專利名稱：變體激活素受體多肽及其用途的制作方法
變體激活素受體多肽及其用途 與相關申請的交叉參照
本申請要求于2008年2月11日提交的美國臨時申請序列號 61/065,474,和于2007年3月6日提交的美國臨時申請序列號參考。
本發明的技術領域 本發明的技術領域涉及轉化生長因子-|3 (TGF-p)家族成員和可溶 性TGF-p受體，以及調節TGF-p家族成員的活性、用于治療各種病癥 的方法。
背景技術：
蛋白質的轉化生長因子p (TGF-p)家族包括轉化生長因子-(3 (TGF-p)、激活素、骨形態發生蛋白(BMP)、神經生長因子(NGFs)、 腦源性神經營養因子(BDNF)、和生長/分化因子(GDFs)。這些家族成 員涉及廣泛范圍的生物過程，包括細胞增殖、分化和其他功能的調節。
生長/分化因子8 (GDF-8)也稱為肌抑素(myostatin),是大多數情 況下在發育中的和成人骨骼肌組織的細胞中表達的TGF-13家族成員。 肌抑素看起來在負控制骨骼肌生長中發揮關鍵作用(McPherron等人， Nature (London) 387， 83-90 ( 1997 ))。拮抗肌抑素已顯示增加動物 中的無脂肪肌肉量(McFerron等人，同上，Zimmers等人，Science 296: 1486 (2002))
蛋白質的TGF-p家族的另一個成員是相關生長/分化因子GDF-ll。 GDF-11具有肌抑素氨基酸序列約90%的同一性。GDF-ll在發育中的動 物的軸向才莫式中具有作用(Oh等人，Genes Devil: 1812-26 ( 1997 ))， 并且看起來也在骨骼肌發育和生長中發揮作用。
激活素A、 B和AB分別是具有兩條多肽鏈M和朋的同二聚體和 異二聚體(Vale等人Nature 321, 776-779 ( 1986 ), Ling等人，Nature321, 779-782 ( 1986 ))。激活素最初作為涉及濾泡刺激激素合成調節的性腺肽而發現，并且目前被認為涉及許多生物活性的調節。激活素A是占優勢形式的激活素。
激活素、肌抑素、GDF-11和TGF-(3超家族的其他成員結合激活素II型和激活素IIB型受體且通過所述受體的組合發信號，所述2種受體都是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶(Harrison等人，J. Biol. Chem. 2",28036-28044 ( 2004 ))。交聯研究已測定肌抑素能夠在體外結合激活素II型受體ActRIIA和ActRIIB( Lee等人，PNAS USA 98: 9306-ll( 2 001 ))。還存在GDF-11與ActRIIA和ActRIIB結合的證據(Oh等人，Genes Dev16: 2749-54 ( 2002 ))。
已知TGF-卩蛋白質表達與各種疾病和病癥相關。因此，能夠拮抗幾種TGF-p蛋白質的治療分子同時可能是對于這些疾病和病癥特別有效的。
此外，蛋白質治療的產生可能合并在蛋白質表達和純化過程中發生的問題。 一個問題是在表達或純化過程中蛋白質的聚集。在細胞培養條件過程中高水平蛋白質的積累可能導致聚集。純化過程可能使蛋白質暴露于促進進一步聚集的另外因素(Cro歸ell, M.E.M.等人，TheAAPS Journal 8: E572-E579, 2006 )。可以嘗試減輕引起聚集的因素，然而，存在蛋白質設計為具有減少形成聚集物的傾向的需要。本發明滿足了對治療分子的需要，所述治療分子與多種配體結合，并且具有減少的聚集且因此具有改善的可制造性，以便有效產生對于治療TGF-卩相關疾病狀態有用的蛋白質。
發明概述
本發明提供了包含變體人激活素受體IIB (命名為vActRIIB)多肽的分離蛋白質。如本文所使用的，術語vActRIIB多肽指人vActRIIB多肽和人vActRIIB5多肽兩者。在一個實施方案中，蛋白質包含具有SEQIDNO: 2或18的氨基酸序列的多肽，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多肽能夠結合肌抑素、激活素A或GDF-ll。在一個實施方案中，蛋白質包含具有SEQ ID NO: 2或18的氨基酸序列的多肽，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由非天然氨基酸取代，并且其中信號肽被去除，并且其中所述多肽能夠結合肌抑素、激
7活素A或GDF-11。在一個實施方案中，蛋白質包含具有SEQ ID NO: 2或18的氨基酸序列的多肽，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由另一氨基酸取代，其中信號肽被去除，并且其中成熟多肽的N末端被截短，并且其中所述多肽能夠結合肌抑素、激活素A或GDF-ll。在一個實施方案中，N末端成熟截短的vActRIIB多肽缺乏成熟序列的N末端4個氨基酸或N末端6個氨基酸，其中所述多肽能夠結合肌抑素、激活素A或GDF-11。在一個實施方案中，在位置E28處的取代選自W、 Y和A。在一個進一步的實施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸A、 F、 Q、 V、 I、 L、 M、 K、 H、 W和Y。在一個進一步的實施方案中，在位置E40處的取代選自氨基酸G、 Q、 M、 H、 K和N。在一個進一步的實施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸A、 F、 Q、V、 I、 L、 M、 K、 H、 W和Y,并且在位置E40處的取代選自氨基酸A、 G、Q、 M、 H、 K和N。在一個進一步的實施方案中，多肽進一步包含異源蛋白質。在一個實施方案中，異源蛋白質是Fc結構域。在一個進一步的實施方案中，Fc結構域是人IgG Fc結構域。
在一個實施方案中，蛋白質包含具有SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 70、 72、 87、 88、 91、 93、95和97中所示氨基酸序列的多肽。
在另一個實施方案中，蛋白質包含由具有SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94、 96中所示序列或其互補序列的多核苷酸編碼的多肽。
在另一個方面，本發明提供了包含編碼vActRIIB多肽的多核苷酸的分離核酸分子。在一個實施方案中，核酸分子包含具有SEQ ID NO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 69、 71、 92、94、 96中所示核酸序列或其互補序列的多核苷酸。
在另一個實施方案中，核酸分子包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽由SEQ IDNO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97中所示氨基酸序列組成。
8在一個進一步的實施方案中，核酸分子進一步包含轉錄或翻譯調節序
列。在另一個方面，提供了包含vActRIIB核酸分子的重組載體。在另一個方面，提供了包含重組載體的宿主細胞，并且提供了生產vActRIIB多肽的方法。
本發明進一步提供了包含本發明的至少一種vActRIIB多肽或蛋白質的組合物。在一個實施方案中，組合物是包含與藥學上可接受的載體混合的vActRIIB多肽或蛋白質的藥物組合物。
