具有由單核苷或單核苷酸衍生的結(jié)構(gòu)的化合物、核酸、標(biāo)記物以及核酸檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：：具有由單核苷或單核苷酸衍生的結(jié)構(gòu)的化合物、核酸、標(biāo)記物以及核酸檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有由單核苷或單核苷酸衍生的結(jié)構(gòu)的化合物、核酸、標(biāo)記物以及核酸檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：在疾病的基因診斷和基因的表達(dá)分析等中，需要檢出具有某種特定序列的核酸。為此常使用利用熒光的方法，例如通常使用通過(guò)將一種熒光染料共價(jià)結(jié)合到DNA上所得的熒光探針作為標(biāo)記物。這樣的標(biāo)記物(熒光探針)的問(wèn)題在于例如在沒(méi)有與互補(bǔ)的核酸形成雙螺旋的情況下仍發(fā)出熒光。為了消除探針本身的熒光而利用FRET的方法雖然有效(非專利文獻(xiàn)1-4等)，但存在引入兩種熒光染料的成本等問(wèn)題。此外，已知瘞唑橙(thiazoleorange)是作為通過(guò)與DNA或RNA的相互作用增加熒光強(qiáng)度的熒光染料的花菁染料之一。雖然嘗試過(guò)通過(guò)使瘞唑橙共價(jià)鍵結(jié)合至DNA來(lái)制作熒光探針的實(shí)例，然而其仍通過(guò)與含有嘌呤戚基的單鏈DNA的相互作用發(fā)出強(qiáng)烈的熒光(非專利文獻(xiàn)5)，因此在形成雙螺旋時(shí)焚光強(qiáng)度的增加較小，不能說(shuō)是成功(非專利文獻(xiàn)6和7)。非專利文獻(xiàn)l:Tyagi，S.Kramer,F.R.(1996)Nat.Biotechiiol.14，303-308。非專利文獻(xiàn)2:Nazarenko，I.A"Bhatnagar，S.K.，Hohman，R.J.(1997)NucleicAcidsRes.25，2516-2521。非專利文獻(xiàn)3:Gelmini，S"Orlando,C"Sestini，R"Vona，G，Pi腿ni，P"Ruocco，L.，Pazzagli，M.(1997)Clin.Chem.43，752-758。非專利文獻(xiàn)4:Whitcombe，D"Theaker，J"Buy,S.P"Brown,T"Little,S.(1999)Nat.Biotechnol.17，804-807。非專利文獻(xiàn)5:Biopolymers1998，46，39-51。非專利文獻(xiàn)6:AnalyticaChimicaActa2002，470，57-70。非專利文獻(xiàn)7:Chemistry-AEuropeanJournal2006，12，2270-2281。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供能夠有效地檢測(cè)出核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物。為了解決上述問(wèn)題,本發(fā)明的化合物為具有由單核苷或單核苷酸衍生的結(jié)構(gòu)的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中所述結(jié)構(gòu)以下述式(1)、(lb)或(lc)表示。(1)(lb)(lc)在所述式(1)、(1b)和(1c)中，B為具有天然核酸威基(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧咬或尿嘧啶)骨架或者人工核酸堿基骨架的原子團(tuán)，E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架或由這其中的任一骨架衍生的結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或擬肽結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，Z"和Z^分別表示氫原子、保護(hù)基或展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)，可以相同或者不同，Q在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為O，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為NH，X在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為氫原子、能夠用酸脫保護(hù)的鞋基保護(hù)基、磷酸基(單磷酸酯基)、二磷酸基(二磷酸酯基)或三磷酸基(三磷酸酯基)，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為氳原子或氨基保護(hù)基，Y在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為氳原子、羥基保護(hù)基或亞磷酰胺基(phosphoramiditegroup)，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為氫原子或保護(hù)基，L1、I和l/各自為連接體(橋連原子或原子團(tuán))，主鏈長(zhǎng)(主鏈原子數(shù))任意，在主鏈中，各自均可以含有或不含C、N、O、S、P和Si,在主鏈中，各自均可以含有或不含單鍵、雙鍵、三鍵、酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵、亞胺基、醚鍵、硫醚鍵和硫酯鍵，L1、1^和I彼此之間可以相同或不同，D為CR、N、P、P-O、B或SiR，R為氬原子、烷基或任意取代基，b為單鍵、雙鍵或三鍵，或者，在所述式(1)中，！/和LS為所述連接體，L3、D和b不存在，1^和I直接連接于B，所述式(lb)中、T在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為磷酸橋連(P(V),其中l(wèi)個(gè)以上的氧原子(O)可由硫原子(S)替代，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為NH。此外，本發(fā)明的核酸是具有至少一種以下式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示結(jié)構(gòu)的核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽。此外，在本說(shuō)明書(shū)中，當(dāng)化學(xué)式(例如以下式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中的鍵從括號(hào)內(nèi)部向括號(hào)外延伸并且在括號(hào)外側(cè)在所述鍵上添加星號(hào)時(shí)，所述星號(hào)表示在該鍵上結(jié)合某個(gè)原子或原子團(tuán)。26<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中B、E、Z11、Z12、L1、L2、L3、D和b各自與上述式(1)、(lb)或(lc)中結(jié)構(gòu)相同，其中式(16)、(17)和(18)中，E為上述式(1)、(lb)或(lc)中的(i)的原子團(tuán)，磷酸橋連中至少一個(gè)O原子可被S原子替代，式(16b)、(17b)和(18b)中，E為上述式(1)、(lb)或(lc)中的所述(ii)的原子團(tuán)，式(17)和(17b)中，各B可相同或不同，各E可相同或不同。此外，本發(fā)明的標(biāo)記物為(i)這樣的標(biāo)記物一個(gè)分子內(nèi)的兩個(gè)平面化學(xué)結(jié)構(gòu)不在同一平面內(nèi)，而是以某一角度存在，但該分子在插入或溝結(jié)合到核酸中時(shí)，所述兩個(gè)平面化學(xué)結(jié)構(gòu)在同一平面內(nèi)排列配置，從而產(chǎn)生熒光發(fā)光；(ii)由兩個(gè)以上染料分子群形成的標(biāo)記物，其中，雖然由于兩個(gè)以上染料分子由于平行聚集所產(chǎn)生的激子效應(yīng)不會(huì)展現(xiàn)出熒光發(fā)光,但這些分子在插入或溝結(jié)合至核酸中時(shí)，通過(guò)所述聚集狀態(tài)的解除會(huì)產(chǎn)生熒光發(fā)光；或者(iii)一種復(fù)合體標(biāo)記物，其以在同一分子內(nèi)具有兩個(gè)以上染料分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)作為特征性化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中，雖然由于兩個(gè)以上的染料分子平行聚集所產(chǎn)生的激子效應(yīng)不會(huì)展現(xiàn)出熒光發(fā)光，但是這些分子在插入或溝結(jié)合到核酸中時(shí)，通過(guò)所述聚集狀態(tài)的解除會(huì)產(chǎn)生熒光發(fā)光。此外，本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法為(I)包括以下步驟的核酸檢測(cè)方法將本發(fā)明標(biāo)記物一一標(biāo)記單核苷酸或標(biāo)記寡核苷酸作為底物進(jìn)行核酸合成，從而合成插入有或溝結(jié)合有所述展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)或染料分子結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸；分別測(cè)定所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度；并通過(guò)比較所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)核酸合成；(II)包括以下步驟的核酸檢測(cè)方法將本發(fā)明標(biāo)記物一一單鏈核酸作為笫一核酸，將其與具有與所述第一核酸互補(bǔ)的序列或與所述互補(bǔ)序列類似的序列的第二核酸雜交來(lái)進(jìn)行核酸合成，從而合成插入有或溝結(jié)合有所述展現(xiàn)熒光性的原子團(tuán)或染料分子結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸；分別測(cè)定所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度；并通過(guò)比較所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)所述第一核酸與所述第二核酸的雜交情況；(III)包括以下步驟的核酸檢測(cè)方法28將本發(fā)明標(biāo)記物一一單鏈核酸作為第一核酸，將其與具有與所述第一核酸互補(bǔ)的序列或與所述互補(bǔ)序列類似的序列的第二核酸雜交來(lái)進(jìn)行核酸合成，從而合成插入有或溝結(jié)合有所述展現(xiàn)熒光性的原子團(tuán)或染料分子結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸；分別測(cè)定所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度；并通過(guò)比較所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)所述第一核酸與所述第二核酸的雜交情況；或者(IV)核酸檢測(cè)方法，其特征在于^^用第三核酸來(lái)檢測(cè)三鏈核酸或核酸類似物的形成情況，所述第三核酸通過(guò)4吏用具有所述第一核酸序列、所述第二核酸序列或與這些序列互補(bǔ)的序列、或者與所述的這些序列互補(bǔ)的序列相似的序列，并且由本發(fā)明的標(biāo)記物或復(fù)合體標(biāo)記物標(biāo)記或未纟皮其標(biāo)記。此外，本發(fā)明的試劑盒含有核酸合成裝置、標(biāo)記物和熒光強(qiáng)度測(cè)定裝置，所述標(biāo)記物為所述的本發(fā)明標(biāo)記物。本發(fā)明的化合物和核酸由于具有所述結(jié)構(gòu)，從而可用作能夠有效地檢測(cè)出核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物。更具體而言，在例如所述式(l)、(lb)、(lc)、(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)中，Z"和ZU為展現(xiàn)熒光性的原子團(tuán)的化合物或核酸適合用作所述的本發(fā)明標(biāo)記物。此外，Z11和Z12為氫原子或保護(hù)基的化合物或核酸可用作所述標(biāo)記物的合成原料或合成中間體。然而，本發(fā)明的化合物和核酸的用途不限于此，可以用于任何用途。圖1:圖1為模型化地顯示本發(fā)明原理的圖。圖2:圖2顯示了實(shí)施例化合物的iH和"CNMR語(yǔ)圖。圖3:圖3顯示了實(shí)施例其他化合物的^和"CNMR譜圖。圖4:圖4顯示了經(jīng)過(guò)純化的DNA寡聚物5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，的MALDITOF質(zhì)諉圖。箭頭為經(jīng)過(guò)純化的生成物的質(zhì)量峰(4101.9)。通過(guò)分子量計(jì)算值4102.8(C134H176N52O76P12)得到的[M-H—計(jì)算值為4101.8，其是一致的。圖5:圖5顯示了DNA寡聚物5'-d(CGCAATXTAACGC)-3，與生物素衍生物的反應(yīng)產(chǎn)物的MALDITOF質(zhì)鐠圖。箭頭為經(jīng)過(guò)純化的生成物的質(zhì)量峰(4554.3)。通過(guò)分子量計(jì)算值4555.4((^13411176]^5207612)得到的[M-H—計(jì)算值為4554.4，其是一致的。圖6:圖6顯示了實(shí)施例化合物(用染料標(biāo)記的DNA)的NMR譜圖(DMSO-d6)。圖7:圖7顯示了圖6化合物(用染料標(biāo)記的DNA)的反相HPLC圖。圖8:圖8顯示了圖6化合物(用染料標(biāo)記的DNA)的MALDITOF質(zhì)譜圖。圖9:圖9顯示了實(shí)施例的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的UV鐠。圖10:圖10顯示了在使用488nm的氣t光時(shí)，圖9的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的熒光譜。圖11:圖11顯示了在使用510nm的激發(fā)光時(shí)，圖9的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的熒光鐠。圖12:圖12顯示了另一實(shí)施例的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的UV譜。圖13:圖13顯示了圖12的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的熒光譜。圖14:圖14顯示了再一實(shí)施例的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的UV譜。圖15:圖15顯示了圖14的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的熒光譜。圖16:圖16顯示了又一實(shí)施例的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的UV諳。圖17:圖17顯示了圖16的熒光探針為單鏈狀態(tài)時(shí)、DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及DNA-RNA雙螺旋時(shí)的三個(gè)樣本的UV譜。圖18:圖18為顯示實(shí)施例中的幾種熒光探針的吸收譜、、M譜和發(fā)射譜的圖。圖19:圖19為顯示實(shí)施例中的其他熒光探針的吸收譜、M譜和發(fā)30射譜的圖。圖20:圖20為在各種溫度和濃度下測(cè)定實(shí)施例的熒光探針的吸收諉所得的吸收譜圖。圖21:圖21為將實(shí)施例的熒光探針進(jìn)行雜交所得的雙鏈的CD諳圖。圖22:圖22為顯示實(shí)施例中另一些熒光探針的吸收鐠、激發(fā)譜和發(fā)射譜的圖。圖23:圖23為顯示將實(shí)施例的另一些熒光探針進(jìn)行雜交得到雙鏈時(shí)的熒光發(fā)光的圖。圖24:圖24為顯示實(shí)施例的再一些熒光探針的吸收鐠和發(fā)射譜的圖。圖25:圖25為顯示與實(shí)施例的熒光探針進(jìn)行了雜交的RNA鏈被RNaseH消化時(shí)的熒光變化的圖。圖26:圖26為觀測(cè)的改變互補(bǔ)DNA鏈與實(shí)施例的熒光探針的濃度比時(shí)熒光發(fā)光強(qiáng)度的變化。圖27:圖27是顯示實(shí)施例的印跡檢測(cè)中的熒光發(fā)光狀態(tài)的圖。圖28:圖28是將實(shí)施例的熒光探針導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)的微分干涉測(cè)定照片。圖29:圖29是將實(shí)施例的熒光探針導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)觀察熒光所拍攝的照片。圖30:圖30為顯示將圖28和圖29重疊的照片。圖31A:圖31A是將實(shí)施例的另一些熒光探針導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)觀察熒光所拍攝的照片。圖31B:圖31B是將實(shí)施例的再一些熒光探針導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)觀察熒光所拍攝的照片。圖32:圖32是顯示將與圖28-30相同的探針注入細(xì)胞核后熒光隨時(shí)間的變化的圖。圖33:圖33是將實(shí)施例的又一些熒光探針導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)觀察熒光所拍攝的照片。具體實(shí)施例方式以下，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明的化合物、核酸和標(biāo)記物本發(fā)明的化合物和核酸除了用所述化學(xué)式表示以外，沒(méi)有特別的限31制。