:3的第21-463位殘勤目比，該變體具有l(wèi)-10個氨基酸替代、插入或缺失。5.權(quán)利要求l的分離的多肽，其包含SEQIDNO:3。6.權(quán)利要求l的分離的多肽，其由SEQIDNO:3的第21-463位殘基組成。7.編碼根據(jù)權(quán)利要求l所述多肽的多核苷酸。8.權(quán)利要求7的多核苷酸，其包含SEQIDNO:2。9.載體，其包含權(quán)利要求7的多核苷酸。10.細(xì)菌細(xì)胞，其包含權(quán)利要求9的載體。11.表達(dá)權(quán)利要求7的多核苷酸的宿主細(xì)胞。12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是木霉屬(7Wc/fOAvfe,附flsp.)。13.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是RL-P37分離林、絲狀真菌細(xì)胞、曲霉屬(^pe^/〃":ssp.)、鐮孢屬(F"^in'w/Msp.)或青霉屬(Pe/M'"7Zz'M附sp.)。14.權(quán)利要求ll的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞還表達(dá)編碼異源性葡糖淀粉酶的核酸。15.糖化液化淀粉以產(chǎn)生富含葡萄糖的糖漿的方法，包括添加根據(jù)權(quán)利要求1的多肽至液化淀粉溶液，添加葡糖淀粉酶至液化淀粉溶液，和糖化液化淀粉溶液，其中所述的糖化液化淀粉溶液產(chǎn)生了富含葡萄糖的糖漿。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述多肽以每公噸干燥固體約0.3-1kg添加至所述液化淀粉溶液。17.權(quán)利要求15的方法，其中所述的液化淀粉溶液是約20-35%w/w干燥固體的液化淀粉漿液。18.淀粉加工組合物，其包含權(quán)利要求l的多肽。19.烘烤的方法，包括添加權(quán)利要求1的多肽至待烘烤的物質(zhì)，和烘烤該物質(zhì)。20.退漿織物的方法，包括將權(quán)利要求1的多肽與織物接觸，持續(xù)足以退漿織物的時間。全文摘要來自里氏木霉(Trichodermareesei)的生麥芽糖α-淀粉酶(TrAA)和其變體在葡糖淀粉酶存在下在從液化淀粉產(chǎn)生高葡萄糖糖漿中是有用的，其中由此產(chǎn)生的高葡萄糖糖漿含有至少約97％的葡萄糖。在這個方法中，TrAA有利地抑制葡萄糖逆轉(zhuǎn)成麥芽低聚糖。也提供了用于產(chǎn)生TrAA和其變體的表達(dá)宿主和編碼核酸。文檔編號C12N9/30GK101657537SQ200880008186公開日2010年2月24日申請日期2008年3月12日優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日發(fā)明者G·段,J·K·舍蒂,K·錢,M·謝弗斯,P·范索林格恩申請人:丹尼斯科美國公司