在另一個方面，本發明提供了通過給受試者施用包含vActRIIB多肽或蛋白質的治療組合物，治療或預防患有肌肉消耗疾病的受試者中的此種病癥的方法。肌肉消耗疾病包括或起因于，但不限于下述狀況癌癥惡病質、肌營養不良、肌萎縮性側索硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、化學性惡病質、來自HIV/AIDS的惡病質、腎衰竭、尿毒癥、類風濕性關節炎、老年性骨骼肌減少癥(age-relatedsarcopenia)、老年性脆性(age-related fragility )、器官萎縮、腕管綜合征、雄激素剝奪、和由于長期臥床休息導致的不活動引起的肌肉消耗、脊髓損傷、中風、骨折和衰老。肌肉消耗還可以起因于太空飛行引起的失重、胰島素抵抗、由于燒傷引起的肌肉消耗、雄激素剝奪、和其他病癥。在另一個方面，本發明提供了治療與激活素A表達相關的疾病的方法。在一個實施方案中，疾病是癌癥。在另一個方面，本發明提供了治療代謝紊亂的方法，其包括給需要此種治療的受試者施用治療組合物，其中代謝紊亂選自骨丟失、糖尿病、肥胖、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、雄激素剝奪、和代謝綜合征。在另一個方面，本發明提供了治療組合物在制備用于治療上述病癥的藥物中的用途。在另一個方面，本發明提供了基因治療方法，其包括給有需要的受試者施用編碼本發明的vActRIIB多肽或蛋白質的載體，其中載體能夠在受試者中表達vActRIIB多肽或蛋白質。
附圖簡述
圖1。圖1顯示野生型可溶性ActRIIB-人IgGlFc的氨基酸序列(SEQID NO: 98)。信號肽序列是粗體的，隨后為成熟的ActRIIB細胞外結構域，以及斜體的人IgGl Fc,包括部分鉸鏈區。氨基酸E28和R40是有下劃線的。接頭序列GGGGS (SEQ ID NO: 75 )是4牛體且有下劃線的。
9圖2。圖2顯示可溶性ActRIIB5-人IgGlFc的氨基酸序列(SEQ IDNO: 99)。信號肽序列是粗體的，隨后為成熟的ActRIIB5可溶性結構域，并且人IgGl Fc,包括部分鉸鏈區是斜體的。E28和R40是有下劃線的。接頭序列GGGGS (SEQ ID NO: 75)是斜體且有下劃線的。
圖3。圖3顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對抑制素-a敲除小鼠中的睪丸(圖3A)和卵巢(圖3B)的影響。
圖4。圖4顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對雄性(圖4A )和雌性(圖4B)抑制素-a敲除小鼠中的存活率的影響。
圖5。圖5顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對攜帶結腸26肺瘤
的小鼠中的體重的影響。
圖6。圖6顯示可溶性vActRIIB-FcE28W處理對攜帶結腸26胂瘤
的小鼠中的存活的影響。
詳述
公開了包含變體人激活素IIB受體(vActRIIB)多肽的蛋白質。這些蛋白質和多肽的特征在于它們與3種TGF-(3蛋白質，即肌抑素
(GDF-8)、激活素A和GDF-11中的至少一種結合，且抑制這些蛋白質的活性的能力。與不包含本文公開的修飾的多肽比較，這些蛋白質和多肽還顯示出減少的聚集傾向。參照登記號NP —001 097 (SEQ ID NO:47 )的野生型ActRIIB、以及ActRIIB ( SEQ ID NO: 18)或ActRIIB5
(SEQ ID NO: 2)的細胞外結構域，修飾由在位置28、 40或28和40這兩者處的氨基酸取代組成。
如本文所使用的，術語"TGF-p家族成員"或"TGF-p蛋白質"指轉化生長因子家族的結構上相關的生長因子，包括激活素，以及生長和分化因子(GDF)蛋白質(Kingsley等人Genes Dev. 8: 133-146 ( 1994 ),McPherron 等人 Growth factors and cytokines . in health anddisease,第IB巻，D. LeRoi th和C. Bondy. 編輯，JAI Press Inc.,Greenwich, Conn, USA:第357-393頁)。
GDF-8也稱為肌抑素，是骨骼肌組織的負調節物(McPherron等人PNAS USA 94: 12457-12461 ( 1997 ))。肌抑素作為長度約375個氨基酸的無活性蛋白質復合物合成，對于人具有GenBank登記號AAB86694
(SEQ ID NO: 49)。前體蛋白質通過在四石咸基加工位點處的蛋白酶解切割激活，以產生N末端無活性前結構域和約109個氨基酸的C末端蛋白質，其二聚化以形成約25 kDa的同二聚體。這種同二聚體是成熟的、生物活性蛋白質(Zimmers等人，Science 296, 1486 ( 2002 ))。
如本文所使用的，術語"前結構域"或"前肽"指無活性的N末端蛋白質，其進行切割以釋放活性C末端蛋白質。如本文所使用的，術語"肌抑素"或"成熟的肌抑素"指單體、二聚體或其他形式的成熟的、生物活性C末端多肽，以及生物活性片段或相關多肽，包括等位基因變體、剪接變體、以及融合肽和多肽。已報告成熟的肌抑素在許多物種，包括人、小鼠、雞、豬、火雞和大鼠中具有100%序列同一性(Lee等人，PNAS 98， 9306 ( 2001 ))。
如本文所使用的，GDF-11指具有Swissprot登記號O95390(SEQ IDNO: 50)的BMP (骨形態發生蛋白)，以及那種蛋白質的變體和物種同源物。GDF-ll在氨基酸水平上與肌抑素具有約90%同一性。GDF-11涉及中軸骨駱的前/后沖莫式形成的調節(McPherron等人，Nature Genet.22 ( 93 ): 260-264 ( 1999 ); Gamer等人,Dev. Biol. 208 ( 1 ), 222-232(1999 )),但出生后功能未知。
激活素A是多肽鏈PA的同二聚體。如本文所使用的，術語"激活素A，，指具有GenBank登記號:NM—002192 (SEQ ID NO: 48)的激活素蛋白質，以及那種蛋白質的變體和物種同源物。
激活素受體
如本文所使用的，術語激活素II B型受體(ActRIIB)指具有登記號NP-001097 ( SEQ ID NO: 47 )的人激活素受體。術語可溶性ActRIIB包含ActRIIB ( SEQ ID NO: 18)、 ActRIIB5 ( SEQ ID NO: 2)的細胞外結構域，以及其中在位置64處的精氨酸由丙氨酸取代的這些序列。
變體可溶性ActRIIB多肽
本發明提供了包含人變體可溶性ActIIB受體多肽(本文稱為vActRIIB多肽、或變體多肽)的分離蛋白質。如本文所4吏用的，術語"vActRIIB蛋白質"指包含vActRIIB多肽的蛋白質。如本文所4吏用的，術語"分離的"指由內源材料純化至一定程度的蛋白質或多肽分子。這些多肽和蛋白質的特征在于具有結合且抑制激活素A、肌抑素或GDF-11中的任何一種的活性的能力。在某些實施方案中，與野生型多肽比較，
激活素A、肌抑素或GDF-11的變體多肽的結合親和力得到改善。