如前所述，對(duì)其用途也沒(méi)有特別的限制，例如，可用作所述本發(fā)明的標(biāo)記物、或其合成原料或合成中間體。關(guān)于本發(fā)明的化合物、核酸和標(biāo)記物，更詳細(xì)的描述例如下文。本發(fā)明的化合物中，在所迷式(1)、(lb)和(1C)中，E優(yōu)選為例如具有DNA、修飾DNA、RNA、修飾RNA、LNA或PNA(肽核酸)的主鏈結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)。此外，在所述式(1)和(lc)中，[化27<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>所示的原子團(tuán)優(yōu)選為下式(2)-(4)中任一個(gè)所表示的原子團(tuán)，[化28<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>所述式(lb)中，R4r11(20)式(19)和(20)中，^表示-S-或-0-。R、R10、R"和R"各自獨(dú)立地表示氫原子、囟原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基或M。R"和R12中的一個(gè)表示^^合于所述式(1)、(lb)或(lc)中的l/或L2、所述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中的NH上的連接基團(tuán)，RH和R"中的另一個(gè)表示氫原子或低級(jí)烷基。本發(fā)明的化合物可為例如具有下式(10)所示的結(jié)構(gòu)的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽?；?7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>OY(10)式(10)中，E、Z11、Z12、Q、X和Y與所述式(1)中相同。所述式(1)、(lb)和(lc)中，B可具有天然核酸g骨架，但如前所述，也可具有人造核酸威基骨架。例如，B優(yōu)選為Py、Pyder.、Pu或Puder.所示的結(jié)構(gòu)，其中，所述Py為在下式(11)表示的六元環(huán)中在1位具有與E鍵:合的共價(jià)鍵、并且在5位具有與連接體部分發(fā)生鍵合的共價(jià)鍵的原子團(tuán)，所述Pyder.為由所述Py的六元環(huán)的全部原子中至少有一個(gè)由N、C、S或O原子替代所得的原子團(tuán)，所述N、C、S或O原子可適當(dāng)?shù)鼐哂须姾?、氫原子或取^^基，所述Pu為在下式(12)所示的稠環(huán)中在9位具有與E鍵合的共價(jià)鍵、并且在8位具有與連接體部分發(fā)生鍵合的共價(jià)鍵的原子團(tuán)，所述Puder.為所述Pu的五元環(huán)的全部原子中至少有一個(gè)由N、C、S或O原子替代所得的原子團(tuán)，所述N、C、S或O原子可適當(dāng)?shù)鼐哂须姾?、氫原子或取代基?lt;formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>本發(fā)明的化合物例如可為下式(13)或(14)所示的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>[化40]所述式(13)和(14)中，E、Z11、Z12、Q、X和Y與所述式(1)中相同。Py、Pyder.、Pu和Puder.如上文定義。本發(fā)明的化合物具有亞磷酰胺基時(shí)，所述亞磷酰胺基例如優(yōu)選以下式(15)表示。-P(OR22)N(R23)(R24)(15)式(15)中，R"為磷g團(tuán)的保護(hù)基，R"和RM為烷基或芳基。更優(yōu)選地，所迷式(15)中，R"為氰乙基，R"和R"中，所述烷基為異丙基，所述芳基為苯基。本發(fā)明化合物中，例如所述式(1)所示化合物可以為下式(21)所示化合物?！蓟?1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>(21)式(21)中，A表示氫原子或羥基。優(yōu)選A為氫原子。B表示腺噤呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧咬或尿嘧啶的殘基。例如，腺噤呤和鳥(niǎo)噤呤在8位上與雙^^鍵合，胞嘧啶、胸腺嘧咬或尿嘧咬在5位上與雙^^鍵合。Z"和Z"各自獨(dú)立地表示展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)、氫原子或氨基的保護(hù)基，特別優(yōu)選噻哇橙衍生物或噁唑黃衍生物的殘基。X表示氫原子，可用酸去保護(hù)的幾基保護(hù)基，或者單磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基。Y為氫原子、羥基保護(hù)基或亞磷酰胺基。所述式(21)所示化合物更優(yōu)選為例如下式(22)所示化合物。.2370.61)和T17([M.H.5108.37)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品。UV和熒光諉各自使用島津制作所乂>司的ShimadzuUV-2550(商品名)分光光度計(jì)和RF-5300PC(商品名)熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。熒光壽命通過(guò)由裝備有NanoLED-05A(商品名)的堀場(chǎng)制作所公司的小型高性能熒光壽命測(cè)定儀HORIBAJOBINYVONFluoroCube(商品名)進(jìn)行測(cè)定。雙鏈核酸的熔點(diǎn)(Tm)的測(cè)定在含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)中在2.5jiM的最終雙鏈濃度下進(jìn)行。樣本的吸光度在260nm波長(zhǎng)處測(cè)定，在10tl至卯lC的范圍內(nèi)，以0.5。C/min的速度加熱同時(shí)進(jìn)行追蹤。根據(jù)由此觀測(cè)的特性，將最初發(fā)生變化的溫度作為熔點(diǎn)Tm。吸收諉、熒光鐠和CD鐠的測(cè)定除非特別說(shuō)明，否則均在2,5nM的鏈濃度(單鏈或雙鏈)下，在含有l(wèi)OOmM氯化鈉的50mM鱗酸鈉緩沖液(pH=7.0)中，使用光路長(zhǎng)lcm的測(cè)量池進(jìn)行。激發(fā)和熒光發(fā)光的帶寬為1.511111。使用9，10-二苯基蒽作為對(duì)照物質(zhì)，以在乙醇中9，10-二苯基蒽的量子收率$F=0.95為基準(zhǔn)，計(jì)算熒光量子收率(①ir)。發(fā)光譜面積使用設(shè)備軟件通過(guò)積分算出。量子收率(①F)通過(guò)下式(1)算出。①F(s)/①F(R尸[A(s)/A(R)x[(Abs)(R/(Abs)(s)x[n(s)2/n(R)2(1)上式(l)中，①F(s)為樣本的熒光量子收率，①F(R)為對(duì)照物質(zhì)的熒光量子收率。A(s)為樣本的熒光譜面積，A(R)為對(duì)照物質(zhì)的熒光譜面積。(Abs)(s)為激發(fā)波長(zhǎng)下樣本溶液的光密度，(Abs)(R)為激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)照物質(zhì)溶液的光密度。n(s)為樣本溶液的折射率，n(R)為對(duì)照物質(zhì)溶液的折射率，以n(s)=1.333，n(R產(chǎn)l,383計(jì)算。實(shí)施例1-3根據(jù)以下方案1，合成(制造)了2個(gè)活性JL^各自被三氟乙?；Ｗo(hù)的化合物102和103，進(jìn)而，合成了亞磚酰胺104。[化53104方案1反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件(a)(i)N-幾基琥珀酰亞胺，EDC/DMF,(ii)三(2誦氨乙基)畫(huà)胺/CH3CN，(HOCF3COOEt，Et3N;(b)DMTrCl/他啶；(c)2-氰乙基-N，N，N，，N，-四異丙基亞磷酰胺，1H-四哇/CH3CN。6關(guān)于上述方案l，如下更詳細(xì)地描述。實(shí)施例1:2-[2-[N，N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨乙基氨基甲?；?(E)-乙烯基]-2，-脫氧尿苷(2-[2畫(huà)[N，N-bis(2-trifluoroacetamidoethy1)1-aminoethylcarbamoyl國(guó)(E)-vinyl)誦2'-deoxyuridine,4匕合物102)的合成起始原料(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2，-脫氧尿苷((E)國(guó)5-(2-carboxyvinyl)-2'-deoxyuridiiie，化合物101)根據(jù)Tetrahedron1987,43，20，4601-4607合成。即，首先，向430mg乙酸把(II)(FW224.51)和1.05g三苯基膦(FW262.29)中添加71mL1,4-二噁烷，再添加7.1mL三乙胺(FW101.19，d=0.726),在70C加熱攪拌。反應(yīng)溶液從紅褐色變化到黑褐色時(shí)，加入14.2g2，-脫氧-5-硤尿苷(FW354.10)和7.0mL丙烯酸甲酯(FW86.09，d=0.956)在1，4-二噁烷中的懸濁液，在125C加熱回流l小時(shí)。之后，在仍較熱時(shí)過(guò)濾，用甲醇洗滌剩余物，回收濾液。將該濾液的溶劑通過(guò)減壓蒸餾去除后，用硅膠柱純化生成物(5-10%甲醇/二氯甲烷)。減壓蒸餾去除收集到的級(jí)分的溶劑，將剩余的白色固體減壓干燥。向該干燥的固體中加入約100mL的超純水，加入3.21g氫氧化鈉(FW40.00)，在25t:攪拌過(guò)夜。然后，加入濃鹽酸酸化溶液，濾出生成的沉淀，用超純水洗滌，減壓干燥。由此獲得作為白色粉末的8.10g(產(chǎn)率68%)目標(biāo)化合物(化合物101)。此外，通過(guò)iHNMR測(cè)定值與參考值一致這一事實(shí)確認(rèn)了所述白色粉末是目標(biāo)化合物101。此外，13CNMR測(cè)定值如下記載。(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2，-脫氧尿苷(化合物101):13CNMR(DMSO-d6):8168.1，161.8，149.3，143.5，137.5，117.8，108.4，87.6，84.8，69.7，60.8，40.1.然后，將1.20g(E)-5-(2-^S乙烯基)-2，-脫氧尿苷101(分子量298.25)、925mgN-羥基琥珀酰亞胺(分子量115.09)和1.54gl-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(分子量191.70)加入放入了攪拌子的回收燒瓶(大久:7，^3)中，加入20mLDMF，在25"C攪拌16小時(shí)。加入約lmL乙酸，加入300mL二氯甲烷和100mL超純水，劇烈攪拌。除去水層，再加入100mL超純水，以同樣的方式洗滌兩次。濾出生成的沉淀，用二氯甲烷洗滌，減壓干燥。蒸餾去除濾液中的溶劑，向生成的沉淀中加入二氯曱烷，與上文相同地回收沉淀。合并所有回收的沉淀，將其懸浮在80mL乙腈中，劇烈攪拌。向其中一次性加入3.0mL三(2-氨乙基)胺(分子量146.23,d=0.976),在25"C再攪拌10分鐘。然后，加入4.8mL三氟乙酸乙酯(分子量142.08，d=1.194)，再加入5.6mL三乙胺(分子量101.19，d=0.726)，在25t:攪拌3小時(shí)。蒸鎦去除溶劑，用硅膠柱純化(5-10%MeOH/CH2Cl2)。蒸餾去除溶劑，用少量丙酮溶解，加入乙醚即生成白色沉淀，過(guò)濾，用乙醚洗滌后，減壓干燥，獲得884mg(33.5%)目標(biāo)物質(zhì)(化合物102)。此外，在除了將原料、溶劑等的使用量，反應(yīng)時(shí)間和步驟進(jìn)行一些改變以外，以與上述方法相同的方法進(jìn)行合成時(shí)，產(chǎn)率可提高至37%。即，將597mg(2.0mmo1)(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2，-脫氧尿苷101(分子量298.25)、460mg(4.0mmo1)N-羥基琥珀酰亞胺(分子量115.09)和767mg(4.0mmo1)l-乙基-3-(3-二曱基氨丙基)碳二亞胺(分子量191.70)加入放入了攪拌子的燒瓶中，加入5.0mLDMF，在25X:攪拌3小時(shí)。加入約0.5mL乙酸，加入100mL二氯甲烷和100mL超純水，劇烈攪拌。濾出生成的沉淀，用水洗滌，減壓干燥過(guò)夜。將獲得的白色剩余物懸浮在50mL乙腈中，劇烈攪拌。向其中一次性加入3.0mL(20mmo1)三(2-氨乙基)胺(分子量146.23,d=0.976)，在25"C再攪拌10分鐘。然后，加入4.8mL三氟乙酸乙酯(分子量142.08,d=1.194)，再加入5.6mL(40mmo1)三乙胺(分子量101.19,d=0.726)，在25C攪拌16小時(shí)。蒸鎦去除溶劑，用硅膠柱純化(5-10y。MeOH/CH2Cl2)。蒸餾去除溶劑，用少量丙酮溶解，加入乙醚即生成白色沉淀，過(guò)濾，用乙醚洗滌后，減壓干燥，獲得作為白色粉末的453mg(37%)目標(biāo)物質(zhì)(化合物102)。以下顯示了化合物102的儀器分析值，此外，圖2中顯示了iHNMR鐠圖。2-[2-[N，N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)〗-氨乙基氨基曱?；?(E)-乙烯基-2，-脫氧尿苷(化合物102):iHNMR(CD30D):38.35(s，lH)，7.22(d，J=15.6Hz，1H)，7.04(d，J=15.6Hz，1H)，6.26(t，J=6.6Hz，1H)，4.44-4.41(m，1H)，3.96-3.94(m，1H)，3.84(dd，J=12.2，2.9Hz，1H)，3.76(dd，J=12.2,3.4Hz，1H)，3.37-3.30(m，6H)，2.72-2.66(m，6H)，2.38-2.23(m，2H).13CNMR(CD3OD):8169.3，163.7，159.1(q，J=36.4Hz)，151.2，143.8，134.3，122.0，117.5(q，J=286Hz)，110.9，89.1，87.0，71.9，62.5，54.4，53.9，41.7，38.9，38.7.C22H29F6N608([M+H+)67的HRMS(ESI)計(jì)算值為619.1951,實(shí)測(cè)值為619.1943。實(shí)施例2:5'-0-二甲氧基三苯甲基-(2-[2-[N，N-二(2-三氟乙酰^^乙基)-氨乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2，-脫氧尿苷(5'-0誦DMTr誦(2-[2-[N，N-bis(2國(guó)trifluoroacetamidoethyl)隱aminoethylcarbamoyl-(E)畫(huà)vinyl)畫(huà)2，-deoxyuridine，化合物103)的合成將化合物102的5，-羥基用二曱氧基三苯甲基(DMTr)基保護(hù)，獲得化合物103。即，首先，將618mg化合物102(分子量618.48)和373mg氯化4，4，-二甲氧基三苯甲基(分子量338.83)加AJt入了攪拌子的燒瓶中，加入10mL吡咬，在25C攪拌16小時(shí)。加入少量水，蒸餾去除溶劑，用硅膠柱進(jìn)行純化(2-4%MeOH，l%Et3N/CH2Cl2)。蒸鎦除去含有目標(biāo)化合物103的級(jí)分中的溶劑，獲得735.2mg(79.8%)目標(biāo)物質(zhì)(化合物103)。以下顯示了化合物103的儀器分析值，此夕卜，圖3中顯示了iHNMR譜圖。5，-0-二甲氧基三苯甲基-(2-[2-N，N-二(2-三氟乙酰M乙基)-氨乙基]氮基曱?；?(E)-乙烯基)-2，-脫氧尿苷(化合物103):iHNMR(CD3OD):87.91(s，1H)，7.39-7.11(m，9H)，7.02(d，J=15.6Hz，1H)，6.93(d，J=15.6Hz，1H)，6.80-6.78(m，4H)，6.17(t，J=6.6Hz，1H)，4.38-4.35(m,1H)，4.06-4.04(m,1H)，3.68(s，6H)，3.32-3.22(m，8H),2.66-2.55(m，6H)，2.40(ddd，J=13.7，5.9，2.9Hz，1H)，2.33-2.26(m，1H).13CNMR(CD3OD):8168.9，163.7，160.1，159.1(q，J=36.9Hz)，151.0,146.1，143.0,137.0，136.9，134.1，131.24，131.16，129.2，128.9，128.0，122.5，117.5(q，J=286.7Hz)，114.2，110.9，88.1，87.9，87.6，72.6，65.0,55.7，54.2，53.9,41.7，38.9，38.6.C^H^FfiNfiOK)([M+H+)的HRMS(ESI)計(jì)算值為921.3258，實(shí)測(cè)值為921.3265。實(shí)施例3:5，-0-(二甲氧基三苯甲基)-(2-[2-[N，N-二(2-三氟乙酰氨基乙基)I-氨乙基氨基甲?；?(E)-乙烯基)-2，-脫氧尿苷，3，-(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)1-亞磷酰胺(5'-0畫(huà)DMTr國(guó)(2-[2-[N，N-bis(2醒trifluoroacetamidoe也yl)I-aminoe也ylIcarbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine，3，-[(2-cyanoethyl)-(N，N畫(huà)diisopropyl)-phosphoramidite，化合物104)的合成將188mg(0.20mmol)化合物103(分子量920.85)與CH3CN共沸，加入28.6mg(0.40mmol)1H-四喳(分子量70.05)，用真空泵吸氣干燥過(guò)夜。加入5.1mLCH3CN,溶解試劑后攪拌，一次性加入194pL(0.60mmol)2-氰乙基-N，N,N，，N，-四異丙基亞磷酰胺(分子量301.41，d=0.949)，在25C攪拌2小時(shí)。加入50mL乙酸乙酯與50mL飽和碳酸氫鈉水溶液的混合物，分液，將有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌后，用疏酸鎂干燥。