用于切斷和/或連結單鏈dna的組合物的制作方法

專利名稱：用于切斷和/或連結單鏈dna的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于切斷和/或連結單鏈DNA的組合物。
背景技術：
運用基因工程方法進行的重組DNA技術，是當前的生物產業JtA不 可或缺的重要技術。例如，近年來，在醫療領域，即侵是其有效性被關注 的蛋白質制劑的開發及制造，若不使用重組DNA技術就幾近不可能進行 與需要相稱的制劑的供給，即便說沒有該技術則現在的醫療發展無從談 起，也不為過。另外，不僅是為了蛋白質制劑的開發，而且也為了在研究 開發中使用的蛋白質試劑的開發，均要求DNA操作技術的進一步逸艮。
每當進行DNA的重組操作時，作為最基本的技術，可以舉出DNA的 切斷、自由末端的結合，但成為這樣的操作對象的DNA大多是雙鏈DNA。 迄今為止，大多數情況下都是利用DNA作為"編碼蛋白質并表達的工具"， 所以研究者們的興趣集中在雙鏈DNA的操作技術的進步。但是，目前， 隨著生命工程的對象領域的擴大，進行單鏈DNA的操作的機會也增加。 例如，在制作DNA芯片等的情況下，具有需要的序列、長度的單鏈DNA 的制備是不可或缺的，用于操作單鏈DNA的酶等變得重要。迄今為止， 切斷單鏈DNA的方法有很多報告，但單鏈DNA彼此結合的方法僅有數例 報告，如使用T4RNA連接酶的方法(專利文獻l、非專利文獻l)、使用 源自古細菌的熱穩定性連接酶的方法(專利文獻2)、 ^"吏用源自嗜熱性噬菌 體TS2126的熱穩定性連接酶的方法(專利文獻3)等。
根據如上所述的狀況，更希望開發能對可利用的單鏈DNA進行操作 的酶或組合物
專利文獻1:特開2002 - 171983號公報全文
專利文獻2:特開平6 - 62847號Z/^艮全文
專利文獻3:美國專利>^才艮第6818425號全文非專利文獻l: Nishigaki等，Mol Divers 4: 187 —卯，1998

發明內容
本發明人等鑒于上述情況進行了潛心研究，結果發現，Evl蛋白質具 有切斷單鏈DNA并將單鏈DNA的5，末端和3'末端結合的活性，以至于完 成了本發明。
由此，本發明的目的在于，提供一種用于切斷和/或連結單鏈DNA的 組合物。
即，本發明涉及以下的(1) ~ (12)。
(1) 本發明的第一技術方案是一種組合物，含有以下的U)或(b) 所示的Evl蛋白質而成，用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA的5， 末端和3，末端的結合。
(a) 由序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號 10、序列編號12或序列編號20所示的M酸序列構成的蛋白質；
(b) 由在序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列 編號IO、序列編號12或序列編號20所示的JL^酸序列中，具有l或數個 氨基酸的取代、缺失或插入的M酸序列所構成，且具有切斷單鏈DNA 及將單鏈DNA的5，末端和3'末端結合的活性的多肽。
(2) 本發明的第二技術方案，其特征在于，在上述(1)記載的組合 物中，還含有Mg2+或Ca2+。
(3) 本發明的第三技術方案，其特征在于，在上述(2)記載的組合 物中，上述Mg2+的濃度為0.5mM~2.0mM。
(4) 本發明的第四技術方案，其特征在于，在上述(3)記載的組合 物中，還含有Rad51B蛋白質及ATP。
(5) 本發明的第五技術方案，其特征在于，在上述(4)記載的組合 物中，上述Evl蛋白質相對于上述Rad51B蛋白質的摩爾比為1: 0.5~1: 4。(6) 本發明的第六技術方案，其特征在于，在上述(4)或(5)記載 的組合物中，上述ATP的濃度為0.5mM ~ 2.0mM。
(7) 本發明的第七技術方案，其特征在于，在上述(l) ~ (3)中任 意一項記載的組合物中，還含有DNA拓樸異構酶I型蛋白質。