在一個實施方案中，vActRIIB多肽具有SEQ ID NO: 2或18的氨 基酸序列，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基 酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多肽能夠結合肌抑素、激 活素A或GDF-11。在另一個實施方案中，vActRIIB多肽是這些序列的 成熟形式、或截短的成熟形式。如本文所使用的，術語"成熟的vActRIIB 多肽"指氨基酸信號序列被去除的多肽。在一個實施方案中，成熟序列 是例如SEQ ID NO: 2的氨基酸19-160,和SEQ ID NO: 18的氨基酸 19-134，其中在位置28和40處的一個或全部兩個氨基酸由另一非天 然氨基酸取代，并且多肽保留與激活素A、肌抑素或GDF-11結合的能 力。如本文所使用的，術語截短的成熟的vActRIIB多肽指具有信號序 列并且來自成熟多肽的N末端的氨基酸被去除的多肽。在一個實施方 案中，成熟多肽的成熟的N末端4個氨基酸或N末端6個氨基酸被去 除。在這個實施方案中，截短的成熟序列是例如SEQ ID NO: 2的氨基 酸23-160,或SEQ ID NO: 2的氨基酸25-160;和SEQ ID NO: 18的 氨基酸23-134,或SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134,其中在位置28 和40處的一個或全部兩個氨基酸由非野生型氨基酸取代，其保留與激 活素A、肌抑素或GDF-11結合的能力。如本文所使用的，術語"位置 28"和"位置40"(即，E28和R40)指參照包括18個氨基酸的信號序列 的序列SEQ ID NO: 2和18而言的氨基酸位置。為了一致性，如果針 對成熟的或截短的成熟序列，成熟的vActRIIB多肽具有在位置10和/ 或位置22處的取代，或截短的成熟多肽具有在位置6和/或位置18處 的取代，或在位置4和/或位置16處的取代，那么這些變體仍將針對 全長SEQ ID NO: 2和18而言，或如圖1或2中所示，即在位置E28 和/或R40處的氨基酸取代。此種成熟的實施方案或N末端截短的實施 方案在下文例示。
在一個實施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸W、 Y和A。 在一個實施方案中，在位置28處的取代是W。在一個進一步的實施方 案中，在位置28處的取代選自氨基酸A、 F、 Q、 V、 I、 L、 M、 K、 H、 W 和Y。在一個進一步的實施方案中，在位置40處的取代選自氨基酸G、 Q、 M、 H、 K和N。在一個進一步的實施方案中，在位置28處的取代選
12自氨基酸A、 F、 Q、 V、 I、 L、 M、 K、 H、 W和Y,并且在位置40處的取 代選自氨基酸A、 G、 Q、 M、 H、 K和N。在一個實施方案中，蛋白質包 含具有選自SEQ ID N0: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97的氨基酸序列的多肽。 在另一個實施方案中，蛋白質包含由具有SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94、 96中所 示序列或其互補序列的多核苷酸編碼的多肽。
在一個實施方案中，信號序列從vActRIIB多肽中去除，留下成熟 的變體多肽。各種信號肽可以在本申請的多肽制備中使用。信號肽可 以具有圖l和2中所示的序列(SEQIDN0: 73)或可替代的信號序列， 例如SEQ ID NO: 74,即SEQ ID NO: 2和18的信號序列。可以使用對 于表達vActRIIB或vActRIIB5多肽有用的任何其他信號肽。
在另一個實施方案中，vActRIIB多肽具有與SEQ ID NO: 2和18 基本上相似的序列。如本文所使用的，術語"基本上相似的"指與SEQ ID NO: 2和18中所示的氨基酸序列具有至少約80%同一性、至少約85 %同一性、至少約90%同一性、至少約95%同一性、至少約98%同一 性或至少約99%同一性的多肽，并且其中在位置28和/或40處的一個 或全部兩個氨基酸由非野生型氨基酸取代，其中多肽保留SEQ ID NO: 2和18的多肽的活性，即結合且抑制肌抑素、激活素A或GDF-11的能 力。此外，術語vActRIIB多肽包含SEQ ID NO: 2或18的片段，例如 包含本文描述的在位置28和/或40處的取代的N和C末端截短，其中 所迷多肽能夠結合且抑制肌抑素、激活素A或GDF-11。
如本文所使用的，術語vActRIIB和vActRIIB5多肽的"書f生物"指 至少一種另外的化學部分、或至少一種另外的多肽的連接，以形成共 價或聚集綴合物例如糖基、脂質、乙酰基、或者C末端或N末端融合 多肽、與PEG分子的綴合、和下文更充分地描述的其他修飾。變體 ActRIIB受體多肽(vActRIIB)也可以包括另外的修飾和衍生物，包括 對于C和N末端的修飾，其來源于由于在各種細胞類型中表達的加工， 所述細胞類型例如哺乳動物細胞、大腸桿菌、酵母和其他重組宿主細 胞。另外包括的是vActRIIB多肽片4殳以及包含SEQ ID NO: 4、 6、 8、10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97中所示多肽序列的滅活的N糖基化位點、滅活的蛋白 酶加工位點、或保守氨基酸取代的多肽。
如本文所使用的，術語"vActRIIB或vActRIIB5多肽活性"或"可溶 性ActRIIB或ActRIIB5多肽的生物活性"指vActRIIB和vActRIIB5多 肽的 一種或多種體外或體內活性，其包括但不限于下文實施例中證實 的那些。vActRIIB多肽的活性包括但不限于與肌抑素或激活素A或 GDF-11結合的能力，以及減少或中和肌抑素或激活素A或GDF-11的活 性的能力。如本文所使用的，術語"能夠與肌抑素、激活素A或GDF-ll 結合"指通過本領域已知的方法，例如下文實施例2中描述的Biacore 法測量的結合。此外，在實施例2中，基于pMARE C2C12細胞的測定 方法測量激活素A中和活性、肌抑素中和活性、和GDF-ll中和活性。 體外活性包括但不限于增加體重、增加無脂肪月幾肉量(lean muscle mass)、增加骨骼肌肉量、減少脂肪量，如下文動物;^莫型中證實的和如 本領域已知的。生物活性進一步包括減少或預防由某些類型的癌癥引 起的惡病質、防止某些類型的肺瘤生長、且增加某些動物模型的存活。 vActRIIB多肽活性的進一步討論在下文提供。
本發明的多肽進一步包含直接或通過接頭序列與vActRIIB多肽連 接，以形成融合蛋白的異源多肽。如本文所使用的，術語"融合蛋白" 指具有經由重組DNA技術連接的異源多肽的蛋白質。異源多肽包括但 不限于Fc多肽、his標記、和亮氨酸拉鏈結構域，以促進變體ActRIIB 多肽的寡聚化和穩定化，如例如引入本文作為參考的WO 00/29581中 描述的。在一個實施方案中，異源多肽是Fc多肽或結構域。在一個實 施方案中，Fc結構域選自人IgGl、 IgG2和IgG4 Fc結構域。這些在 SEQ ID NO: 80、 82和84中提供。vActRIIB可以進一步包含與其各自 的IgG Fc區域鄰近的IgGl、 IgG2或IgG4的鉸鏈序列的全部或部分。 IgGl、 IgG2和IgG4的完整鉸鏈序列分別在SEQ ID NO: 76、 77和78 中提供。
vActRIIB多肽可以任選進一步包含"接頭"序列。接頭主要充當多 肽和第二種異源多肽或其他類型的融合物之間或者兩個或更多變體