通過(guò)過(guò)濾去除硫酸鎂之后，蒸悔去除溶劑。將該通過(guò)分液獲得的粗產(chǎn)物與CHsCN共沸后，假設(shè)所獲得生成物(化合物104)的產(chǎn)率為100%，從而制備0.1M的CH3CN溶液，用于DNA合成。此外，根據(jù)所述粗產(chǎn)物的"PNMR(CDCls)和HRMS(ESI)確認(rèn)獲得了化合物104。其值如下所示。化合物104:31PNMR(CDC13)3149.686，149.430;C52H64F6N8OuP([M+H^的HRMS(ESI)計(jì)算值為1121.4336，實(shí)測(cè)值為1121.4342。實(shí)施例4:DNA寡聚物的合成[化54]方案2使用化合物104借助于DNA自動(dòng)合成儀的寡聚DNA合成以1jimol規(guī)模的常規(guī)亞躊酰胺法(DMTrOFF)進(jìn)行，合成了稱為5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(13聚物，X的結(jié)構(gòu)如化學(xué)式105所示)69的序列(SEQIDNO.1)的DNA寡聚物。去保護(hù)通過(guò)濃氨水(28質(zhì)量％)在55t!進(jìn)行16小時(shí)。用SpeedVac揮發(fā)氨，通過(guò)0.45jim過(guò)濾器后，將截留出的DNA寡聚物通過(guò)反相色語(yǔ)進(jìn)行分析，將約10.5分時(shí)出現(xiàn)的峰進(jìn)行純化(CHEMCOBOND5國(guó)ODS國(guó)H(商品名)；10x150mm,3mL/min，5-30%CH3CN/50mMTEAA緩沖液pH7(20分鐘)，在260nm處檢測(cè))。純化的生成物用MALDITOF質(zhì)譜的負(fù)模式測(cè)定分子量，確認(rèn)具有由所述5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，序列(13聚物，X的結(jié)構(gòu)如化學(xué)式105所示)預(yù)期的分子量(基于c134H176n52076P12,計(jì)算值4102.8)([M-H廠實(shí)測(cè)值為4101.9，計(jì)算值為4101.8)。圖4中顯示了MALDITOF質(zhì)譜圖。此夕卜，以與上述方法相同的方法可合成5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，序列(13聚物，X的結(jié)構(gòu)如化學(xué)式105所示)，所不同的是用濃氨水去保護(hù)或者在55t:進(jìn)行4小時(shí)后再在25匸進(jìn)行16小時(shí)，在反相HPLC中TEAA(三乙胺乙酸酯)緩沖液(pH7)的濃度為0.1M,并且在反相hplc中使展開(kāi)時(shí)間為30分鐘以上。并且，用同樣的方法，可合成表l所示作為各ODN原料的DNA(含有化學(xué)式105表示的核苷酸)。為了測(cè)定合成的各DNA的濃度，將純化的各DNA用牛小腸堿性磷酸酶(50U/mL)、蛇4^酸二酯酶(0.15U/mL)和Pl核酸酶(50U/mL)在25。C用16小時(shí)完全消化。將得到的消化液用CHEMCOBOND5隱ODS-H(商品名)柱(4.6x150mm)的HPLC分析。此時(shí)，使用0.1MTEAA(pH7.0)作為展開(kāi)液，流速為1.0mL/min。所述合成的DNA的濃度通過(guò)與含有各自為O.lmM濃度的dA、dC、dG和dT的標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積進(jìn)行比較而確定。并且，所述合成的DNA也通過(guò)MALDITOF質(zhì)譜確定。以下顯示該質(zhì)量分析值。此外，[105表示在該位置插入有化學(xué)式105所示的核苷酸。CGCAAT[105]TAACGC，C134H177N52076P12([M+H^計(jì)算值4103.8，實(shí)測(cè)值4107.0;TttttT[105TTTTTT，c138H187n30O90P12([M+H+)計(jì)算值4077.8，實(shí)測(cè)值4076.9;TGAAGGGCTT[105]TGAACTCTQC205H26sN77O122P19([M+H1計(jì)算值6348.2，實(shí)測(cè)值6348.7;GCCTCCT[105CAGCAAATCC[105ACCGGCGTGC285H376N108O169P27([M+H+)計(jì)算值8855.0，實(shí)測(cè)值8854.8;CCTCCCAAG[105GCTGGGAT[105AAAGGCGTGC289H376N1160168P27(M+HO計(jì)算值89".1，實(shí)測(cè)值9002.2.實(shí)施例5:含有具有2個(gè)氨基的核苷酸的DNA寡聚物的生物素修飾通過(guò)使合成的DNA寡聚物5'-d(CGCAATXTAACGC)-3，(化合物105，使用所述化合物4作為X)與生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，從而使2個(gè)氨基用2個(gè)生物素標(biāo)記(上述方案3)。即，首先，將30jLiL5，誦d(CGCAATXTAACGC)-3，(化合物105，鏈濃度320MM)、10jiLNa2C03/NaHC03緩沖液(1M，pH9.0)與60jaLH20混合，加入100|iL生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯的DMF溶液(20mM)，充分混合。在25X:靜置16小時(shí)后，加入800/iLH20，通過(guò)0.45|im的過(guò)濾器，將在反相HPLC約14分鐘處出現(xiàn)的峰進(jìn)行純化(CHEMCOBOND5-ODS國(guó)H;10x150mm，3mL/min，5-30%CH3CN/50mMTEAA緩沖(20分)，在260nm處檢測(cè))。將通過(guò)該HPLC純化得到的生成物通過(guò)MALDITOF質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在4554.3處觀察到峰。該峰值與通過(guò)2個(gè)氨基與2個(gè)生物素分子反應(yīng)得到的目標(biāo)生成物6的分子量4555.4(由實(shí)施例6:在1分子中2個(gè)位置上具有蓉喳橙衍生的結(jié)構(gòu)的化合物的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>方案4如上述方案4，合成了在1分子中的2個(gè)位置上具有噻哇橙衍生的結(jié)構(gòu)的DNA寡聚物(寡核苷酸)110。更詳細(xì)的如下文所述。蓉喳橙衍生物107的合成參考OrganicLetters2000，6，517-519，如下述方案5所述進(jìn)行。[化58話化的染緩沖液，DMF首先，根據(jù)上述文獻(xiàn)的記載合成了碘化N-曱基會(huì)啉鎗(化合物111)。具體而言，在42mL無(wú)水二噁烷中加入會(huì)啉2.4mL和碘甲烷4mL，在150C攪拌l小時(shí)后，通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用乙醚和石油醚洗滌，干燥，獲得碘化N-甲基奎啉鐵(化合物111)。(2)溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鐵(化合物112)的合成將8mL2-甲基苯并瘞唑(FW149.21，d=1.173)和9.4g5-溴戊酸(FW181.03)在110"C攪拌16小時(shí)。將粗產(chǎn)物冷卻至室溫，將生成的固體懸浮在20mL甲醇中，再加入40mL乙醚。濾出生成的沉淀，用二噁烷進(jìn)行洗滌直至2-曱基苯并噻唑的氣味消失，再用乙醚洗滌，減壓干燥獲得9.8g白色粉末。測(cè)定該白色粉末的^NMR，結(jié)果為2位被烷基化的目標(biāo)物溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎗(化合物112)和2位未被烷基化的溴化3-(4-羧丁基)-苯并緣唑鎗的混合物。質(zhì)子峰之比為未烷基化的物質(zhì):烷基化的物質(zhì)=10:3。該粗產(chǎn)物直接用于后續(xù)反應(yīng)。(3)溴化1-曱基-4-[{3-(4-羧丁基)-2(311)-苯并亞噻喳基}曱基喹啉(化合物107)的合成在3.6ml三乙胺(FW101.19，d-0.726)的存在下，將在上述(2)中獲得的含有溴化3-(4-羧丁基)-2-曱基苯并噻唑鎗(化合物112)的粗產(chǎn)物2.18g與700mg的橫化N-甲基全啉(化合物111)(FW271.10)在10iiiL的二氯甲烷中于25。C攪拌2個(gè)小時(shí)。隨后，加入50ml乙醚，過(guò)濾生成的沉淀，乙醚洗滌，減壓干燥。將該沉淀懸浮于50mL超純水中、過(guò)濾、超純水洗滌、減壓干燥。再將上述沉淀懸浮于50mL乙腈中，過(guò)濾、用乙腈洗滌，減壓干燥從而獲得307.5mg的紅色粉末(產(chǎn)率為25.3%)。將力NMR讒與參考值相對(duì)比確定，此紅色粉末即為目的產(chǎn)物(化合物107)。此外，溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑鎿(化合物112)以及溴化1-曱基-4-(3-(4-羧丁基)-2(3H)-苯并亞噻唑基》曱基I會(huì)啉(化合物107)還能夠通過(guò)以下方式合成。即，首先，將11.7mL(92mmol)的2-曱基苯并噻唑(FW149.21,d-1.173)和13.7g(76mmol)的5-溴戊酸(FW181.03)在150。C下攪拌1個(gè)小時(shí)。在室溫下冷卻粗產(chǎn)物，將生成的固體懸浮于50ml甲醇中，再加入200ml乙醚。生成的沉淀經(jīng)過(guò)濾、乙醚洗滌、減壓干燥從而獲得19.2g淡紫色粉末。該粉末為目的化合物112(溴化3-(4-羧丁基)-2-曱基苯并噻唑錄)和溴化2-甲基苯并噻唑鎿的混合物？HNMR(在DMSO-d6中)測(cè)定該混合物，由8.5ppm處的峰(來(lái)自于目的化合物112)和8.0ppm處的峰(來(lái)自于溴化2-甲基苯并瘞唑鐵)的峰面積比計(jì)算出目的化合物112的產(chǎn)量為9.82g(14mmo1，32%)。該混合物(粗產(chǎn)物)無(wú)需提純即可在隨后的反應(yīng)中使用。另外，將5-溴戊酸換成4-溴丁酸，以相同的方法合成具有碳原子數(shù)n=3的連接體(連接于氣基的聚亞甲基鏈)的溴化3-(4-羧丙基)-2-曱基苯并噻唑鐵，所得產(chǎn)率為4%。此外，將5-溴戊酸換成6-溴己酸，以相同的方法合成具有碳原子數(shù)n=5的連接體(連接于羧基的聚亞甲基鏈)的溴化3-(4-羧戊基)-2-曱基苯并噻唑鎗，所得產(chǎn)率為35%。再者，將5-溴戊酸換成7-溴庚酸，以相同的方法合成具有碳原子數(shù)n=6的連接體(連接于羧基的聚亞甲基鏈)的溴化3-(4-羧己基)-2-甲基苯并噻唑鎗，所得產(chǎn)率為22%。隨后，向3.24g含有化合物112(溴化3-(4-羧丁基)-2-甲基苯并噻唑錄)和溴化2-甲基苯并噻唑鐵的上述混合物(粗產(chǎn)物)中添加1.36g(5.0mmo1)(50mmol)的三乙胺(FW101.19，d-0.726)以及100mL的二氯甲烷，從而得到透明的溶液。于25。C將該溶液攪拌16小時(shí)。隨后，減壓蒸餾除去溶劑。向殘留物中加入丙酮(200mL)，過(guò)濾所得沉淀，隨后丙酮洗滌。減壓干燥由此獲得的殘留物，用蒸餾水(50mL)洗滌干燥后的紅色殘留物。再次過(guò)濾此殘留物，蒸餾水洗滌，減壓干燥，獲得了紅色粉末狀目的產(chǎn)物(化合物107)(654mg，1.39mmo1，28%)。將illNMR譜與參考值相比較確認(rèn)了該紅色粉末即為目的產(chǎn)物(化合物107)。下文示出了！11NMR和13CNMR(DMSO-d6)的峰值以及HRMS(ESI)的測(cè)量值。此外，圖6示出了化合物107的&NMR譜(DMSO誦d6)?；衔?07,HNMR(DMSO畫(huà)d6):88.74(d，J=8.3Hz，1H)，8.51(d，J=7.3Hz，1H)，7.94-7.89(m，3H),7.74-7.70(m，1H),7'65(d，J=8.3Hz，1H)，7.55-7.51(iil1H)，7.36國(guó)7,32(m，1H)，7.21(d，J=7.3Hz，1H)，6.83(s，IH)，4.47(t，J=7.1Hz，2H)，4.07(s，3H)，2.22(t，J=6.6Hz，IH)，1.77-1.63(m，4H);"CNMR(DMSO畫(huà)d6,60。C)8174.6，158.8,148.4，144.5，139.5，137.6,132.7，127.9，126.8，125.5，124.1，123.7，123.6，122.4，117.5，112.6，107.6，87.4，45.6，42.0，35.5，26.2，22.3;C23H23N202S([M.Br]^的HRMS(ESI)計(jì)算值為391.1480，實(shí)測(cè)值為391.1475。此外，采用與制備上述化合物107相同的方法，由上述溴化3-(4-羧丙基)-2-甲基苯并噻唑鎿和溴化2-曱基苯并噻唑鎿的混合物合成了具有碳原子數(shù)n=3的連接體(連接于羧基的聚亞甲基鏈)的溴化4-((3-(3-羧丙基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-曱基會(huì)啉，所得產(chǎn)率為43%。下文示出了儀器分析值。溴化4-((3-(3-羧丙基)苯并問(wèn)噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-甲基壹啉i冊(cè)MR(DMSO畫(huà)d6)S8.85(d，J=8.3Hz，1H)，8.59(d，J=7.3Hz，1H)，8.02.7.93(m，3H)，7.78.7.70(m，2H)，7.61.7.57(m，1H)，7.42.7.38(m,1H)，7.31(d，J=6.8Hz，1H)，7.04(s，1H)，4.47(t，J=8.1Hz，2H)，4.13(s，犯)，2.52.2.48(m，2H)，1.99.1.92(m，2H);13CNMR(DMSO-d6，60°C)S174.3，158.9，148.6，144.5，139.5，137.7，132.7，127.9，126.7，125.6，124.1，124.0，123.7，122.5，117.5，112.5，107.6，87.7，45.6，42.0，31.6，22.4;C22H21N202S([M，Brl+)的HRMS(ESI)計(jì)算值為377.1324，實(shí)測(cè)值為377.1316。此外，采用與制備上述化合物107相同的方法，由上述溴化3-(4-羧戊基)-2-曱基苯并噻唑鎿和溴化2-曱基苯并噻唑鎿的混合物合成了具有碳原子數(shù)n=5的連接體(連接于氣基的聚亞甲基鏈)的溴化4-((3-(3-羧戊基)苯并間噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-曱基會(huì)啉，所得產(chǎn)率為26%。下文示出了儀器分析值。溴化4-((3-(3-羧戊基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-甲基會(huì)啉力NMR(DMSO-d6)38.70(d,J=8.3Hz,1H)，8.61(d，J=6.8Hz，1H)，8.05.8.00(m，3H),7.80.7.73(m,2H)，7.60.7.56(m，1H),7.41.7.35(m，2H)，6.89(s，1H)，4.59(t，J=7JHz，2H)，4.16(s，3H)，2.19(t，J=7.3Hz，1H)，1.82丄75(m，2H)，1.62丄43(m，4H);"CNMR(DMSO-d6，60°C)8174.5，159.0，148.6，144.7，139.7，137.8，132.9，127.9，126.9，125.2，124.2，123.8，123.6，122.6，117.8，112.6,107.7，87.4，45.6，42.1，36.0，26.3，25.9,24.9;C24H25N202S([M,Br]+)的HRMS(ESI)計(jì)算值為405.1637，實(shí)測(cè)值為405.1632。此外，采用與制備上述化合物107相同的方法，由上述溴化3-(4-羧己基)-2-曱基苯并噻唑鑰和溴化2-曱基苯并噻唑鎗的混合物合成了具有碳原子數(shù)n=6的連接體(連接于氛基的聚亞曱基鏈)的溴化4-((3-(3-羧己基)苯并間噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-曱基全啉，所得產(chǎn)率為22%。下文示出了儀器分析值。溴化4-((3-(3-羧己基)苯并[d噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-甲基會(huì)啉iH匪R(DMSO-d6)S8.72(d，J=8.3Hz，1H)，8.62(d，J=6.8Hz，1H)，8.07.8.01(m，3H),7.81.7.75(m，2H)，7.62.7.58(m，1H),7.42.7.38(m，2H)，6.92(s，1H)，4.61(t，J=7.3Hz，2H)，4.17(s，3H)，2.18(t，J=7.3Hz,1H)，1.82.1.75(m，2H)，1.51.1.32(m，6H);"C醒R(DMSO-d6，60°C)S174.0，159.1，148.6，144.7，139.8，137.8，132.9，127.9，126.8，125.0，124.2，123.8，123.6，122.6，118.0，112.7，107.8，87.4，45.5，42.1，33.4，27.9，26.4，25.5，24.1;C25H27N202S([M.Br]十)的HRMS(ESI)計(jì)算值為419.1793,實(shí)測(cè)值為419.1788。(4)N-羥基琥珀酰亞胺酯109的合成將9.4mg(20nmol)的溴化l-甲基-4-[(3-(4-羧丁基)-2(3H)-苯并亞噻唑基}甲基會(huì)啉(化合物107)(FW471.41)、4.6mg(40jimol)的N-羥基琥珀酰亞胺(化合物108)(FW115.09)和7.6mg(40jimol)的EDC(l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(FW191.70)在lmL的DMF中于25。C攪拌16小時(shí),獲得了染料(化合物107)的g被活化的N-羥基琥珀酰亞胺酯(化合物109)。此反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)需純化，將反應(yīng)溶液(染料20mM)直接用于與寡聚DNA(寡核苷酸)的反應(yīng)。