(8 )本發明的第八技術方案是一種組合物，含有包含以下(a)或(b ) 所示核酸的重組載體而成，用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA 的5，末端和3，末端的結合。
(a) 由序列編號l、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號 9、序列編號11或序列編號19所示的核苷酸序列構成的核酸；
(b) 與由序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列 編號9、序列編號11或序列編號19所示的核苷酸序列構成的核酸的互補 鏈在嚴^^件下雜交的核酸，且該核酸編碼的多肽具有切斷單鏈DNA及 將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合的活性。
(9 )本發明的第九才支術方案是一種組合物，含有包含以下(a)或(b ) 所示核酸的重組載體而成，用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA 的5'末端和3'末端的結合。
(a) 對由序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編 號10、序列編號12或序列編號20所示的JtJ^酸序列構成的多肽進行編碼 的核酸；
(b) 對如下所示的多肽ii行編碼的核酸，所述多肽由在序列編號2、 序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號IO、序列編號12或序列 編號20所示的M酸序列中具有1或數個氨基酸的取代、缺失或插入的氨 基酸序列所構成，且具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5，末端和3'末端 結合的活性。
(10) 本發明的第十技術方案是一種制造單鏈DNA標記物的方法， 其特征在于，使上述(l) ~ (9)中任意一項記載的組合物與單鏈DNA 發生反應，來制造單鏈DNA標記物。
(11) 本發明的第十一技術方案是一種單鏈DNA標記物，其特征在于，其通過上述(10)記載的方法來制造。
(12 )本發明的第十二技術方案是一種Evl蛋白質活性抑制用組合物， 其特征在于，含有選自阿克拉霉素、克菌定、DIDS、 P -玉紅霉素及3-ATA中的一種或多種化合物而成。
根據本發明的方法，可以切斷單鏈DNA和/或，將單鏈DNA的5，末 端和3，末端結合。


圖l表示Evl蛋白質和Rad51B蛋白質結合的結果。(a)是用12%的 SDS - PAGE使已純化的Evl蛋白質(0.5 ji g)和Rad51B蛋白質(0.5 jn g) 進行泳動，用考馬斯亮藍進行染色。泳道l是標記物。泳道2及3分別是 已純化的Evl和Rad51B。 ( b )是表示Evl - Rad51B的相互作用的結果。 泳道1及2是在沒有Rad51B的存在(泳道1)或有Rad51B存在的情況 下(泳道2 )進行與Evl結合珠的結合實驗的結果。泳道3是使用了未結 合蛋白質的Affi - Gd珠的負對照的實驗結果。(c)是表示Evl - Rad51B 的相互作用的結果。泳道1及2是在沒有Evl的存在(泳道1)或有Evl 存在(泳道2 )的情況下進行與Rad51B結合珠的結合實驗的結果。泳道3 是使用了未結合蛋白質的Affi - Gel珠的負對照的實驗結果。
圖2表示對已純化的Evl蛋白質進行凝膠過濾的結果。Evl蛋白質在 分子量約600kDa的位置被洗脫。
圖3表示對Evl蛋白質的DNA結合性進行研究的結果。泳道1 ~ 6及 泳道7~12分別是研究了對于雙鏈DNA及單鏈DNA的結合性的結果。泳 道1及7表示未添加Evl蛋白質的負對照的結果。在結合實驗中使用的Evl 蛋白質的濃度為0.2juM(泳道2及8)、 0.4jiM(泳道3及9)、 0.8nM(泳 道4及10)、 1.6pM (泳道5及U)、 3'2iliM (泳道6及12)。 nc是指有 切口 (nick)的環狀雙鏈DNA， sc是指超螺旋環狀雙鏈DNA, ss是指單 鏈DNA (在其他圖中也一樣)。