ActRIIB多肽之間的間隔物。在一個實施方案中，接頭由通過肽4建連接在一起的氨基酸組成，優選通過肽鍵連接的1-20個氨基酸，其中氨基 酸選自20種天然存在的氨基酸。這些氨基酸中的一個或多個可以是糖 基化的，如本領域技術人員了解的。在一個實施方案中，1-20個氨基 酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。優 選地，接頭由非空間位阻的大部分氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸組成。 示例性接頭是聚甘氨酸(特別是(Gly) 5、 (Gly) 8、聚(Gly-Ala)和 聚丙氨酸。如下文實施例中所示的一種示例性合適的接頭是(Gly )4Ser (SEQ ID NO: 75)。在一個進一步的實施方案中，vActRIIB可以包含 鉸鏈接頭，這是提供與鉸鏈區鄰近的接頭序列，如SEQ ID NO: 79中 例示的。
接頭也是非肽接頭。例如，可以使用烷基接頭例如-麗-(CH2) s-C (0)-,其中s = 2-20。這些烷基接頭可以進一步由任何非空間位阻 基團取代，所述基團例如低級烷基(例如d-")、低級酰基、卣素(例 如C1、 Br)、 CN、麗2、苯基等。
在一個實施方案中，vActRIIB多肽可以直接或經由接頭或經由4交 鏈接頭與Fc多肽連接。在一個實施方案中，Fc是人IgG Fc。與Fc連 接的vActRIIB包括例如vActRIIB-IgGlFc、 E28A (SEQ ID NO: 60); vActRIIB-IgGlFc、 E28W(SEQ ID NO: 62)、 vActRIIB-IgGlFc、 E28Y (SEQ ID NO: 64)、 vActRIIB-IgG Fc 、 R40G (SEQ ID NO: 66 vActRIIB5-IgGlFc、 E28A ( SEQ ID NO: 70 )和vActRIIB5-IgGlFc E28W (SEQ ID NO: 72),如表1和2中所示，以及在本文實施例中描述。 進一步的實施方案包括vActRIIB-IgG2 Fc、 E28W (SEQ ID NO: 91)、 vActRIIB-IgG2 Fc、 E28Y ( SEQ ID NO: 93 )和vActRIIB-IgG2 Fc ( SEQ ID NO: 95)。如下文實施例中證實的，與野生型ActRIIB-IgG2 IgG2 比較，變體已證實產生更少的聚集。
本文公開的vActRIIB多肽還可以與非多肽分子連接用于賦予所需 性質的目的，所述性質例如減少降解和/或增加半衰期、減少毒性、減 少免疫原性、和/或增加ActRIIB多肽的生物活性。示例性分子包括但 不限于線性聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚賴氨酸、葡聚糖；脂質； 膽固醇基團(例如類固醇)；碳水化合物、或寡糖分子。
在另一個方面，本發明提供了包含編碼本發明的vActRIIB多肽 多核普酸的分離核酸分子。如本文所使用的，術語"分離的"指由內源材料純化至一定程度的核酸分子。在一個實施方案中，本發明的核酸分
子包含編碼SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97的多肽的多核苷酸。 由于已知的遺傳密碼簡并性(其中超過一個密碼子可以編碼相同氨基 酸)，DNA序列可以與SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96中所示的那種，或SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96的互補鏈不同，并且仍編碼具有SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97的氨基酸序列的多肽。此種變體DNA序列可以起因于 在生產過程中發生的沉默突變，或可以是這些序列的有意誘變的產物。 在另一個實施方案中，本發明的核酸分子包含具有SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96中所示的多核普酸序列，或SEQIDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96的互補鏈的 多核苷酸。在另一個實施方案中，本發明提供了這樣的核酸分子，其 在嚴格或中等條件下與SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、
23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、
59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96的多肽編碼區雜交，其中 所編碼的多肽包含SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、
24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、
60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97中所示的氨 基酸序列，并且其中所編碼的多肽保持vActRIIB多肽的活性。
本發明的核酸分子包含單鏈和雙鏈形式的DM,及其RM互補序列。 DM包括例如cDNA、基因組DNA、合成DNA、由PCR擴增的DNA、及其 組合。基因組DNA可以通過常規技術進行分離，例如通過使用SEQ IDNO:1或17的DNA或其合適的片段作為探針。編碼ActRIIB多肽的基因組 DNA得自對于許多物種可用的基因組文庫。合成DNA可以這樣獲得重 疊寡核普酸片段的化學合成，隨后為片段的組裝，以重構編碼區和側 翼序列的部分或全部。RNA可以得自指導mRNA的高水平合成的原核生 物表達載體，例如使用T7啟動子和RM聚合酶的載體。cDNA得自由 mRNA制備的文庫，所述mRNA從表達ActRIIB的各種組織中分離。本發 明的DNA分子包括全長基因以及其多核普酸和片段。全長基因也可以 包括編碼N末端信號序列的序列。
在本發明的另一個方面，還提供了包含核酸序列的表達載體，并 且還提供了用此種載體轉化的宿主細胞和產生vActRIIB多肽的方法。 術語"表達載體"指用于由多核苦酸序列表達多肽的質粒、噬菌體、病毒 或載體。用于表達vActRIIB多肽的載體最少包含對于載體繁殖和克隆 的插入片段表達所需的序列。表達載體包含轉錄單位，所述轉錄單位 包含(1)在基因表達中具有調節作用的遺傳元件，例如啟動子或增強 子，(2 )編碼待轉錄成mRM且翻譯成蛋白質的vActRIIB多肽的序列， 和(3)合適的轉錄起始和終止序列的組裝。這些序列可以進一步包括 選擇標記。適合于在宿主細胞中表達的載體可容易獲得，并且核酸分 子使用標準重組DNA技術插入載體內。此種載體可以包括在特定組織 中起作用的啟動子，和用于在祐:耙定的人或動物細胞中表達vActRIIB 的病毒載體。適合于表達vActRIIB的示例性表達載體是包含vActRIIB 多核苷酸的pDSRa (在引入本文作為參考的W0 90/14363中描述)及其 衍生物，以及本領域已知的或下文描述的任何另外合適的載體。