此外，除了使用具有碳原子數(shù)不同的連接體(聚亞甲基鏈)的化合物替代化合物107用作原料外，采用同制備化合物109相同的方法，合成具有碳原子數(shù)11=3的連接體(聚亞甲基鏈)的溴化4-((3-(4-(琥珀酰亞胺氧基)-4-氧代丁基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-曱基會(huì)啉。另外，還以同樣的方式合成了具有碳原子數(shù)n=5的連接體(聚亞甲基鏈)的溴化4-((3-(4-(琥珀酰亞胺氧基)-4-氧代己基)苯并[d噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-甲基喹啉和具有碳原子數(shù)n=6的連接體(聚亞甲基鏈)的溴化4-((3-(4-(琥珀酰亞胺氧基)-4-氧代庚基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-l-甲基奮啉。(5)以2個(gè)噻喳橙分子修飾的DNA寡聚物(寡核苷酸IIO)的合成采用同上述實(shí)施例4一樣借助于DNA自動(dòng)合成儀的常規(guī)方法合成了具有兩個(gè)活性氨基的DNA寡聚物(寡核苷酸)105?；衔?05的序列為與實(shí)施例4相同的5，-d(CGCAATXTAACGC)-3'(X為前述化合物104)。隨后，使該DNA寡聚物(寡核苷酸)105與N-羥基琥珀酰亞胺酯(化合物109)反應(yīng)，合成了在一個(gè)分子的兩個(gè)位置具有由噻哇橙衍生的結(jié)構(gòu)的DNA寡聚物(寡核苷酸)110。即，首先，將30fiL的5'畫(huà)d(CGCAATXTAACGC)-3'(化合物105,鏈濃度為320jiM)、10jiL的Na2CCVNaHC03緩沖液(lM，pH9.0)與60nL的H20混合，然后加入IOOjiLN-羥基琥珀酰亞胺酯(化合物109)的DMF溶液(20mM)，充分混合。于25。C靜置16小時(shí)，然后加入800jiLH20，通過(guò)0.45jim的濾器，并純化反向色諉中大約14,5分鐘出現(xiàn)的峰(CHEMCOBOND5-ODS-H10x150mm，3mL/min，5-30%CH3CN/50mMTEAA緩沖液(20分鐘)，于260nm檢測(cè))。圖7示出了反向HPLC圖。分離出并純化以箭頭所示峰表示的級(jí)分。通過(guò)MALDITOF質(zhì)鐠的負(fù)模式測(cè)定該HPLC純化所得生成物，發(fā)現(xiàn)在4848.8處的峰，確定其為DNA寡聚物(寡核苷酸)110。圖8示出了DNA寡聚物(寡核苷酸)IIO的MALDITOFMASS語(yǔ)。在該圖中，箭頭示出由上述純化所得生成物產(chǎn)生的質(zhì)量峰(4848.8)。該峰值與[M^-3H+r的計(jì)算值4848,8相一致，所述[M^-3H+-由具有2個(gè)正電荷的DNA寡聚物(寡核苷酸)110的分子M(d8。H22()N56O78PuS2)除去3個(gè)質(zhì)子獲得。此外，左右兩側(cè)的峰為由作為標(biāo)準(zhǔn)品加入的DNAT8聚體和T18聚體產(chǎn)生的峰。實(shí)施例7:DNA寡聚物(寡核苷酸)IIO作為熒光探針的使用將實(shí)施例6純化得到的DNA寡聚物(寡核苷酸)110(具有2個(gè)染料分子的DNA)脫鹽、冷凍干燥，隨后制備為水溶液，通過(guò)UV吸收測(cè)定濃度(X與T近似)。此后，在鏈濃度為2,5nM、磷酸緩沖液為50mM(pH7.0)并且NaCl為lOOmM的條件下，在熒光探針(DNA寡聚物llO)為單鏈狀態(tài)時(shí)、為DNA-DNA雙螺旋時(shí)以及為DNA-RNA雙螺旋時(shí)，分別進(jìn)行UV測(cè)量。圖9示出了這三個(gè)樣本的鐠。在該圖中，虛線表示熒光探針為單鏈狀態(tài)的鐠，粗線表示DNA-DNA雙螺旋的諳，細(xì)線表示DNA-RNA雙螺旋的鐠。由圖示可知，由于形成了雙螺旋，因而500nm附近的UV吸收的最大波長(zhǎng)發(fā)生了移動(dòng)。此外，在圖9以及全部其他UV吸收?qǐng)D鐠中，橫軸表示波長(zhǎng)(nm)，縱軸表示吸光度。隨后，同樣在鏈濃度為2.5jiM、磷酸緩沖液為50mM(pH7.0)并且NaCl為100mM的條件下，通過(guò)48811111的激發(fā)光(帶寬1.511111)激發(fā)，隨后進(jìn)行熒光測(cè)量。圖10分別示出了熒光探針為單鏈狀態(tài)(虛線)、DNA-DNA雙螺旋(粗線)和DNA-RNA雙螺旋(細(xì)線)的三個(gè)樣本的鐠。由圖示可知，與單鏈狀態(tài)的熒光探針在530nm的熒光強(qiáng)度相比，DNA-DNA的熒光強(qiáng)度增加了15倍，DNA-RNA的增加了22倍。此外，圖10以及全部其他熒光發(fā)光圖鐠以及激發(fā)圖譜中，橫軸表示波長(zhǎng)(nm)，縱軸表示發(fā)光強(qiáng)度。另外，采用510nm的激發(fā)光來(lái)代替488nm的激發(fā)光，也獲得了相同的結(jié)果。圖ll示出其譜。實(shí)施例8:具有長(zhǎng)度發(fā)生種種變化的連接體的化合物的合成以及作為熒光探針的使用合成了連接體長(zhǎng)度n發(fā)生種種變化的下述化學(xué)式113表示的化合物(DNA寡聚物)。合成同上述實(shí)施例l-4和6，所不同的是為滿足連接體的長(zhǎng)度，而將原料5-溴戊酸換成碳原子數(shù)(鏈長(zhǎng))發(fā)生改變的化合物。在本實(shí)施例中，下述化合物113的序列為5'-d(CGCAATXTAACGC)-3，(X為染料引入部分)。此外，同實(shí)施例7—樣，將它們分別用作熒光探針，通過(guò)熒光測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)性能。結(jié)果證實(shí)，若在下文所示連接體的長(zhǎng)度范圍內(nèi)，則與單鏈探針相比，通過(guò)與目標(biāo)核酸雜交，熒光增加大約10倍或者10倍以上。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage80</formula>93800)5370.0193-無(wú)探針隱DNA雙鏈505(145000)5290.1377.166探針國(guó)RNA雙鏈506(139000)5290.1618.354n=4探針單鏈479(156000)509(104000)5370.0105-無(wú)探針-DNA雙鏈509(17卯00)5290.11010.565探針-RNA雙鏈509(171000)5290.11611.052n=5探針單鏈480(139000)510(107000)5380.0131-無(wú)探針-DNA雙鏈508(172000)5290.1239.467探針-RNA雙鏈508(162000)5290.1269.651n=6探針單鏈479(13卿0)509(93300)5360.0122-無(wú)探針掘A雙鏈509(164000)5280.12210.065探針-RNA雙鏈511(162000)5300.12910.6525，誦d(CGCAATTTAACGC)畫(huà)3,/5，-d(GCGTTAAATTGCG)-3'Tm(。C)585,-d(CGCAATTTAACGC)-3'/5'-r(GCGUUAAAUUGCG)-3'Tm(。C)46測(cè)定條件探針(化合物113)2.5jiM、磷酸緩沖液50mM(pH7.0)、NaCl100mM、互補(bǔ)鏈2.5nM熒光的最大波長(zhǎng)是用48811111(帶寬1.511111)的光'^1時(shí)的值。量子收率為將9，10-二苯基蒽用作參照物計(jì)算得到的。圖12示出了實(shí)施例8中連接體長(zhǎng)度n-4時(shí)的吸收譜。虛線為單鏈的譜,實(shí)線為DNA-DNA鏈的鐠，點(diǎn)劃線為DNA-RNA鏈的譜。觀察到在400-600nm的吸收時(shí)，單鏈狀態(tài)時(shí)的吸收帶與雜交后的吸收帶相比出現(xiàn)在短波長(zhǎng)側(cè)，明確表明通過(guò)單鏈狀態(tài)的染料二聚體形成了H-聚集體。另外，圖13—并示出了實(shí)施例8中連接體長(zhǎng)度n-4時(shí)的激發(fā)譜和熒光發(fā)譜。在該圖中，左側(cè)(短波長(zhǎng)側(cè))的曲線表示m譜，右側(cè)(長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè))的曲線表示熒光發(fā)光譜。另外，在該圖中，圖例的括號(hào)內(nèi)分別表示、m譜中的參照熒光發(fā)光的波長(zhǎng)(熒光的；ax)、熒光發(fā)光譜中的激發(fā)波長(zhǎng)。在激發(fā)鐠和熒光發(fā)光鐠中，單鏈的發(fā)光強(qiáng)度最弱，DNA-DNA鏈的與4^目比稍強(qiáng)，DNA-RNA鏈的最強(qiáng)。由氣復(fù)鐠可知，與熒光發(fā)光相關(guān)的吸收只有圖12中的長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的吸收帶，而短波長(zhǎng)側(cè)的吸收不與熒光發(fā)光相關(guān)。換言之，明確表明，通過(guò)激子效應(yīng)，可以對(duì)熒光發(fā)光進(jìn)行控制。因此，熒光發(fā)光在雜交后增強(qiáng)，而在單鏈狀態(tài)下則極其微弱。因此，可以清楚地區(qū)分雜交前后的狀態(tài)。實(shí)施例9合成了連接體長(zhǎng)度n發(fā)生種種變化的以下述化學(xué)式114表示的一個(gè)分子中僅含有一個(gè)染料結(jié)構(gòu)的化合物(DNA寡聚物)。合成同上述實(shí)施例1-4和6,所不同的是為滿足連接體的長(zhǎng)度，將原料5-溴戊酸換成碳原子數(shù)(鏈長(zhǎng))發(fā)生改變的化合物，并且在化合物102的合成中，使用雙(2-氨乙基)曱胺代替三(2-氨乙基)胺。能夠以同樣的方式分別合成n-3、4、5、6的化合物?；?0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage82</formula>更具體而言，依據(jù)下述方案合成。下述方案雖為11=4的情況，但是在n為其他數(shù)值的情況下同樣也可以合成?；?1(E)-5-(3-(2-(N-甲基-N-(2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)乙基)氨基)乙基氨基)-3-氧代丙-1-烯基)-2，-脫氧尿苷((E)畫(huà)5畫(huà)(3隱(2-(N-Methyl-N-(2-(2，2，2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)畫(huà)3-oxoprop-l-enyl)-2'-deoxyuridiiie)(102，)的合成將1.19g(4.0mmol)的(E)-5-(2-^J^乙烯基)-2，-脫氧尿苷101(分子量298.25)和921mg(8.0mmol)的N-羥基琥珀酰亞胺(分子量115.09)和1.53g(8.0mmol)的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(分子量191.70)加入已放入攪拌子的回收燒瓶中，再加入l.OmL的DMF，于25。C攪拌8小時(shí)。加入大約lmL的乙酸，并加入250mL的二氯甲烷和250mL的超純水，隨后劇烈攪拌。過(guò)濾所生成的沉淀，并用水洗滌，減壓條件下過(guò)夜干燥。將所得白色殘留物懸浮于100mL的乙腈，并劇烈攪拌。向其中一次性加入2,34g(20mmol)的N-甲基-2，2，-二氨基二乙胺(分子量146.23，d=0.976)，并于25。C再攪拌10分鐘。此后，加入4.8加144011111101)的三氟乙酸乙酯(分子量142.08，d=1.194)、5.6mL(40mmol)的三乙胺(分子量101.19，d=0.726)以及50mL的乙醇，并于25。C攪拌16小時(shí)。從所得混合物中減壓蒸餾除去溶劑，并用硅膠柱純化(10-20。/oMeOH/CH2Cl2)。從含有目的產(chǎn)物的級(jí)分中減壓蒸餾除去溶劑，使其溶解于少量的丙酮，一加入乙醚就生成了白色沉淀。過(guò)濾、乙醚洗滌后進(jìn)行減壓干燥，從而獲得了白色粉末狀750mg(76。/。)的目的產(chǎn)物(化合物102，)。下文示出了儀器分析值?；衔?02，iHNMR(CD30D)S8.29(s，1H)，7.17(d，J=15.6Hz，1H)，6.97(d，J=15.6Hz，1H),6.21(t，J=6.3Hz，1H)，4.40.4.36(m，1H)，3.92.3.90(m，1H)，3.80(dd，J=11.7，2.9Hz，1H)，3.72(dd，J-11.7,3.4Hz，1H)，3.37.3.25(m，5H)，2.60.2.53(m，5H)，2.33.2.19(m，5H);13CNMR(CD3OD)8169.2，158.7(q，J=36.4Hz)，151.2，143.7，143.6，134.1，122.2，117.5(q，J=286.2Hz)，111.0，89.2，87.0，72.1，62.6，57.4，56.7，42.4，41.8，38.5，38.3;C19H27F3N507([M+H]+)的HRMS(ESI)計(jì)算值為494.1863，實(shí)測(cè)值為494.1854。(E)-5-(3-(2-(N-甲基-N-(2-(2,2，2-三氟乙酰氨基)乙基)氨基)乙基氨基)-3-氧代丙-l-烯基)-5，0-(4，4，-二甲氧基三苯基)-2，-脫氧尿苷3，0-(2-氰乙基)-N,N-二異丙基亞磷酰胺((E)國(guó)5國(guó)(3國(guó)(2-(N-Methyl畫(huà)N-(2-(2，2，2誦trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)國(guó)3-oxoprop-l國(guó)enyl)-5，0國(guó)(4，4，-dimethoxytrityl)誦2'翻deoxyuridine3'0—(2-GyanoGthyl)陽(yáng)N，N誦diisopropylphosphoramidite)(4^*104，)合成首先，將296mg(0.60mmol)的化合物102，(分子量494.19)和224mg(0.66mmol)的4，4'-二曱HJ^三苯甲基氯化物(分子量338.83)加入^UV了攪拌子的回收燒瓶中，加入4mL的吡啶，并于25。C攪拌2小時(shí)。加入lml的水，減壓蒸餾除去溶劑，并用硅膠柱純化(1.5%MeOH以及l(fā)。/。Et3N/CH2Cl2)。將含有目的化合物102，的三苯基化物(化合物104，的中間84體)的級(jí)分濃縮，并向殘留物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液。用乙酸乙酯萃取該混合物，用飽和鹽水洗滌，并進(jìn)行加壓干燥，從而獲得白色泡狀的三苯基化物(366mg,77%)。力醒R(CD30D)87.94(s,1H)，7.42.7.17(m，9H)，7.01(d，J=15.6Hz,1H)，6.95(d，J=15.6Hz，1H),6.86.6.83(m，4H)，6.21(t，J=6.3Hz，1H),4.41.4.38(m,1H)，4.09.4.06(m，1H)，3.75(s,6H)，3.40.3.30(m，6H)，2.59(t，J=6.8Hz，2H)，2.53(t，J=6.8Hz,2H)，2.46.2.31(m，5H);13CNMR(CD3OD)8169.2，158.7(q，J=36.4Hz)，151.2，143.7，143.6，134.1，122.2，117.5(q，J=286.2Hz)，111.0，89.2，87.0，72.1，62.6，57.4，56.7,42.4，41.8，38.5，38.3;C40H45F3N5O9([M+H"的HRMS(ESI)計(jì)算值為796.3169，實(shí)測(cè)值為796.3166。將159mg(0.20mmol)前述化合物102，的三苯基化物(分子量920.85)以及28.6mg(0.40mmo1)1H-四唑(分子量70.05)放入圓底燒瓶?jī)?nèi)，并用真空泵進(jìn)行過(guò)夜真空干燥。這時(shí)加入4.0mL的CH3CN溶解試劑，隨后攪拌，并一次性加入191jiL(0.60mmol)的2-氰乙基-N，N，N'，N'-四異丙基亞磷酰胺(分子量301.41，d=0.949)，并在25。C攪拌2小時(shí)。用TLC確定反應(yīng)結(jié)束后，加入飽和碳酸氳鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取，并用飽和鹽水洗滌有機(jī)層，隨后用硫酸鎂干燥。通過(guò)過(guò)濾除去硫酸鎂后，減壓蒸餾除去溶劑，從而得到含有目的化合物104，的粗產(chǎn)物。該組合物無(wú)需純化即可直接用于DNA合成。此外，化合物104，的獲得可由前述粗產(chǎn)物的"PNMR(CDCl3)和HRMS(ESI)確定。下文示出了這些數(shù)值?；衔?04，31PNMR(CDC13)8149.686，149.393;C^HwFsl^OwPaM+H],的HRMS(ESI)計(jì)算值為996.4248，實(shí)測(cè)值為996.4243。同前述化合物105那樣進(jìn)行DNA105，的合成。下文示出了儀器分析值。DNA105，CGCAAT[105，]TAACGC，C133H174N51076P12(M+H+)的計(jì)算值為4074.8，實(shí)測(cè)值為4072.0;CGCAAT[105，105，]AACGC，<:14011187]\5407*12([]\1+11]+)的計(jì)算值為4230.0，實(shí)測(cè)值為4228.9。同前述化合物113那樣進(jìn)行引入有噻唑橙的DNA114的合成。下文示出了儀器分析值。85在合成的DNA寡聚物(ODN)中，對(duì)于具有5'-d(CGCAAT[114(n)TAACGC)-3'序列的ODN(僅含有一個(gè)染料的探針)，同實(shí)施例7以及8那樣觀察了熒光變化情況。下表2、圖14以及15示出其結(jié)果。圖14示出吸收鐠(虛線為單鏈的語(yǔ)，實(shí)線為DNA-DNA鏈的鐠，點(diǎn)劃線為DNA-RNA鏈的鐠)，圖15示出皿譜和發(fā)光譜。在圖15中，左側(cè)(短波長(zhǎng)側(cè))的曲線表示^tJL譜，右側(cè)(長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè))的曲線表示焚光發(fā)光鐠。另夕卜，在該圖中，圖例中的波長(zhǎng)分別表示^JL鐠中的參照熒光發(fā)光的波長(zhǎng)(熒光的^nax)、熒光發(fā)光譜中的激發(fā)波長(zhǎng)。在M譜和熒光發(fā)光譜中，單鏈的發(fā)光強(qiáng)度最弱，DNA-DNA鏈的與^M目比稍強(qiáng)，DNA-RNA鏈的最強(qiáng)。由圖可知，化合物114在1分子中僅具有一個(gè)染料結(jié)構(gòu)，不會(huì)形成H聚集體，因而不會(huì)出現(xiàn)激子效應(yīng)(在吸收鐠中，沒(méi)有觀察到向短波長(zhǎng)側(cè)的位移)。因此，與具有2個(gè)染料結(jié)構(gòu)的化合物相比，單鏈狀態(tài)的熒光淬滅較弱，雙鏈與單鏈的熒光強(qiáng)度比Ids/Iss相對(duì)較小。但是，由于雙鏈形成所致染料插入使染料結(jié)構(gòu)平坦化，因而正如下表2所示，與單鏈相比，雙鏈狀態(tài)得到了更大的熒光強(qiáng)度。此外，在單鏈中，將UV吸收譜中的激發(fā)波長(zhǎng)從488nm改變?yōu)長(zhǎng)^(;^為2個(gè)時(shí)指長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的)，結(jié)果獲得了量子收率屯f-0.120的測(cè)量結(jié)果。另外，在DNA-DNA雙鏈中，將UV吸收鐠中的激發(fā)波長(zhǎng)從488nm改變?yōu)?in^(X^x為2個(gè)時(shí)指長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的)，結(jié)果獲得了量子收率①f=0.307、雙鏈和單鏈的熒光強(qiáng)度比Ids/Iss=3.4的測(cè)定結(jié)果表2<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>測(cè)定條件探針2,5fiM、磷酸緩沖液50mM(pH7.0)、NaCl100mM、互補(bǔ)鏈2.5fiM熒光的最大波長(zhǎng)是用488nm(帶寬1.5nm)的光氣t時(shí)的值。量子收率為將9，10-二苯基蒽用作參照物計(jì)算得到的。實(shí)施例IO采用同實(shí)施例9相同的方法，合成在l個(gè)分子中僅含有l(wèi)個(gè)染料結(jié)構(gòu)的化合物(DNA寡聚物)，所不同的是將用作染料的前述化合物107替換為下述化學(xué)式115表示的化合物。使連接體長(zhǎng)度n在l-4之間進(jìn)行種種變化來(lái)進(jìn)行合成。序列為與前述化合物105相同的5，-d(CGCAATXTAACGC)-3'(X為染料引入部分)?；?2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage87</formula>下述化合物116為11=2的情況。對(duì)于化合物116,采用同實(shí)施例7-9相同的方式來(lái)評(píng)價(jià)熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單勤目比，DNA-RNA雙鏈的熒光強(qiáng)度有所增加?；?3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage88</formula>熒光壽命測(cè)定對(duì)于實(shí)施例8(2個(gè)染料)和實(shí)施例9(l個(gè)染料)的DNA寡聚物(寡核苷酸)，分別在單鏈的情況下和雙鏈DNA的情況下對(duì)其熒光壽命進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)定對(duì)照DNA寡聚物包含在下述序列的位置X中的染料引入核苷酸。5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'(SEQIDNO.1)5'誦d(GCGTTAAATTGCG)-3'(SEQIDNO.2)下表3示出了前述熒光壽命測(cè)定的結(jié)果。表中，T為熒光壽命(iis)。CHISQ為測(cè)定誤差。Tl表示從激發(fā)剛結(jié)束隨即經(jīng)過(guò)的時(shí)間。對(duì)于實(shí)施例8的含2個(gè)染料的探針，T2表示在經(jīng)過(guò)時(shí)間T1之后再經(jīng)過(guò)的時(shí)間，對(duì)于實(shí)施例9的含有1個(gè)染料的探針，T2則表示從激發(fā)剛結(jié)束隨即經(jīng)過(guò)的時(shí)間。T3表示經(jīng)過(guò)時(shí)間T2后再經(jīng)過(guò)的時(shí)間。表中，用"％，，表示的數(shù)值為在分別經(jīng)過(guò)時(shí)間T1、T2或T3期間的熒光衰減率(將激發(fā)剛結(jié)束時(shí)的熒光強(qiáng)度當(dāng)作100%)，對(duì)于各個(gè)探針(DNA寡聚物)而言，總量為100%。如表3所示，含有2個(gè)染料的探針(實(shí)施例8)在單鏈狀態(tài)下有著極其短暫的淬滅過(guò)程(激發(fā)后0.0210ns，熒光衰減率為81.54%)，表明存在激子效應(yīng)。在其他情況下沒(méi)有觀察到此現(xiàn)象。在該以2個(gè)染料標(biāo)記的ODN的單鏈狀態(tài)中，熒光淬滅在熒光強(qiáng)度的雜交特異性以及迅猛變化中起著重要的作用。另外，由表3可知，熒光淬滅特性與二次或者三次函數(shù)特性相一致。此外，對(duì)于下表3中含有2個(gè)染料的雙鏈，再度在相同條件下進(jìn)行了測(cè)定(但是，略去了T1測(cè)定)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在T2-2.05時(shí)熒光衰減率為44。/。，T3=4.38時(shí)熒光衰減率為56%,T=3.33(ns)，CHISQ=1.09，獲得了與下表3極其接近的數(shù)值。即，本實(shí)施例的探針在此熒光壽命測(cè)定中有著良好的再現(xiàn)性。表3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage89</formula>鏈2.5jiM磷酸緩沖液50mM(pH7.0)NaCl100mM在455nm(增強(qiáng))和仰Onm(衰減)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例ll采用同實(shí)施例8相同的方法，合成下述化學(xué)式117表示的DNA寡聚物，物。可以相同的方式分別合成n-3、4、5、6的化合物。另外，同實(shí)施例8一樣，將其用作熒光探針，通過(guò)熒光測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)性能。下表4示出其結(jié)果。由表4可知，化合物117與實(shí)施例8的DNA寡聚物(化合物113)相比有著不同的吸收帶，但卻表現(xiàn)出同樣良好的激子效應(yīng)。it4明，在本發(fā)明中，可以使用吸收帶不同的熒光探針進(jìn)行多色檢測(cè)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>實(shí)施例12合成了以下述序列表示的DNA寡聚物(化合物118)。X為具有同實(shí)施例9一樣的染料結(jié)構(gòu)的核苷酸(下式:為化學(xué)式118)。如下述序列所示，該DNA寡聚物將2個(gè)染料引入核苷酸連續(xù)排列在一起。染料的引入以及DNA寡聚物的合成通過(guò)與前述各實(shí)施例相同的方式進(jìn)行。5,-d(TTTTTTXXTTTTT)-3'(SEQIDNO.3)化66另外，同前述各實(shí)施例一樣，將此DNA寡聚物用作熒光探針，并通過(guò)熒光測(cè)定評(píng)價(jià)性能。探針2.5fiM(鏈濃度)磷酸緩沖液50mM(pH7.0)NaCl100mM互補(bǔ)鏈2.5jiM(鏈濃度)圖16和17示出其結(jié)果。圖16為示出吸收諉的圖(虛線為單鏈的語(yǔ)，實(shí)線為DNA-DNA鏈的譜，點(diǎn)劃線為DNA-RNA鏈的鐠)，圖17為一并示出激發(fā)譜和熒光發(fā)光譜的圖。在圖17中，左側(cè)(短波長(zhǎng)側(cè))曲線表示激發(fā)譜，右側(cè)(長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè))曲線表示熒光發(fā)光譜。在激發(fā)譜和熒光發(fā)光譜中，單鏈的發(fā)光強(qiáng)度最弱，DNA-RNA鏈的與^M目比稍強(qiáng)，DNA-DNA鏈的最強(qiáng)。如圖所示，即便是在以此方式將2個(gè)染料引入核苷酸連續(xù)排列在一起時(shí)，由于染料間的距離被縮短，因而也可表現(xiàn)出激子效應(yīng)，藉此可通過(guò)熒光強(qiáng)度明確區(qū)分目的核酸雜交前后的狀態(tài)。實(shí)施例13合成了連接體長(zhǎng)度n和核酸序列發(fā)生種種變化的以前述化學(xué)式113或者114表示的化合物(DNA寡聚物)，即下表5所示各ODN。此外，"ODN"如前所述意指寡聚DNA(DNA寡聚物)。同前述實(shí)施例l-4、6、8、9或12那樣進(jìn)行合成，所不同的是為滿足連接體的長(zhǎng)度，將原料5-溴戊酸換成碳原子數(shù)(鏈長(zhǎng))發(fā)生改變的化合物，并在寡聚DNA合成中適當(dāng)改變序列。此夕卜，ODNl與實(shí)施例8中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同，ODN4和ODN5與實(shí)施例9中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同。在合成中，使用活性氨基在50當(dāng)量或者50當(dāng)量以上的噻哇橙的N-羥基琥珀酰亞胺酯(化合物109)。合成之后，在反向HPLC中的展開(kāi)時(shí)間根據(jù)需要為20-30分鐘或20-30分鐘以上。此外，在下表5中，例如，[113](n)或者[ll司(n)表示在該位置插入以化學(xué)式113或者114表示的核苷酸，n為連接體長(zhǎng)度。另外，在下表5中，ODNl，表示與ODNl互補(bǔ)的DNA鏈。同樣地，ODN2'表示與ODN2互補(bǔ)的DNA鏈，ODN3'表示與ODN3互補(bǔ)的DNA鏈。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>的各ODN的濃度。另外,通過(guò)MALDITOF質(zhì)語(yǔ)來(lái)鑒定合成的各ODN。下文示出了其質(zhì)量分析值ODNl(n=3)，CGCAAT[113](3)TAACGC，C178H213N56078P12S2([M.H,的計(jì)算值為4820.7，實(shí)測(cè)值為4818》；ODNl(n=4)，CGCAAT[113I(4)TAACGC，C180H217NS6O78P12S2([M.H-)的計(jì)算值為4848.8，實(shí)測(cè)值為4751.4;ODNl(n=5)，CGCAAT[113](5)TAACGC，C182H221N56078P12S2([M.H+)的計(jì)算值為4876.8，實(shí)測(cè)值為4875.6;ODNl(n=6)，CGCAAT[113](6)TAACGC，C184H225N56078P12S2(([M.H^的計(jì)算值為4904.9，實(shí)測(cè)值為4903.6;ODN2，TTTTTT[113(4)TTTTTT，C184H227N34092P12S2([M.H廣)的計(jì)算值為4822.8，實(shí)測(cè)值為4821.4;ODN3，TGAAGGGCTT[113](4)TGAACTCTG,C251H305N81O124P19S2([M,HI+)的計(jì)算值為7093.2，實(shí)測(cè)值為7092.3;ODN(anti4,5S)，GCCTCCT[113j(4)CAGCAAATCC[113](4)ACCGGCGTG，C377H456N1160173P27S4([M,3H"的計(jì)算值為10344.9，實(shí)測(cè)值為10342.7;ODN(antiBl)，CCTCCCAAG[113(4)GCTGGGAT[113(4)AAAGGCGTG，C381H456N1240172P27S4(M,3HO的計(jì)算值為10489.0，實(shí)測(cè)值為10489.8。在前述表5的ODN中，對(duì)于含有序列和連接體長(zhǎng)度發(fā)生種種變化的113(n)的ODN(ODNl、ODN2、ODN3)，在與互補(bǔ)鏈雜交前后，分別測(cè)定其吸光鐠、激發(fā)譜和發(fā)光鐠。結(jié)果一并示于下表6、圖18和圖19。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>測(cè)定條件:2.5fiMDNA、50mM磷酸鈉緩沖液(pH-7.0)、100mM氯化鈉b用488nm激發(fā)e用^max激發(fā)(^nax有兩個(gè)時(shí)，用長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的Uax激發(fā))d雙鏈狀態(tài)和單鏈狀態(tài)在Xem處的熒光強(qiáng)度比此夕卜，在表6中，ODNl(n=3-6)與前述實(shí)施例8的寡聚DNA(5'-d(CGCAATXTAACGC)-3'，X為染料113引入部分)有著相同的結(jié)構(gòu)。但是，在實(shí)施例8中，熒光量子收率①F以及雙鏈狀態(tài)和單鏈狀態(tài)的熒光強(qiáng)度比(Ids/Iss)用波長(zhǎng)488nm激發(fā)來(lái)測(cè)定，而在本實(shí)施例(實(shí)施例13)中，如上所述，用UV吸收譜中的、ax激發(fā)來(lái)測(cè)定。因此，在前述表l(實(shí)施例8)和前述表6(實(shí)施例13)中，即便物質(zhì)相同①F和Ids/Iss也不同。圖18為示出含有[113(4)的ODN的吸收語(yǔ)、'狄語(yǔ)和發(fā)光譜的圖。圖(a)、(b)和(c)各圖中，左圖均表示吸收語(yǔ)，橫軸為波長(zhǎng)，縱軸為吸光度。右圖均表示激發(fā)鐠和發(fā)光語(yǔ)，橫軸表示波長(zhǎng)，縱軸表示發(fā)光強(qiáng)度。將含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH-7.0)中的含有[113(4)的ODN作為樣本，于25"C進(jìn)行各個(gè)測(cè)定。在圖18的各圖中，黑線表示單鏈ODN(ss)的測(cè)定結(jié)果，灰線表示與相應(yīng)互補(bǔ)鏈DNA雜交的ODN(ds)的測(cè)定結(jié)果。圖18(a)示出ODNl(n-4)(2.5jiM)的測(cè)定結(jié)果。測(cè)定激發(fā)鐠，對(duì)于ss,在波長(zhǎng)534nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)于ds，在波長(zhǎng)528nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定發(fā)光鐠，對(duì)于ss用波長(zhǎng)519nm激發(fā)，對(duì)于ds則用波長(zhǎng)514nm激發(fā)。圖18(b)示出ODN2的測(cè)定結(jié)果。左圖中鏈濃度為2.5jiM，右圖中鏈濃度為lhM。測(cè)定激發(fā)譜，對(duì)于ss,在波長(zhǎng)534nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)于ds，在波長(zhǎng)537nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定發(fā)光譜，對(duì)于ss用波長(zhǎng)517nm激發(fā)，對(duì)于ds用波長(zhǎng)519nm齓良。圖18(c)示出ODN3的測(cè)定結(jié)果。鏈濃度為2.5&1\1。測(cè)定激發(fā)諉，對(duì)于ss，在波長(zhǎng)535nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)于ds,在波長(zhǎng)530nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定發(fā)光譜，對(duì)于ss用波長(zhǎng)518nm激發(fā)，對(duì)于ds用波長(zhǎng)516nm激發(fā)。圖19為示出ODN1(1^3、5和6)的吸收鐠、狄諉和發(fā)光譜的圖。圖(a)、(b)和(c)各圖中，左圖均示出吸收鐠，橫軸為波長(zhǎng)，縱軸為吸光度。右圖均示出激發(fā)鐠和發(fā)光鐠，橫軸為波長(zhǎng)，縱軸為發(fā)光強(qiáng)度。將含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH-7.0)中的ODNl(n=3、5或6)作為樣本，于25。C進(jìn)行各個(gè)測(cè)定。在圖19的各圖中，黑線表示單鏈ODN(ss)的測(cè)定結(jié)果，灰線表示與相應(yīng)互補(bǔ)鏈DNA雜交的ODN(ds)的測(cè)定結(jié)果。圖19(a)示出ODNl(n-3)(2,5jiM)的測(cè)定結(jié)果。測(cè)定激發(fā)譜，對(duì)于ss，在波長(zhǎng)537nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)于ds,在波長(zhǎng)529nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定發(fā)光鐠，對(duì)于ss用波長(zhǎng)521nm激發(fā)，對(duì)于ds用波長(zhǎng)511nm激發(fā)。圖19(b)示出ODNl(n-5)(2.5pM)的測(cè)定結(jié)果。測(cè)定^tiL譜，對(duì)于ss，在波長(zhǎng)538nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)于ds，在波長(zhǎng)529nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定發(fā)光鐠，對(duì)于ss用波長(zhǎng)520nm激發(fā)，對(duì)于ds用波長(zhǎng)512nm激發(fā)。圖19(c)示出ODNl(n-6)的測(cè)定結(jié)果。鏈濃度為2.5jiM。測(cè)定M譜，對(duì)于ss，在波長(zhǎng)536nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)于ds,在波長(zhǎng)528nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定發(fā)光譜，對(duì)于ss用波長(zhǎng)523nm激發(fā)，對(duì)于ds用波長(zhǎng)514nm激發(fā)。