本申請進一步提供了制備vActRIIB多肽的方法。可以利用各種其 他表達/宿主系統。這些系統包括但不限于微生物例如用重組噬菌體轉 化的細菌、質粒或粘粒DNA表達載體；用酵母表達載體轉化的酵母； 用病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用病毒表 達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)轉染的 或用細菌表達載體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統； 或動物細胞系統。在重組蛋白質產生中有用的哺乳動物細胞包括但不 限于VER0細胞、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、或其衍生 物例如在無血清培養基中生長的Veggie CH0和相關細胞系(參見Rasmussen等人，1998, Cytotechnology 28: 31)、或DHFR缺陷的CHO 抹DX-Bll (參見Urlaub等人，1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20 ), COS細胞例如猴腎細胞的COS-7系(ATCC CCL 1651 )(參見 Gl謹an等人，1981, Cell 23: 175 ), W138, BHK, HepG2， 3T3(ATCC CCL 163), RIN, MDCK， A549， PC12, K562， L細月包，C127細月包，BHK (ATCC CRL 10)細胞系，衍生自非洲綠猴腎細胞系CV1的CV1/EBNA 細胞系(ATCC CCL 7G)(參見McMahan等人,1991， EMB0 J. 10: 2821 ), 人胚腎細胞例如293、 293 EBNA或MSR 293,人表皮A431細胞，人Co1()205 細胞，其他轉化的靈長類動物細胞系，正常二倍體細胞，衍生自原代 組織的體外培養的細胞株，原代外植體，HL-60, U937 , HaK或Jurkat
溶性多肽。
使用合適的宿主-載體系統，vActRIIB多肽通過在允許產生的條件 下培養宿主細胞來重組產生，所述宿主細胞用包含本發明的核酸分子 的表達載體轉化。轉化細胞可以用于長期、高產率多肽生產。 一種此 種細胞用包含選擇標記以及所需表達盒的載體轉化，可以允許該細胞 在其轉換到選擇培養基前在富集培養基中生長1-2天。選擇標記設計 為允許成功表達引入序列的細胞的生長和回收。穩定轉化細胞的抗性 簇可以使用適合于所采用的細胞系的組織培養技術進行增殖。重組蛋 白質表達的概述在Methods of Enzymology,第185巻，Goeddell, D. V., 編輯，Academic Press ( 1990 )中發現。
在某些情況下，例如在使用原核系統的表達中，本發明的表達多 肽可能需要"重折疊，，且氧化成合適的三級結構并且產生二硫鍵，以便成 為生物活性的。重折疊可以使用本領域眾所周知的許多操作來實現。 此種方法包括例如在離液劑的存在下使溶解的多肽暴露于通常超過7 的pH。離液劑的選擇類似于用于包含體溶解的選擇，然而，離液劑一 般以較低濃度使用。示例性離液劑是胍和尿素。在大多數情況下，重 折疊/氧化溶液也將包含特定比例的還原劑加其氧化形式，以產生允許 二硫化物改組發生的特定氧化還原電位，用于形成半胱氨酸橋。某些 常用的氧化還原偶包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二^5克代雙GSH、氯化 銅、二硫蘇糖醇DTT/二p塞烷DTT、和2-巰基乙醇(bME ) /二硫代-bME。 在許多情況下，共溶劑可以用于增加重折疊的效率。常用的共溶劑包括甘油、各種分子量的聚乙二醇和精氨酸。
此外，可以根據常規技術在溶液中或在固體支持物上合成多肽。 各種自動合成儀是商購可得的，并且可以根據已知方案進行使用。參
見例如，Stewart和Young, Solid Phase Peptide Synthesis,第2 版，Pierce Chemical Co. ( 1984 ); Tarn等人，J Am Chem Soc, 105: 6442, ( 1983 ); Merrifield, Science 232: 341-347 ( 1986 ); Barany 和Merrifield, The Pept ides, Gross和Meienhofer,編輯，Academic Press, New York, 1-284; Barany等人,Int J Pep Protein Res , 30: 705-739 ( 1987 )。
本發明的多肽和蛋白質可以根據本領域技術人員眾所周知的蛋白 質純化技術進行純化。這些技術在一個水平上涉及蛋白質和非蛋白質 級分的粗分級分離。使肽多肽與其他蛋白質分開后，目的肽或多肽可 以使用層析和電泳技術進行進一步純化，以達到部分或完全純化(或 純化至同質性)。如本文所使用的，術語"分離的多肽"或"純化的多肽" 意指可與其他組分分離的組合物，其中多肽純化至相對于其可天然獲
得狀態的任何程度。純化多肽因此也指離開它可能天然存在的環境的 多肽。 一般地，"純化的"將指已實施分級分離以去除各種其他組分的多 肽組合物，并且所述組合物基本上保留其表達的生物活性。當使用術 語"基本上純化的"時，這個命名將指這樣的肽或多肽組合物，即，其中 肽或多肽形成組合物的主要組分，例如構成組合物中約50%、約60%、 約70%、約80%、約85%或約90%或更多的蛋白質。
適合于在純化中使用的各種技術將是本領域技術人員眾所周知 的。這些包括例如用硫酸銨、PEG、抗體(免疫沉淀)等或通過熱變性 沉淀，隨后離心；層析例如親和層析(蛋白質A柱)、離子交換、凝膠 過濾、反相、羥基磷灰石、疏水相互作用層析；等電點聚焦；凝膠電 泳；以及這些4支術的組合。如本領域一^:已知的，^人為扭J亍各種純化^ 步驟的順序可以改變，或某些步驟可以省略，并且仍得到用于制備基 本上純化的多肽的合適方法。示例性純化步驟在下文實施例中提供。
用于對多肽純化程度進行定量的各種方法依照本公開內容將是本 領域技術人員已知的。這些包括例如測定活性級分的特異性結合活性、 或通過SDS/PAGE分析評估級分內的肽或多肽量。用于評估多肽級分的 純度的優選方法是計算級分的結合活性，使其與起始提取物的結合活性比較，且因此計算純化程度，在本文中通過"純化倍數"評估。用于代 表結合活性量的實際單位當然將依賴在純化后所選擇的具體測定技 術，以及多肽或肽是否顯示可檢測的結合活性。
變體激活素IIB型多肽與激活肌肉降解級聯的配體結合。能夠結 合且抑制配體激活素A、肌抑素和/或GDF-11的活性的vActRIIB多肽 具有針對涉及肌肉萎縮的疾病，以及治療某些癌癥和如下文實施例中 所示的其他疾病的治療潛力。
然而，聚集可以在表達或純化野生型ActRIIB或ActRIIB5多肽時 發生。這種聚集包括在表達過程中有結構的寡聚體形成，以及在表達 過程中和多肽純化后無結構的聚集物的產生。
結構分析、分子建模和質譜法的組合方法已表明，多聚化可以經 由分子間二硫鍵形成在ActRIIB多肽中出現，所述分子間二硫鍵形成 由非糖基化的ActRIIB多肽之間的靜電和氫鍵合相互作用幫助。顯著 的氫鍵存在于兩個ActRIIB分子的界面處；例如在一個ActRIIB的E28 側鏈和另一個ActRIIB的R40側鏈之間。此外，關4建的靜電相互作用 存在于一個ActRIIB的E28和另一個ActRIIB的R40之間。