如表6、圖18和圖19所示，對(duì)于各含有[ll外n)的ODN樣本，在400-550nm的范圍內(nèi)觀察到兩個(gè)吸收帶。在含有l(wèi)(n)的ODN樣本為單鏈狀態(tài)時(shí)，短波長(zhǎng)側(cè)(480nm)的吸收帶稍強(qiáng)，而在含有l(wèi)(n)的ODN樣本與互補(bǔ)鏈雜交時(shí)，長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)(~510nm)的吸收帶顯著(明顯)顯現(xiàn)。長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)(~510nm)的吸收帶是瘞哇橙單體的典型吸收帶。在發(fā)光譜中，在~530nm處觀察到單個(gè)寬吸收帶。含有[1131(n)的ODN樣本通過(guò)與互補(bǔ)鏈雜交，發(fā)光強(qiáng)度發(fā)生了明顯的變化。即，與目的DNA鏈雜交的含有[113](n)的ODN樣本展現(xiàn)出強(qiáng)的熒光，而雜交前的含有113")的ODN樣本與雜交后相比展現(xiàn)出極其微弱的熒光。特別是由多聚嘧咬序列形成的ODN2的熒光在單鏈狀態(tài)下幾乎完全淬滅。最大發(fā)光波長(zhǎng)時(shí)，ODN2的二重鏈(雙鏈)狀態(tài)與單鏈狀態(tài)的熒光強(qiáng)度比(Ids/Iss)達(dá)160。在作為20聚體的ODN鏈的ODN3，同一般序列的ODN3雜交的情況下，雜交前后發(fā)光強(qiáng)度明顯不同。另外，由表6、圖18(a)和圖19可知，在本實(shí)施例的ODNl中，在將連接體長(zhǎng)度在3-6之間改變的情況下，無(wú)論哪個(gè)連接體長(zhǎng)度均能獲得大的Ids/Iss值。如上所述，盡管表6所示ODN因探針序列和連接體長(zhǎng)度導(dǎo)致淬滅性能有所差異，但是無(wú)論哪一個(gè)都表現(xiàn)出良好的淬滅性能。此外，如前述表6所示，ODNl(n-4)/ODNl，的融點(diǎn)(Tm)與天然雙鏈5，-CGCAATTTAACGC-3'/ODNl'相比上升7-9X:。該Tji上升表明，探針中的2個(gè)陽(yáng)離子性染料與同目的序列形成的雙鏈有效地結(jié)合在一起。此外，從圖18和19可知，激發(fā)譜與化合物的結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，而是示出了510rnn附近單個(gè)寬峰。顯示出該波長(zhǎng)同吸收帶的一個(gè)波長(zhǎng)很好地吻合在一起。即認(rèn)為，與熒光發(fā)光相關(guān)的吸收只是510nm附近的吸收帶，480nm附近的吸收帶對(duì)發(fā)光幾乎沒(méi)有影響。另外，由于因染料聚集使得吸收帶從510nm附近遷移到480nm附近，因此估計(jì)激子耦合能量為1230cnT1。這等同于針對(duì)花菁染料的H聚集體所報(bào)道的耦合能量。但是，這類理論認(rèn)識(shí)不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。吸收諉在各溫度和濃度下測(cè)定前述ODNl(i^4)的吸收鐠，確定溫度和濃度對(duì)吸收帶的影響。圖20的吸收譜圖示出了其結(jié)果。圖(a)和(b)各圖中，橫軸為波長(zhǎng)，縱軸為吸光度。將含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pI^7.0)中的ODNl(n=4)作為樣本，進(jìn)行各個(gè)測(cè)定。圖20(a)示出改變?nèi)芤簻囟葧r(shí)的吸收鐠變化情況。ODN濃度為2，5jiM。語(yǔ)在10C-90X:之間以10匸間隔測(cè)定。圖20(b)示出改變?nèi)芤簼舛葧r(shí)的吸收鐠變化情況。測(cè)定溫度為25t:。ODN濃度為0.5、0.75、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0和5.0jiM。(縱軸)同波長(zhǎng)為509nm時(shí)的吸光度的對(duì)數(shù)(橫軸)的關(guān)系的圖。如圖20(a)所示，改變樣本溫度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)吸收帶的吸光度比略微有些變化。即，隨著樣本溫度的上升，479nm的吸收帶逐漸減小，509nm的吸收帶增大。但是，由圖可知，此變化極其微弱。這表明，本發(fā)明的探針ODNl(n-4)的結(jié)構(gòu)隨溫度變化的變化非常微弱，因而可以使用而幾乎不受溫度的影響。另外，如圖所示，在487nm處，觀察到指示存在2個(gè)鐠構(gòu)成要素的等吸收點(diǎn)。另一方面，如圖20(b)所示，增加ODNl(n-4)的樣本濃度時(shí)，可觀察到兩側(cè)吸收帶的吸光度增加。另夕卜，如插圖所示，10g(AbS479)對(duì)l0g(AbSs09)的圖即各吸收帶的吸光度的對(duì)數(shù)的比表現(xiàn)為直線。這顯示出表示2個(gè)語(yǔ)的構(gòu)成要素的比值與ODN濃度無(wú)關(guān)，幾乎是恒定的。即，即便改變?nèi)芤褐械臐舛龋景l(fā)明的探針ODNl(n-4)的結(jié)構(gòu)也幾乎不發(fā)生變化，因而可以使用而不會(huì)受到濃度的影響。另外，圖20(a)和(b)謙變化的原因可解釋如下，但這些解釋是理論認(rèn)識(shí)的一個(gè)實(shí)例，而不是對(duì)^^發(fā)明作出限制。即，首先，ODNl(n-4)通過(guò)二色性系統(tǒng)形成分子內(nèi)H聚集體。據(jù)推測(cè)，圖20(a)中的鐠變化是由于因溫度上升導(dǎo)致的H聚集體的結(jié)構(gòu)略W^散所致。另外，認(rèn)為前述分子內(nèi)H聚集體的形成在分子內(nèi)結(jié)束，因此即便濃度上升，分子間相互作用等所引起的結(jié)構(gòu)變化也幾乎沒(méi)有，所以如圖20(b)和插圖所示，2個(gè)鐠構(gòu)成要素的比幾乎是恒定的。另外，認(rèn)為在ODNl(n-4)的樣本溶液中，存在分子內(nèi)H聚集體和染料單體(染料部分不聚集)的2個(gè)構(gòu)^j漢型。推測(cè)短波長(zhǎng)側(cè)(479nm)的吸收帶來(lái)自于分子內(nèi)H聚集體。長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的吸收帶(509nm)因加熱會(huì)增大，因此推測(cè)來(lái)自于染料單體。CD語(yǔ)測(cè)定了ODNl(i^4)/ODNl，的CD譜。鏈濃度為2.5jiM，在含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH-7.0)中于25X:測(cè)定。圖21的CD譜圖示出其測(cè)定結(jié)果。在此圖中，橫軸為波長(zhǎng)(nm)，縱軸為角度e。如圖所示，ODNl(n-4)/ODNl'雙鏈在450-550nm間表現(xiàn)出分裂型Cotton效應(yīng)(split-Cottoneffect)。即，所測(cè)定的CD對(duì)在噢峻橙染料插入到DNA雙鏈中時(shí)表現(xiàn)出典型的模式。即，認(rèn)為ODNl(i^4)的染料部分插入到所形成的雙鏈DNA中，因而大大地妨礙了二色性聚集體(H聚集體)的形成。此CD測(cè)定結(jié)果與前述Tm測(cè)定結(jié)果一起表明，ODNl(n=4)t的染料部分與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，2個(gè)染料部分均插入大溝中，從而形成熱穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。但是，此理iH人識(shí)不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。所形成的雙鏈結(jié)果具有熱穩(wěn)定性，il^明本發(fā)明的探針(核酸)可以在互補(bǔ)序列的檢測(cè)中有效地使用。實(shí)施例14針對(duì)前述ODN5(CGCAAT[114(4)[1141(4)AACGC)，測(cè)定了雙鏈狀態(tài)和單鏈狀態(tài)的吸收譜、皿譜和發(fā)光譜。下表7和圖22示出其結(jié)果。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>測(cè)定條件2.5fiMDNA，50mM磷酸鈉緩沖液(pH-7.0)，100mM氯化鈉b用488nm、^Le用^nax激發(fā)(；ax有2個(gè)時(shí)，用長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的)^ax激發(fā))d雙鏈狀態(tài)和單鏈狀態(tài)在3^處的熒光強(qiáng)度比圖22為示出ODN5即含有[114(4)的ODN的吸收語(yǔ)、^L^鐠和發(fā)光鐠的圖。ODN5的鏈濃度為2.5jiM，在含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pEN7.0)中于25t;進(jìn)行測(cè)定。黑線表示單鏈ODN5(ss)的測(cè)定結(jié)果，灰線表示與ODNl，雜交的雙鏈的ODN5(ds)的測(cè)定結(jié)果。(a)為吸收諉，橫軸為波長(zhǎng)，縱軸為吸光度。(b)為激發(fā)譜(短波長(zhǎng)側(cè)的曲線)和發(fā)光譜(長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)的曲線)，橫軸為波長(zhǎng)，縱軸為發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定激發(fā)譜，對(duì)于ss，在波長(zhǎng)534nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)于ds,在波長(zhǎng)514nm處測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)定發(fā)光鐠，對(duì)于ss用波長(zhǎng)528nm激發(fā)，對(duì)于ds用波長(zhǎng)519nm激發(fā)。如前述表7和圖22所示，同僅含一個(gè)114w核苷酸的單鏈ODN4的發(fā)光抑制(前述實(shí)施例9的表2)相比，2個(gè)[1141(4)核苷酸連接在一起的序列ODN5表現(xiàn)出更為有效的熒光淬滅。單鏈狀態(tài)的ODN5的吸收鐠中，其吸收帶朝向短波長(zhǎng)側(cè)遷移。這表明ODN5中所含2個(gè)[114⑨核苷酸形成了分子內(nèi)H聚集體。同在含有[113(n)的ODN中所觀察到的一樣，此聚集引發(fā)了單鏈ODN5的淬滅。也就是說(shuō)，認(rèn)為由于ODN5內(nèi)的2個(gè)[114(4)核苷酸的染料部分發(fā)生了H聚集，因而在前述染料間發(fā)生激子耦合，這正是熒光發(fā)光抑制(淬滅)的原因所在。這表明，同含有[113(n)的ODN—樣，含有2個(gè)114(4)核苷酸的ODN5可用于互補(bǔ)鏈檢測(cè)中。實(shí)施例15通過(guò)肉眼測(cè)定ODNl(n-4)同互補(bǔ)ODNl'雜交時(shí)的熒光。圖23示出了其測(cè)定結(jié)果。在該圖中，左側(cè)樣本槽為裝有ODNl(n-4)單鏈的樣本槽，在該圖中，右側(cè)樣本槽為裝有ODNl(i^4)/ODNl'雙鏈的樣本槽，分別示出在150W卣素?zé)粽丈浜蟮臓顟B(tài)。各個(gè)樣本槽中的鏈濃度為2.5nM,裝有50mM磷酸緩沖液(磷酸鈉緩沖液)(pH7.0)和100mMNaCl。如圖所示，在150W囟素?zé)粽丈浜?，裝有ODNl(n-4)單鏈的圖左側(cè)樣本槽幾乎沒(méi)有熒光發(fā)光，而裝有ODNl(n-4)/ODNl，雙鏈的圖右側(cè)樣本槽表現(xiàn)出極其明顯的淺綠色熒光。另外，將互補(bǔ)DNA鏈ODNl，替換為相應(yīng)互補(bǔ)RNA鏈也獲得了同樣的結(jié)果。另外，在ODN2和ODN2，中也獲得了相同的結(jié)果。另夕卜，對(duì)于ODN2和ODN2，，將ODN2，替換為相應(yīng)互補(bǔ)RNA(A13聚體)也獲得了相同的結(jié)果。另外，在這些情形下，鏈濃度為5jiM。另外，對(duì)于前ii^6中的全部其他ODN也獲得了相同的結(jié)果。因此，通過(guò)本實(shí)施例的ODN，熒光強(qiáng)度因雜交而發(fā)生明顯的變化，因而，對(duì)于有可能雜交的目標(biāo)序列可通過(guò)肉眼簡(jiǎn)單判斷。il^明，這些ODN可用于直觀的基因分析。實(shí)施例16同實(shí)施例8—樣，合成了下述化學(xué)式120表示的DNA寡聚物，所不同的是，將用作染料的前述化合物107替換為下述化學(xué)式119表示的化合物?；?7化68<formula>formulaseeoriginaldocumentpage100</formula>120能夠以同樣的方法分別合成上述式120中11=3、4、5和6的化合物(寡聚DNA)。另外，使用序列5，-d(CGCAAT[120(s)TAACGC)-3'表示的ODN(為ODN6(『5))作為熒光探針，測(cè)定吸收謙和熒光發(fā)光譜并評(píng)價(jià)性能。測(cè)定條件同實(shí)施例7。圖24示出其測(cè)定結(jié)果。圖24(a)為吸收譜，橫軸為波長(zhǎng)(nm)，縱軸為吸光度。圖24(b)為熒光發(fā)光諉，橫軸為波長(zhǎng)(nm),縱軸為發(fā)光強(qiáng)度。每一幅圖中，黑線均表示單鏈ODN的譜，灰線均表示與互補(bǔ)ODN雜交的雙鏈ODN的譜。如圖24(a)所示，在雙鏈ODN中，由于形成了雙螺旋，因而600nm附近的UV吸收的最大波長(zhǎng)朝向長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)移動(dòng)。另外,如圖24(b)所示，在雙鏈ODN中，同單鏈相比，其熒光強(qiáng)度大幅增加。因此，認(rèn)為在單鏈狀態(tài)表現(xiàn)出激子效應(yīng)。也就是說(shuō)，雖然本實(shí)施例的ODN(相比，有著不同的吸收帶，但是也能表現(xiàn)出良好的激子效應(yīng)。這表明，在本發(fā)明中，使用吸收帶不同的熒光探針可以進(jìn)行多色檢測(cè)。實(shí)施例17:與RNA形成雙鏈在比色杯中，使前述ODN2(序列5'-d(TTTTTT113h4)TTTTTT)-3，)和與^M目應(yīng)的互補(bǔ)RNA鏈(RNAA13聚體)形成雙鏈ODN,并測(cè)定熒光發(fā)光譜。另外，向其中添加RNaseH,并觀察譜的變化情況。圖25示出其結(jié)果。在該圖中，橫軸為時(shí)間，縱軸為熒光強(qiáng)度。圖中，黑線表示中途添加RNaseH的前述雙鏈ODN的鐠變化情況，灰線表示對(duì)照即沒(méi)有添加RNaseH的前述雙鏈ODN的譜變化情況。在37t!攪拌的同時(shí)使用前述萸光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。如圖所示，若添加RNaseH，則同前述ODN2雜交的RNA會(huì)被消化掉，前述ODN2會(huì)恢復(fù)為單鏈，因而熒光強(qiáng)度逐漸減少。這一事實(shí)也表明本發(fā)明的探針(核酸)可用于通過(guò)熒光檢測(cè)互補(bǔ)RNA。實(shí)施例18改變前述ODNl(i^4)(序列5，-d(CGCAAT[113](4)TAACGC)-3')的互補(bǔ)DNA鏈ODNl'(序列5'-d(GCGTTAAATTGCG)-3')的濃度比來(lái)觀察熒光發(fā)光強(qiáng)度的變化情況。測(cè)定條件為將ODNl(n-4)的鏈濃度固定為1.0jiM,而磷酸緩沖液為50mM(pH7.0)，NaCl為100mM，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm(帶寬為1.511111)。分別在互補(bǔ)鏈ODN1，的濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0或3.0jiM的各濃度下進(jìn)行測(cè)定。圖26示出其測(cè)定結(jié)果。在該圖中，橫軸表示相對(duì)于ODNl(n-4)的ODNl'的當(dāng)量數(shù)。縱軸表示熒光;ax(529nm)處的熒光發(fā)光強(qiáng)度(相對(duì)值)。如圖所示，在ODNl，的當(dāng)量數(shù)在1以下時(shí)，熒光發(fā)光強(qiáng)度以極高的精確性呈現(xiàn)出相對(duì)于前述當(dāng)量數(shù)的正比關(guān)系，然而前述當(dāng)量數(shù)超過(guò)l時(shí)，卻沒(méi)有變化。這表明ODNl(i^4)與ODN1，以1:1的物質(zhì)量比(分子數(shù)比)正確雜交。如上所述，ODNl，(目的DNA)的物質(zhì)量與ODNl(n-4)(探針)的量相同或更少時(shí)，熒光強(qiáng)度與目的DNA的濃度成比例增大。也就是說(shuō)，在ODNl'(目的DNA)存在的體系中，若添加過(guò)量的ODNl(i^4)(探針)，則可通過(guò)熒光強(qiáng)度測(cè)定來(lái)對(duì)前述目的DNA進(jìn)行定量。另外，通過(guò)示蹤前述熒光強(qiáng)度的增減情況，也可以測(cè)定前述目的DNA的增減情況。為了對(duì)體系中的前述目的DNA進(jìn)行定量，例如如圖26那樣，也可以事先作成標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，若ODNl'(目的DNA)濃度未知的樣本在與本實(shí)施例相同的條件下進(jìn)行測(cè)量時(shí)的熒光強(qiáng)度為80,那么由圖26可知，前述ODNl'(目的DNA)的濃度為約0.55fiM。事實(shí)上，通過(guò)上述方法對(duì)核酸中的ODNl，(目的DNA)序列進(jìn)行定量，在立即檢測(cè)出該目標(biāo)序列的擴(kuò)增、分解和蛋白結(jié)合等現(xiàn)象發(fā)生情況的同時(shí)，也可以對(duì)這些現(xiàn)象的量進(jìn)行定量。實(shí)施例19:點(diǎn)印跡分析為了觀察此時(shí)合成的新探針(核酸)因雜交所致熒光性質(zhì)的變化情況，通過(guò)使用前述ODN(antiBl)和ODN(anti4.5S)的點(diǎn)印跡對(duì)DNA進(jìn)行了分析。