這些靜電相互作用可以顯著促成增加暫時的ActRIIB二聚體群體， 導致促進在ActRIIB單位之間的非共價和/或共價鍵形成。殘基28和 40之間的相互作用是這些相互作用中最關鍵的，因為這兩個殘基參與 雙氫鍵和強靜電相互作用。殘基28和40參與ActRIIB: ActRIIB相互 作用而不參與ActRIIB:配體相互作用。因此，殘基28和40根據本發 明可以由非天然氨基酸取代，以改善溶解度、且減少受體多肽的聚集。 因此，E28和R40可以分別由其他可能的天然氨基酸取代、表達、且如 下所述通過Bi&core進4亍測試。Biacore測定的結合顯示于下文實施例 2中的表1A和1B中。此外，vActRIIB多肽的聚集百分比在下文測定。
下文實施例中的結果顯示具有本文描述的氨基酸取代的vActRIIB 多肽和蛋白質的聚集減少，同時保留結合且中和肌抑素、激活素A或 GDF-ll的能力。
抗體
本發明進一步包括與變體ActRIIB多肽結合的抗體，包括與本發 明的vActRIIB多肽特異性結合的那些。如本文所使用的，術語"特異
20性結合"指對于vActRIIB多肽具有106 M—或更大的結合親和力(Ka) 的抗體。如本文所使用的，術語"抗體"指完整抗體，包括多克隆抗體(參 見侈'H口 Ant ibodies: A Laboratory Manua 1, Harlow和Lane (編4辱)， Cold Spring Harbor Press, ( 1988 ))，和單克隆抗體(參見例如美國 專利號RE 32,011、 4,902,614 、 4,543,439和4,411,993,以及 Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Ke誕tt， McKearn和Bechtol (編輯)(1980 ))。如本 文所使用的，術語"抗體，，還指通過重組DM技術或者通過酶促或化學切 割完整抗體產生的抗體片段，例如F(ab)、 F(ab，)、 F ( ab， ) 2、 Fv、 Fc和單鏈抗體。術語"抗體"還指雙特異性或雙功能抗體，其是具有兩 個不同重/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體 可以通過各種方法產生，包括雜交瘤的融合或Fab，片段的連接(參見 Songsivilai等人，CI in. Exp. Immunol. 79: 315-321( 1990 ), Kostelny 等人，J. Imm畫1.148: 1547-1553 ( 1992 ))。
如本文所使用的，術語"抗體"還指嵌合抗體，即具有與一個或多個 非人可變抗體免疫球蛋白結構域偶聯的人恒定抗體免疫球蛋白結構域 的抗體，或其片段(參見例如，美國專利號5， 595， 898和美國專利號 5， 693， 493 )。抗體還指"人源化"抗體(參見例如，美國專利號4, 816， 567 和W0 94/1 0332 )、樣￡抗體(minibodies) (W0 94/09817 )、 大抗體 (maxibodies )、和由轉基因動物產生的抗體，其中包含產生人抗體的 基因的一部分但在內源抗體產生方面缺陷的轉基因動物能夠產生人抗 體(參見例如,Mendez等人,Nature Genetics 15: 146-156 ( 1997 ) 和美國專利號6,300,129 )。術語"抗體"還包括多聚抗體、或蛋白質的
更高級別復合物例如異二聚抗體和抗獨特型抗體。"抗體"還包括抗獨特 型抗體。抗vActRIIB的抗體可以例如用于在體外和體內鑒定且定量 vActRIIB。
還包括的是來自任何哺乳動物的多克隆抗體，例如小鼠和大鼠抗 體、和兔抗體，其與本文描述的vActRIIB多肽特異性結合，所述 vActRIIB多肽包4舌SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97。
此種抗體可以用作研究工具并且可以在定量測定中用于檢測且測定本文公開的多肽。此種抗體使用上文描述的方法和如本領域已知的
來制備。
藥物組合物
還提供了包含本發明的vActRIIB蛋白質和多肽的藥物組合物。此 種組合物包含與藥學上可接受的材料和生理學上可接受的制劑材料混 合的、治療或預防有效量的多肽或蛋白質。藥物組合物可以包含用于 修飾、維持或保留例如組合物的pH、重量摩爾滲透壓濃度、粘性、澄 清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速度、吸 收或滲透的制劑材料。合適的制劑材料包括但不限于，氨基酸(例如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；抗微生物劑；抗氧 化劑(例如抗壞血酸、亞石危酸鈉或亞碌u酸氫鈉)；纟爰沖劑(例如硼酸鹽、 碳酸氫鹽、Tris-HC1、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機酸)；膨脹劑(例 如甘露醇或甘氨酸)，螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA ));絡合劑(例 如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、(3-環糊精或羥丙基-P-環糊精)；填充劑； 單糖；二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質 (例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調味劑和稀釋劑； 乳化劑；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成鹽抗 衡離子(例如鈉)；防腐劑(例如苯扎氯銨、苯曱酸、水楊酸、硫柳汞、 苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或 過氧化氫)；溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露 醇或山梨糖醇)；懸浮劑；表面活性劑或濕潤劑(例如普流羅尼 (pluronics)、 PEG、脫水山梨糖醇酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯 例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油 酸酯、triton、氨基丁三醇、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal);穩定性 增強劑(蔗糖或山梨糖醇)；張度增強劑(例如堿金屬鹵化物(優選氯 化鈉或鉀、甘露醇、山梨糖醇)；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和/或 藥物佐劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 18片反，A. R. Gennaro, 編輯,Mack Publishing Company, 1990 )。
最佳藥物組合物將通過本領域技術人員依賴例如預期施用途徑、 遞送形式和所需劑量進4亍確定。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,同上。此種組合物可以影響身體狀態、穩定性、體內釋放速度、和多肽的體內清除速度。例如，合適的組合物 可以是用于腸胃外施用的注射用水、生理鹽水溶液。