所使用的目的DNA序列為含有B1RNA^列的短鏈DNA片段。此序列為嚙齒類基因組中的短*型核內(nèi)反復(fù)序列之一。另外，前述短鏈DNA片段含有4,5SRNA^列。此序列為分離自嚙齒類細(xì)胞的低分子核內(nèi)RNA之一，并與B1家族具有廣泛的同源性。在本實(shí)施例中，通過(guò)制備印跡探針ODN(antiBl)和ODN(anti4.5S)，并向其中引入2個(gè)[113④核苷酸，可賦予高的敏感度和高的熒光強(qiáng)度。另夕卜，ODN(antiBl)和ODN(anti4.5S)的結(jié)構(gòu)如前述實(shí)施例13中的表5所述。更具體而言，本實(shí)施例的點(diǎn)印跡分析的進(jìn)行如下。即，首先，通過(guò)前述DNA自動(dòng)合成儀制備下述(1)和(2)兩個(gè)DNA片段。(1)下述含有4,5SRNA序列及其互補(bǔ)DNA的DNA雙鏈。5'誦d(GCCGGTAGTGGTGGCGCACGCCGGTAGGATTTGCTGAAGGAGGCAGAGGCAGGAGGATCACGAGTTCGAGGCCAGCCTGGGCTACACATTTTTTT)-3，(SEQIDNO.11)(2)下述含有B1RNA序列及其互補(bǔ)DNA的DNA雙鏈。5'國(guó)d(GCCGGGCATGGTGGCGCACGCCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGTGAG)-3，(SEQIDNO.12)使前述DNA雙鏈在含有0.5M氫氧化鈉和lM氯化鈉的水溶液中變性。將此變性DNA的等分式樣在正電荷尼龍膜(Roche社)上進(jìn)行點(diǎn)(斑點(diǎn))印跡。將此正電荷尼龍膜片用含有0.5M磷酸鈉和lM氯化鈉的水溶液潤(rùn)濕之后，在含有O.SM磷酸鈉、1M氯化鈉和100將/mL鮭精DNA的水溶液中于50X:孵育30分鐘。隨后，將前述正電荷尼龍膜片在含有0.5M磷酸鈉和lM氯化鈉的探針?biāo)芤?探針為150卩11101的00]\(3114.58)或ODN(antiBl))中于50"C孵育l小時(shí)。將其在室溫下冷卻后，除去雜交緩沖液，加入新的磷酸緩沖液，并通過(guò)BioRad公司的VersaDoc成像系統(tǒng)(商品名)觀察前述正電荷尼龍膜片發(fā)出的熒光。所使用的M光為使自和研藥林式會(huì)社的UV透射儀Model-2270(商品名)發(fā)出的光通過(guò)UV/青色光轉(zhuǎn)換板(UVP)變化得到的光。圖27示出測(cè)定結(jié)果。圖27(a)為示出尼龍膜上不同序列的DNA印跡的狀態(tài)的模式圖。上排的4個(gè)點(diǎn)表示含有45SRNA序列的DNA,下排的4個(gè)點(diǎn)表示含有B1RNA的DNA。圖27(b)為示出在含有ODN(anti4.5S)的溶液中孵育之后的熒光發(fā)光的圖。圖27(c)為示出在含有ODN(antiBl)的溶液中孵育之后的熒光發(fā)光的圖。如圖27所示，印跡斑點(diǎn)的熒光在印跡分析之后，無(wú)需反復(fù)洗滌即可在室溫下用熒光成像裝置讀出。若添加ODN(anti4.5S)，則用前述探針?lè)跤慕Y(jié)果是，獲得了由4.58序列的斑點(diǎn)發(fā)出的強(qiáng)熒光發(fā)光，但是由B1序列的斑點(diǎn)發(fā)出的熒光發(fā)光可以忽略不計(jì)。相比之下，若添加ODN(antiBl),則Bl斑點(diǎn)表現(xiàn)出強(qiáng)的熒光，而在4.58斑點(diǎn)僅觀察到極其微弱的熒光。因此，本發(fā)明的探針能夠?qū)崿F(xiàn)明顯不同于以往的印記分析的分析，而不必在印記之后進(jìn)行繁瑣的多步洗滌處理，也無(wú)需抗體或酶處理。另外，與分子信標(biāo)等on-off探針不同，本發(fā)明的探針容易引入多個(gè)熒光染料標(biāo)記部分，因而能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。這是本發(fā)明很有利的一點(diǎn)。前述熒光染料標(biāo)記部分也可以例如如本實(shí)施例所述包含在[113(4)核苷酸中。實(shí)施例20通過(guò)使用玻璃微管的顯微注射法將含有實(shí)施例8中的連接體長(zhǎng)度n-4的染料的多聚T探針(前述ODN2)引入細(xì)胞，并通過(guò)配有水銀燈、冷卻CCD照相機(jī)和熒光濾器裝置(用于YFP)的倒置顯微鏡來(lái)測(cè)定熒光發(fā)光。圖2830示出了其結(jié)果。圖28為差分干涉時(shí)的照片，圖29為熒光觀察時(shí)的照片，圖30為圖28和圖29的疊加圖。如圖所示，4^發(fā)明的熒光探4十(標(biāo)記物)與細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)的mRNA的多聚A末端序列結(jié)合而發(fā)光。換言之，本發(fā)明的熒光探針(標(biāo)記物)不僅能有效地在體外檢測(cè)基因，也能有效地在體內(nèi)檢測(cè)基因。實(shí)施例21另外，通過(guò)常規(guī)方法將普通熒光染料Cy5與前述ODN2(序列5，-d(TTTTTT[113I(4)TTTTTT)-3，)相結(jié)合，再通過(guò)前述方法將其引入細(xì)胞。此處，Cy5在合成前述ODN2的過(guò)程中，通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀通過(guò)被添加到前述ODN2的5'末端而與其結(jié)合(序列5，-Cy5-d(TTTTTT113〗(4)TTTTTT)-3')。熒光發(fā)光通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定。圖31示出其結(jié)果。圖31A示出用633nm激發(fā)所獲得的650nm以上的熒光，為Cy5發(fā)出的熒光。圖31B示出用488nm激發(fā)所獲得的505-550nm的熒光，為2個(gè)漆喳橙部分發(fā)出的熒光。如圖所示，ODN2與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的mRNA的多^A末端序列結(jié)合而發(fā)光。因此，可以示蹤細(xì)胞內(nèi)mRNA的分布。也可以此方式在本發(fā)明的化合物或核酸中引入多個(gè)種類的染料(表現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán))。如此的話，例如由于各染料的熒光;ax不同，可以進(jìn)行多色檢測(cè)。實(shí)施例22通過(guò)前述方法將前述ODN2(序列5'-d(TTTTTT[113(4)TTTTTT)-3')引入細(xì)胞核內(nèi)，注射一結(jié)束(0秒后)至約4分半后，用前述激光掃描共聚焦顯微鏡示蹤熒光發(fā)光(488nm激發(fā)，505-550nm獲得熒光)。圖32示出其結(jié)果。在該圖中，分為11幅圖，從左至右，以及從上排到下排，示出ODN2注入后的經(jīng)過(guò)。在各圖中，經(jīng)過(guò)時(shí)間(ODN2注入后)如下表8所示。如圖所示，表明探針ODN2在注射后立即集中于細(xì)胞核內(nèi)，但在與mRNA(多聚A)雜交的同時(shí)，逐漸分散在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)本發(fā)明可以以此方式示蹤mRNA。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>實(shí)施例23合成了將在前述ODN2中[113(4)兩側(cè)的T分別增加至24個(gè)的ODN。將其稱為ODN7。合成同ODN2的合成方法一樣進(jìn)行。另外，ODN7的序列為5，-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[113(4)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3，)(SEQIDNO.13),以同實(shí)施例22—樣的方法將其注入細(xì)胞核內(nèi)，并測(cè)定熒光強(qiáng)度。圖33示出經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后的熒光照片。ODN7在注射后立即集中在細(xì)胞核內(nèi)，但是同實(shí)施例22—樣，在與mRNA(多聚A)雜交的同時(shí)，逐漸*在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，最終如圖33所示，呈現(xiàn)出*在細(xì)胞核周圍的狀態(tài)。實(shí)施例24:多色檢測(cè)如實(shí)施例ll、16等所述，通過(guò)改變吸收波長(zhǎng)、發(fā)光波長(zhǎng)等，本發(fā)明的熒光探針可以進(jìn)行多色互補(bǔ)鏈檢測(cè)。此多色檢測(cè)例如可如前述化合物113、117和120那樣改變?nèi)玖?表現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán))部分的結(jié)構(gòu)達(dá)成。在本實(shí)施例中，再合成(制造)多個(gè)種類的熒光探針，并進(jìn)行多色互補(bǔ)鏈檢測(cè)首先，使染料(表現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán))部分的結(jié)構(gòu)發(fā)生種種改變來(lái)合成含有下述式(121)表示的核普酸結(jié)構(gòu)的DNA鏈(探針)。下述式(121)中,"Dye"表示染料部分?；?9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage107</formula>(121)具體而言，合成了在前述式(121)中"Dye"部分分別由下述式表示的化合物(DNA鏈)113、120、122、123和124。n分別為連接體長(zhǎng)度C^tf、子數(shù))。對(duì)于化合物113、120、122、123和124，分別合成了n-3、4、5和6的化合物。合成方法同前述實(shí)施例14、6、8、9、12、13或16，所不同的是使用具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的染料替代前述染料107。也可同前述染料107的合成(前期實(shí)施例6的方案5)那樣進(jìn)行替代前述染料107的染料的合成，所不同的是適當(dāng)改變?cè)系慕Y(jié)構(gòu)。另外，化合物113和120分別同前述各實(shí)施例的化合物113和120的結(jié)構(gòu)相同?；?0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage108</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage109</formula>(123)化74<formula>formulaseeoriginaldocumentpage110</formula>對(duì)于上述化合物113、120、122、123和124，分別合成用序列5'-d(CGCAATX(n)TAACGC)畫(huà)3'表示的ODN。X為113、120、122、123或124。n為連接體長(zhǎng)度。序列5'-d(CGCAAT[113](n)TAACGC)-3，表示的ODN與前述ODNl相同。序列5'-d(CGCAAT[1201(n)TAACGC)-3，表示的ODN與前述ODN6相同。序列5，-d(CGCAAT122]&)TAACGC)-3'表示的ODN為ODN8。序列5'-d(CGCAAT123](n)TAACGC)-3'表示的ODN為ODN9。序列5'-d(CGCAAT[124(n)TAACGC)-3'表示的ODN為ODN10。對(duì)于ODNl、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10，分別合成n-3、4、5和6的ODN。對(duì)于ODNl(n=4)、ODN6(n=4)、ODN8(n=4)、ODN9(n=4)和ODN10(n=4)，使其分別與互補(bǔ)鏈ODNl，形成雙鏈之后測(cè)定熒光發(fā)光譜。激發(fā)波長(zhǎng)以外的測(cè)定條件同前述各實(shí)施例。其結(jié)果示于下表9。下表9中，E,表示激發(fā)波長(zhǎng)，Em表示熒光發(fā)光的最大波長(zhǎng)。另外，激發(fā)波長(zhǎng)Ex幾乎等于吸收的最大波長(zhǎng)、『表9<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>由表9可知，在456mn-654nm的寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)，各ODN在形成雙鏈時(shí)分別展現(xiàn)出不同的熒光發(fā)光的最大波長(zhǎng)Em。即，使用本實(shí)施例(實(shí)施例24)合成的ODN,能夠進(jìn)行多色互補(bǔ)鏈DNA檢測(cè)。另夕卜，對(duì)于本實(shí)施例的化合物(DNA鏈)113、120、122、123和124、ODNl、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10，確定了可同前述各實(shí)施例一樣使用，全都可以多色方式進(jìn)行互補(bǔ)鏈RNA檢測(cè)、點(diǎn)印跡分析、細(xì)胞內(nèi)mRNA檢測(cè)等。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性由上可知，本發(fā)明提供了能夠有效地檢測(cè)例如核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物。另夕卜，本發(fā)明提供了使用前述標(biāo)記物的核酸檢測(cè)方法和試劑盒。本發(fā)明的化合物或者核酸、前述本發(fā)明的本發(fā)明化合物和核酸具有前述式(l)、(lb)、(lc)、(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示特征性結(jié)構(gòu)，因而可用作例如有效地檢測(cè)核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物。本發(fā)明的標(biāo)記物在核酸的檢測(cè)靈敏度方面很出色，因而可用于研究用、臨床用、診斷用、體外基因檢測(cè)、體內(nèi)基因檢測(cè)等廣泛應(yīng)用中。另外，對(duì)于本發(fā)明的化合物和核酸的用途沒(méi)有限制，無(wú)論哪種用途均可。權(quán)利要求1.具有衍生自單核苷或單核苷酸的結(jié)構(gòu)的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中所述結(jié)構(gòu)以下述式(1)、(1b)或(1c)表示，[化1]在所述式(1)、(1b)和(1c)中，B為具有天然核酸堿基(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或者人工核酸堿基骨架的原子團(tuán)，E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架或由這其中的任一骨架衍生的結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或擬肽結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，Z11和Z12分別表示氫原子、保護(hù)基或展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)，可以相同或者不同，Q在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為O，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為NH，X在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為氫原子、能夠用酸脫保護(hù)的羥基保護(hù)基、磷酸酯基(單磷酸酯基)、二磷酸酯基或三磷酸酯基，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為氫原子或氨基保護(hù)基，Y在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為氫原子、羥基保護(hù)基或亞磷酰胺基，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為氫原子或保護(hù)基，L1、L2和L3各自為連接體(橋連原子或原子團(tuán))，主鏈長(zhǎng)(主鏈原子數(shù))任意，在主鏈中，各自均可以含有或不含C、N、O、S、P和Si，在主鏈中，各自均可以含有或不含單鍵、雙鍵、三鍵、酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵、亞胺基、醚鍵、硫醚鍵和硫酯鍵，L1、L2和L3彼此之間可以相同或不同，D為CR、N、P、P＝O、B或SiR，R為氫原子、烷基或任意取代基，b為單鍵、雙鍵或三鍵，或者，在所述式(1)中，L1和L2為所述連接體，L3、D和b不存在，L1和L2直接連接于B，所述式(1b)中、T在E為前述(i)的原子團(tuán)時(shí)，為磷酸橋連(PO4-)，其中1個(gè)以上的氧原子(O)可由硫原子(S)替代，E為前述(ii)的原子團(tuán)時(shí)，為NH。2.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中在所迷式(1)、(lb)和(lc)中，E為具有DNA、i務(wù)飾DNA、RNA、修飾RNA、LNA或PNA(肽核酸)的主鏈結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)。3.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中在所述式(1)和(lc)中，由[化2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>在所述式(lb)中，由[化4OY表示的原子團(tuán)為下述式(2b)-(4b)中的任一個(gè)表示的原子團(tuán),[化5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在所述式(2)-(4)和(2b)-(4b)中，A為氫原子、羥基、烷基或吸電子基，M和J各自為CH2、NH、O或S，可以相同或不同，B、X和Y各自與所述式(1)、(lb)或(lc)中相同，所述式(2)、(3)、(2b)和(3b)中，磷酸橋連中一個(gè)以上^O原子可由S原子替代。