藥物組合物中的主要媒介物或載體的性質可以是水性的或非水性 的。例如，合適的々某介物或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人 工腦脊液，可能補充有在用于腸胃外施用的組合物中常見的其他材料。 中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是進一 步的示例性媒介物。
其他示例性藥物組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩沖液、或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩沖液，其可以進一步包括山梨糖醇或其合適的替代 物。在本發明的一個實施方案中，組合物可以通過使具有所需純度的 所選纟且合物與^f壬選的酉己制試劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences,同上)，以凍干團塊或水i容液的形式制備用于貯存。此外， 治療組合物可以<吏用合適的賦形劑例如蔗糖配制為凍干物。
制劑可以以各種方法進4亍遞送，例如通過吸入療法、口月l或通過 注射。當考慮腸胃外施用時，用于在本發明中使用的治療組合物可以 是包含藥學上可接受的媒介物中的所需多肽的無熱原、腸胃外可接受 的水溶液的形式。用于腸胃外注射的特別合適的媒介物是無菌蒸餾水， 其中多肽配制為無菌、等滲溶液，適當保存。另外一種制劑可以涉及 所需分子與試劑的配制，所述試劑例如可注射微球體、生物可蝕解顆 粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂質體，所述試劑提供 用于產物的控制或持續釋放，所述產物隨后可以經由儲存注射進行遞 送。還可以使用透明質酸，并且這可以具有促進循環中的持續時間的 置。； 、、 、 。 、纟、、"
在另一個方面，適合于可注射施用的藥物制劑可以在水溶液中進 行配制，優選在生理學上相容的緩沖液中，例如Hanks液、林才各氏溶 液或生理學緩沖鹽水。水性注射懸浮液可以包含增加懸浮液的粘度的 物質，例如羧曱基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐。此外，活性化合 物的懸浮液可以制備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂溶劑或媒 介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三 酯或脂質體。非脂質聚陽離子氨基聚合物也可以用于遞送。任選地， 懸浮液還可以包含合適的穩定劑或試劑，以增加化合物的溶解度且允 許制備高濃縮溶液。在另一個實施方案中，藥物組合物可以配制用于
23個實施方案中，溶液可以是霧化的。肺施用在PCT申請號 PCT/US94/001875中進一步描述，所述專利申請描述化學修飾的蛋白質 的肺遞送。
還考慮某些制劑可以口服施用。在本發明的一個實施方案中，以
制中通常使用的那些載體進行配制。例如，膠嚢可以設計為在胃腸道 中的點上當生物利用度達到最大和系統前降解降到最低時釋放制劑的 活性部分。可以包括另外的試劑以促進治療分子的吸收。還可以采用 稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑 和粘合劑。用于口服施用的藥物組合物也可以使用本領域眾所周知的 藥學上可接受的載體以適合于口服施用的劑量進行配制。此種載體使 得藥物組合物能夠配制為用于由患者攝入的片劑、丸劑、錠劑、膠嚢、 液體、凝膠、糖漿劑、膏劑、懸浮液等。
用于口服使用的藥物制劑可以這樣獲得使活性化合物與固體賦 形劑組合，且加工所產生的顆粒混合物(任選地，在研磨后)，以獲得 片劑或錠劑核心。需要時，可以加入合適的助劑。合適的賦形劑包括 碳水化合物或蛋白質填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和 山梨糖醇；來自玉米、小麥、稻、馬鈴薯或其他植物的淀粉；纖維素， 例如甲基纖維素、羥丙基曱基纖維素、或羧曱基纖維素鈉；樹膠，包 括阿拉伯膠和黃蓍膠；和蛋白質例如明膠和膠原。需要時，可以加入
崩解劑或增溶劑，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂和海藻酸或其鹽， 例如海藻酸鈉。
錠劑核心可以與合適的包衣例如濃縮糖溶液結合使用，所述包衣 還可以包含阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、 聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液、和合適的有機溶劑或溶劑混合物。 染料或色素可以加入片劑或錠劑包衣內，用于產品鑒定或表征活性化 合物的量，即劑量。
可以口服使用的藥物制劑還包括由明膠制成的推入配合膠嚢，以 及由明膠制成的軟的、密封膠嚢，和包衣例如甘油或山梨糖醇。推入 配合膠嚢可以包含與填充劑或粘合劑例如乳糖或淀粉，潤滑劑例如滑 石粉或硬脂酸鎂混合，和任選與穩定劑混合的活性成分。在軟膠嚢中，活性化合物可以連同或不連同穩定劑溶解或懸浮于合適的液體內，所 述液體例如脂肪油、液體、或液體聚乙二醇。
另外的藥物組合物對于本領域技術人員將是顯而易見的，包括涉 及在持續或控制遞送制劑中的多肽的制劑。用于配制各種其他持續或 控制遞送方式，例如脂質體載體、生物可蝕解的微粒或多孔珠和儲存 注射的技術，也是本領域技術人員已知的。參見例如，描述用于遞送
藥物組合物的多孔聚合微粒的控制釋放的PCT/US93/00829。持續釋放 制劑的另外例子包括成形物品形式的半透聚合物基質，例如膜或微膠 嚢。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚交酯(U. S. 3， 773， 919、 ep 58,481)、 l-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物(Sidman等人， Biopolymers， 22: 547-556 ( 1983 )、聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯) (Langer等人，J. Biomed. Mater. Res. , 15: 167-277， ( 1981 ); Langer 等人，Chem. Tech.,12: 98-105 ( 1982 ))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer 等人，同上)或聚-D (-) -3-羥丁酸(EP 1 33,988 )。持續釋放的組合 物還包括脂質體，其可以通過本領域已知的幾種方法中的任何一種進 行配制。參見例如，Eppstein等人，PNAS (USA )， 82: 3688( 1985 ); EP 36,676; EP 88,046; EP 143, 949。
待用于體內施用的藥物組合物一般必須是無菌的。這可以通過經 過無菌濾膜過濾來實現。當組合物凍干時，使用這種方法的滅菌可以 在凍干和重配前或后執行。用于腸胃外施用的組合物可以以凍干形式 或在溶液中進行貯存。此外，腸胃外組合物一般置于具有無菌進入口 的容器內，例如具有可由皮下注射針穿透的塞子的靜脈內溶液包或管 形瓶。
一旦藥物組合物已配制，它就作為溶液、懸浮液、凝膠、乳狀液、 固體或脫水或凍干粉劑貯存于無菌管形瓶內。此種制劑可以以立即可 用形式或以在施用前需要重配的形式(例如，凍干的)進行貯存。
在一個具體實施方案中，本發明涉及用于產生單劑施用單位的試 劑盒。試劑盒可以各自包含具有干燥蛋白質的第一個容器和具有水制 劑的第二個容器。還包括在本發明的范圍內的是包含單和多室預填充 注射器(例如，液體注射器和溶解注射器(lyosyringes ))的試劑盒。
在治療上采用的有效量的藥物組合物將依賴例如治療背景和目 的。本領域技術人員應當理解用于治療的合適劑量水平因此將部分依遞送的分子、多肽用于的適應癥、施用途徑、以及患者的體型(體重、 體表或器官大小)和狀況(年齡和一般健康)而變化。因此，臨床醫 生可以逐步滴加劑量且修改施用途徑以獲得最佳療效。
一 般的劑量可
以是約O. lmg/kg -最多約IOO mg/kg或更多，依賴上文提及的因素。 多肽組合物可以優選靜脈內注射或施用。長效藥物組合物可以每3-4 天、每周或每2周進行施用，依賴具體制劑的半衰期和清除率。給藥 頻率將依賴使用的制劑中的多肽的藥代動力學參數。 一般地，施用組 合物直至達到實現所需效應的劑量。組合物因此可以作為單劑或多劑 (以相同或不同濃度/劑)隨時間施用，或作為連續輸注施用。常規進 行合適劑量的進一步改善。合適劑量可以通過使用合適的劑量-反應數 據進行確定。
藥物組合物的施用途徑依照已知方法，例如口月l、通過4爭月永內、 腹膜內、大腦內(實質內)、腦室內、肌內、目艮內、動脈內、門靜脈 內、病變內途徑、髓內、鞘內、心室內、經皮、皮下或腹膜內注射； 以及鼻內、腸內、局部、舌下、尿道、陰道或直腸方法，通過持續釋 放系統或通過植入裝置施用。需要時，組合物可以通過推注或連續輸 注或通過植入裝置進行施用。可替代地或另外地，組合物可以經由植 入已吸附或封裝所需分子的膜、海綿或其它合適材料進行局部施用。 當使用植入裝置時，裝置可以植入任何合適的組織或器官內，并且所 需分子的遞送可以經由擴散、定時釋放丸或連續施用。
在某些情況下，本發明的vActRIIB多肽可以通過植入某些細胞進 行遞送，所述細胞已使用例如本文描述的那些方法進行基因工程化， 以表達和分泌多肽。此種細胞可以是動物或人細胞，并且可以是自體 的、異體的或異種的。任選地，細胞可以是永生化的。為了減少免疫 應答的機會，細胞可以進行封裝以避免滲入周圍組織。封裝材料一般 是生物相容的、半透的聚合外殼或膜，其允許多肽產品的釋放，但避 免細胞被患者的免疫系統或來自周圍組織的其他有害因子破壞。
還考慮了在體內的vActRIIB基因療法，其中將編碼vActRIIB或 vActRIIB書亍生物的核酸分子直接引入受試者內。例如，經由核酸構建
體連同或不連同合適的遞送載體例如腺伴隨病毒載體的局部注射，將 編碼vActRIIB的核酸序列引入耙細胞內。可替代的病毒載體包括但不 限于逆轉錄病毒、腺病毒、單純皰滲病毒和乳頭瘤病毒載體。可以通過包含所需核酸序列的所需核酸構建體或其他合適的遞送載體的局部
注射、脂質體介導的轉移、直接注射(棵露DNA)或微粒轟擊(基因槍) 在體內實現病毒載體的物理轉移。
vActRIIB組合物的用途
本發明提供了通過使多肽與vActRIIB多肽接觸，用于在體內和在 體外減少或中和肌抑素、激活素A或GDF-ll的量或活性的方法和藥物 組合物。vActRIIB多肽對于肌抑素、激活素A和GDF-11具有高親和力， 并且能夠減少且抑制肌抑素、激活素A和GDF-ll中的至少一種的生物 活性。在某些實施方案中，與野生型ActRIIB多肽比較，vActRIIB多 肽顯示出改善的活性。這在下文實施例中證實。
在一個方面，本發明提供了通過給受試者施用有效劑量的 vAc t R11B組合物，用于治療需要此種治療的受試者中的肌抑素相關和/ 或激活素A相關病癥的方法和試劑。如本文所使用的，術語"受試者" 指任何動物，例如哺乳動物，包括人。
本發明的組合物用于增加作為體重百分比的無脂肪肌肉量且減少
作為體重百分比的脂肪量。
可以通過vActRIIB組合物治療的病癥包括]旦不限于各種形式的朋j 肉消耗、以及代謝紊亂例如糖尿病和相關病癥、和骨退化性疾病例如 骨質疏松癥。vActRIIB組合物已證實在治療下文實施例3中所示的各 種疾病才莫型的肌肉消耗病癥中有效。這在抑制素-a敲除小鼠中的肌肉 消耗治療、結腸-26癌癥惡病質模型中的肌肉消耗治療、后肢懸吊模型 中的肌肉萎縮預防、顯示無脂肪肌肉量中的增加的0XV雌性治療、脂 肪量的減少和骨礦物質含量的增加中得到證實。
肌肉消耗病癥還包括營養不良，例如杜興氏肌營養不良、進行性 肌營養不良、貝克型肌營養不良、代-蘭二氏肌營養不良、歐勃肌營養 不良、和嬰兒神經軸突肌營養不良。另外的肌肉消耗病癥起于慢性疾 病或病癥，例如力幾萎縮性側索硬—化、充血性阻塞性肺疾病、癌癥、AIDS、 腎衰竭、器官萎縮、雄激素剝奪和類風濕性關節炎。
肌抑素和/或激活素的超量表達可以促成惡病質，即一種嚴重的肌 肉和脂肪消耗綜合征。vActRIIB多肽在治療動物模型中的惡病質中的 有效性在下文實施例3中顯示。惡病質也由于類風濕性關節炎、糖尿
27病腎病、腎衰竭、化學療法、由于燒傷導致的損傷以及其他原因而出 現。在另一個例子中，發現肌抑素免疫反應蛋白質的血清和肌內濃度
在顯示出AIDS相關肌肉消耗的人中增加，并且與無脂肪量體重相關 (Gonzalez-Cadavid等人，PNAS USA 95: 14938-14943 ( 1998 ))。肌 抑素水平還已顯示反應于燒傷而增加，導致分解代謝肌效應(Lang等 人，FASEB J 15, 1807-1809 ( 2001 ))。導致月幾肉消耗的另外狀況可能 起于由于殘廢導致的不活動，例如限制在輪椅中、由于中風長期臥床 休息、疾病、脊髓損傷、骨折或創傷、和微重力環境(太空飛行)中 的肌肉萎縮。例如，發現血漿肌抑素免疫反應蛋白質在長期臥床休息 后增加(Zachwieja等人J Gravit Physiol. 6 ( 2 ): 11 ( 1999 )。還 發現與未暴露的大鼠肌肉比較，在航天穿梭飛行過程中暴露于微重力 環境的大鼠肌肉表達增加量的肌抑素(Lalani等人，J. Endocrin 167 (3 ): 417-28 ( 2000 ))。
此外，脂肪與肌肉比的年齡相關性增加、以及年齡相關的肌肉萎 縮看起來與肌抑素相關。例如，在年輕(19-35歲)、中年(36-75歲) 和老年(76-92歲)男性和女性的組中，平均血清肌抑素-免疫反應性 蛋白質伴隨年齡而增加，而在這些組中平均肌肉量和無脂肪體重伴隨 年齡而減少(Yarasheski等人J Nutr Aging 6 ( 5 ): 343-8 ( 2002 ))。 此外，目前已發現肌抑素在心肌中以4氐水平表達，并且表達在梗死后 的心肌細胞中上調(Sharma等人，J Cell Physiol. 180( 1 ): 1-9( 1999 ))。 因此，減少心肌中的肌抑素水平可能改善梗死后心肌的恢復。
肌抑素看起來還影響代謝紊亂，包括2型糖尿病、非胰島素依賴 型糖尿病、高血糖癥和肥胖。例如，肌抑素的缺乏已顯示改善兩個小 鼠模型的肥胖和糖尿病表型(Yen等人/, & 479 ( 19")。已 在美國申請序列號11/590,962、美國申請
發明者K·S·郭, L·T·譚, 周小嵐, 宣延勛, 韓江泉 申請人:安姆根有限公司