4.權(quán)利要求3所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中在所述式(2)和(2b)中，A中，所述烷基為甲氧基，所述吸電子基為鹵素。5.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中在所述式(1)、(lb)或(lc)中，L1、I和l/的主鏈長(zhǎng)(主鏈原子數(shù))各自為2以上的整數(shù)。6.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其以下述式(5)、(6)、(6b)或(6c)表示，化6]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>在所述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中，1、m和n為任意值，可以相同或者不同，B、E、Z11、Z12、X、Y和T與所述式(1)、(lb)或(lc)中相同。7.權(quán)利要求6所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中1、m和n各自為2以上的整數(shù)。8.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中z"和zu為表現(xiàn)出激子效應(yīng)的原子團(tuán)。9.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中z"和zu各自獨(dú)立地為衍生自噻唑橙、噁唑黃、花菁、半花菁、其他花菁染料、甲基紅、偶氮染料或其衍生物的基團(tuán)。10.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中ZU和Z"各自獨(dú)立地為下述式(7)-(9)中的任一個(gè)表示的原子團(tuán)，[化7R5(7)[化8<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>(9〉在式(7)-(9)中，Xi和XZ各自為S或0,可以相同或不同，n為0或正整數(shù)，Ri_Ri、R"-R"各自獨(dú)立地為氫原子、卣原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基或氨基，R"和RU中，一者為與所述式(1)、(lb)或(lc)中的I^或L2、所述式(5)、(6)、(6b)或(6c)中與NH鍵合的連接基團(tuán)，另一者為氳原子或低級(jí)烷基，多個(gè)R"存在于式(7)、(8)或(9)中的情況下，它們可以相同或者不同，多個(gè)R"存在于式(7)、(8)或(9)中的情況下，它們可以相同或者不同，Z"中的X1、XS和R、R"與Z"中的X1、Xa和R^R"彼此之間可以相同或者不同。11.權(quán)利要求10所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中在式(7)-(9)中，R^R"中，所述低級(jí)烷基為碳原子數(shù)為l-6的直鏈或支鏈烷基，所述低級(jí)烷氧基為碳原子數(shù)為l-6的直鏈或支鏈烷氧基。12.權(quán)利要求10所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中在式(7)國(guó)(9)中，rU和R"中，所述連接基團(tuán)為^f子數(shù)為2以上的聚亞甲基M，通過(guò)M部分與所述式(i)、(lb)或(lc)中的I/或L2、所述式(5)、(6)、(6b)或(6c)中的nh鍵合。13.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其具有下述式(10)表示的結(jié)構(gòu)，化10<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>在式(10)中，E、Z11、Z12、Q、X和Y與所述式(1)中相同。14.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中，在所述式(1)、(lb)和(lc)中，B為Py、Pyder.、Pu或Puder.表示的結(jié)構(gòu)，其中，所述Py為在下述式(11)表示的六元環(huán)中在1位具有與E鍵合的共價(jià)鍵、并且在5位具有與連接體部分發(fā)生鍵合的共價(jià)鍵的原子團(tuán)，所述Pyder.為由所述Py的六元環(huán)的全部原子中至少有一個(gè)由N、C、S或O原子替代的原子團(tuán)，所述N、C、S或O原子可以具有適當(dāng)?shù)碾姾?、氫原子或取代基，所述Pu為在下述式(12)表示的稠環(huán)中在9位具有與E鍵合的共價(jià)鍵、并且在8位具有與連接體部分發(fā)生鍵合的共價(jià)鍵的原子團(tuán)，所述Puder.為所述Pu的五元環(huán)的全部原子中至少有一個(gè)由N、C、S或O原子替代的原子團(tuán)，所述N、C、S或O原子可以具有適當(dāng)?shù)碾姾?、氫原子或取代基?lt;formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>15.權(quán)利要求14所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其由下述式(13)或(14)表示，化12<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>在所述式(13)和(14)中，E、Z11、Z12、Q、X和Y與所述式(1)中相同，Py、Pyder.、Pu和Puder.如權(quán)利要求14所定義。16.權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中所述亞磷酰胺基以下述式(15)表示，-P(OR22)N(R23)(R24)(15)在式(15)中，IP為磷酸基的保護(hù)基，iP和RM為烷基或芳基。17.權(quán)利要求16所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中所述式(15)中，R"為氰乙基，R"和R"中，所述烷基為異丙基，所述芳基為苯基。18.—種核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽，其含有至少一個(gè)下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)表示的結(jié)構(gòu)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>[化14<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(17)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage17</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>在式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中，B、E、Z11、Z12、L1、L2、L3、D和b各自表示為權(quán)利要求l中所示的結(jié)構(gòu)，其中，式(16)、(17)和'(18)中、E為權(quán)利要求l中的所述(i)的原子團(tuán)，磷酸橋連中至少一個(gè)O原子可以由S原子所替代，式(16b)、(17b)和(18b)中，E為權(quán)利要求l中的所述(ii)的原子團(tuán)，式(17)和(17b)中，各B可以相同或不同，各E也可以相同或者不同。19.權(quán)利要求18所述的核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，或其鹽，其中在所述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中，Z"和Z^各自為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)，可以相同或者不同。20.—種標(biāo)記物，其中一個(gè)分子內(nèi)的兩個(gè)平面化學(xué)結(jié)構(gòu)不在同一平面內(nèi)，而是以某一角度存在，但該分子在插入或溝結(jié)合至核酸中時(shí)，所述兩個(gè)平面化學(xué)結(jié)構(gòu)在同一平面內(nèi)排列配置，從而產(chǎn)生熒光發(fā)光。21.—種標(biāo)記物，由兩個(gè)以上的染料分子群形成，其中，雖然由于兩個(gè)以上的染料分子平行聚集所產(chǎn)生的激子效應(yīng)不會(huì)展現(xiàn)出熒光發(fā)光，但這些分子在插入或溝結(jié)合至核酸中時(shí)，通過(guò)所述聚集狀態(tài)的解除會(huì)產(chǎn)生熒光發(fā)光。22.權(quán)利要求21所述的標(biāo)記物，其中所述染料分子為權(quán)利要求20所述的分子。23.—種復(fù)合體標(biāo)記物，其以在同一分子內(nèi)具有兩個(gè)以上染料分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)作為特征性化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中，雖然由于兩個(gè)以上的染料分子平行聚集所產(chǎn)生的激子效應(yīng)不會(huì)展現(xiàn)出熒光發(fā)光，但是這些分子在插入或溝結(jié)合至核酸中時(shí)，通過(guò)所述集合狀態(tài)的解除會(huì)產(chǎn)生熒光。24.權(quán)利要求23所述的復(fù)合體標(biāo)記物，具有兩個(gè)以上的染料分子鍵合到與應(yīng)被標(biāo)記核酸鍵合的連接體分子的結(jié)構(gòu)，所述染料分子與所述連接體分子的鍵合借助于額外連接體分子以形成分枝結(jié)構(gòu)，或者不借助于額外的連接體分子而直接鍵合。25.權(quán)利要求23的標(biāo)記物，其中所述染料分子為權(quán)利要求20所述的分子。26.權(quán)利要求20所述的標(biāo)記物，其中所述標(biāo)記物為Z"和Z"為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽、或者權(quán)利要求18所述的核酸、其互變異構(gòu)體或其立體異構(gòu)體、或其鹽。27.—種標(biāo)記物，為標(biāo)記單核苷酸、標(biāo)記寡核苷酸、標(biāo)記核酸或標(biāo)記核酸類似物，其中所述標(biāo)記物由權(quán)利要求20所述的標(biāo)記物、或Z"和Z"為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽、或Z"和ZU為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求18所述的核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽標(biāo)記。28.—種標(biāo)記物，為標(biāo)記單核苷酸、標(biāo)記寡核苷酸、標(biāo)記核酸或標(biāo)記核酸類似物，其中所述標(biāo)記物借助于與單核苷酸、寡核苷酸、核酸或核酸類似物中的一個(gè)或一個(gè)以上的威基分子或主鏈構(gòu)成分子鍵合的連接體分子,由權(quán)利要求20的標(biāo)記物、或Z"和ZU為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽、或Z11和^2為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求18所述的核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽標(biāo)記。29.—種標(biāo)記物，為標(biāo)記單核苷酸、標(biāo)記寡核苷酸、標(biāo)記核酸或標(biāo)記核酸類似物,其中所述標(biāo)記物借助于與單核苷酸、寡核苷酸、核酸或核酸類似物中的一個(gè)或一個(gè)以上的威基分子的嘧咬核的5位碳原子或噤呤核的8位碳原子鍵合的連接體分子，由權(quán)利要求20所述的標(biāo)記物、或Z"和Z12為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求1所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽、或z"和zu為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求18所述的核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽標(biāo)記。30.—種核酸檢測(cè)方法，包括以下步驟—將權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)所述的標(biāo)記物——標(biāo)記單核苷酸或標(biāo)記寡核苷酸作為底物進(jìn)行核酸合成，從而合成插入有或溝結(jié)合有所述展現(xiàn)熒光性的原子團(tuán)或染料分子結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸，—分別測(cè)量所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度，并—通過(guò)比較所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)核酸合成。31.權(quán)利要求30所述的核酸檢測(cè)方法，所述核酸合成通過(guò)酶法進(jìn)行。32.—種核酸檢測(cè)方法，包括以下步驟—將權(quán)利要求27-29任一項(xiàng)所述的標(biāo)記物——單鏈核酸作為第一核酸,將其與具有與所述第一核酸互補(bǔ)的序列或與所迷互補(bǔ)序列類似的序列的第二核酸雜交來(lái)進(jìn)行核酸合成，從而合成插入有或溝結(jié)合有所述展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)或染料分子結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸，分別測(cè)量所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度，并—通過(guò)比較所述雙鏈核酸合成步驟前后的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)所述第一核酸和所述第二核酸的雜交情況。33.—種核酸檢測(cè)方法，其特征在于使用第三核酸來(lái)檢測(cè)三鏈核酸或核酸類似物的形成情況，所述第三核酸具有權(quán)利要求32所迷的第一核,列、所述第二核酸序列或與這些序列互補(bǔ)的序列、或者與所述的與這些序列互補(bǔ)的序列相似的序列，并且由權(quán)利要求20所述的標(biāo)記物或復(fù)合體標(biāo)記物標(biāo)記或未被其標(biāo)記。34.權(quán)利要求30所述的方法，其中使用具有Z"和ZU為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽、或Z"和ZU為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求18所述的核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽的結(jié)構(gòu)的一部分的標(biāo)記核酸，檢測(cè)雙鏈或三鏈核酸。35.權(quán)利要求32所述的方法，其中使用具有Z"和ZU為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求l所述的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽、或Z"和ZU為展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)的權(quán)利要求18所述的核酸、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽的結(jié)構(gòu)的一部分的標(biāo)記核酸，檢測(cè)雙鏈或三鏈核酸。36.—種試劑盒，含有核酸合成裝置、標(biāo)記物和熒光強(qiáng)度測(cè)定裝置，其中所述標(biāo)記物為權(quán)利要求20-29任一項(xiàng)所述的標(biāo)記物。37.權(quán)利要求35所述的試劑盒，用于權(quán)利要求30所述的方法。38.權(quán)利要求35所述的試劑盒，用于權(quán)利要求32所述的方法。39.權(quán)利要求35所述的試劑盒，用于研究、臨床或診斷。全文摘要本發(fā)明提供了能夠有效地檢測(cè)例如核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物。提供了具有衍生自單核苷或單核苷酸的結(jié)構(gòu)的化合物、其互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體、或其鹽，其中所述結(jié)構(gòu)由所述式(1)、(1b)或(1c)表示。例如，B為具有核酸堿基骨架的原子團(tuán)，E為具有脫氧核糖骨架、核糖骨架或自其衍生的結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，或具有肽結(jié)構(gòu)或擬肽結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，Z¹¹和Z¹²分別表示氫原子、保護(hù)基或展現(xiàn)出熒光性的原子團(tuán)，可以相同或者不同。文檔編號(hào)C12N15/11GK101631796SQ20088000763公開(kāi)日2010年1月20日申請(qǐng)日期2008年3月6日優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日發(fā)明者久保田健,岡本晃充,池田修司申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所