圖4表示對單鏈DNA的切斷、及結合單鏈DNA的5，末端和3，末端的 活性進行研究的結果。(a)是將Evl相對于環狀單鏈DNA的活性進行了 研究的結果。泳道1及2表示使用了 d) x 174環狀單鏈DNA的結果，泳3及4表示使用了 M13mpl8環狀單鏈DNA的結果。另夕卜，泳道1及3表 示無Evl的對照實驗的結果，泳道2及4表示使用了 Evl蛋白質的實驗的 結果。(b )是將Evl對于雙#^_螺旋DNA及有切口的DNA的活性進行了 研究的結果。使用(b x 174環狀單鏈DNA (20 |J M、泳道1 ~ 3 )或(|) x 174 超螺旋及有切口的雙鏈DNA (10 p M、泳道4 ~ 6 )來研究Evl (4 n M、 泳道2及5 )及源自大腸桿菌的拓樸異構酶I (5單位、泳道3及6)的影 響。泳道l及4表示沒有Evl蛋白質的對照實驗的結果。
圖5表示Mg"及二價金屬離子對Evl蛋白質的活性的影響。(a)是將 Mg"對Evl蛋白質的活性的影響進行了研究的結果。在各種Mg"濃度下進 行Evl蛋白質(4jum)的對于(b xl74環狀單鏈DNA (20jiM)的連環體 (catemer)化反應。泳道1是沒有Evl蛋白質的對照實驗的結果。另外， 泳道2 8分別表示在0mM、 0.5 mM、 1.0 mM、 1.25 mM、 1. 5mM、 1.75 mM、 2.0 mM的Mg"存在下的實驗結果。(b)是將二價金屬離子對Evl 蛋白質的活性的影響進行了研究的結果。在各種二價金屬離子的存在下進 行Evl蛋白質(4nm)的對于(J) xi74環狀單鏈DNA (20pM)的連環體 化反應。泳道l是沒有金屬離子的對照實驗的結果。另夕卜，泳道2~5表示 在1 mM的圖示金屬離子的存在下的實驗結果。
圖6表示對基于Evl蛋白質的反應產物的熱穩定性進行了研究的結果。 表示將使(l) x 174環狀單鏈DNA (20 p M)和Evl蛋白質(4 |i m)發生反 應得到的反應產物于IOOX:孵育0分鐘(泳道2 )、 0.5分鐘(泳道3 )、 1 分鐘(泳道4 )、 5分鐘(泳道5 )及10分鐘(泳道6 )，用瓊脂糖凝膠泳動 的結果。泳道l表示沒有Evl蛋白質的對照實驗的結果。
圖7表示用電子顯微鏡觀察Evl蛋白質的反應產物的結果。標度條 (scale bar)為100nm。
圖8表示Rad51B蛋白質促進Evl蛋白質的活性的結果。(a)表示將 Rad51B蛋白質對Evl蛋白質的活性的影響進行了研究的結果。泳道1及5 是沒有Evl及Rad51B蛋白質的對照實驗的結果。泳道2及6是在沒有Evl 蛋白質存在的情況下使用Rad51B蛋白質4 nM進行的實驗結果。泳道3 及7是在沒有Rad51B蛋白質存在的情況下使用Evl蛋白質4 u M進行的 實驗結果。泳道4及8是使用Evl蛋白質4 n M、 Rad51B蛋白質4 p M進 行的實驗結果。另外，泳道1~4是在有ATP存在的情況下進行的實驗結的情況下進行的實驗結果。(b)表示將Rad51蛋白質對Evl蛋白質的活性的影響進行了研究的結果。泳道1及5是沒有Evl及Rad51蛋白質的對照實驗的結果。泳道2及6是在沒有Evl蛋白質存在的情況下使用Rad51蛋白質4inM進行的實驗結果。泳道3及7是在沒有Rad51蛋白質存在的情況下使用Evl蛋白質4 ju M進行的實驗結果。泳道4及8是使用Evl蛋白質4 n M、 Rad51蛋白質4 p M進行的實驗結果。另外，泳道1~4是在有ATP存在的情況下進行的實驗結果，泳道5 ~ 8是在沒有ATP存在的情況下進行的實驗結果。
圖9表示將Rad51B蛋白質對Evl蛋白質的連環體化活性的促i^t果的濃度依賴性進行了研究的結果。相對于Evl蛋白質4nM,以0.5~8"M混合Rad51B蛋白質，測定活性。泳道1是未添加Rad51B蛋白質及Evl蛋白質雙方情況下的對照實驗的結果，泳道8是添加Rad51B蛋白質8 nM且未添加Evl蛋白質情況下的對照實驗的結果。泳道2 ~ 7是在4 |i M的Evl的存在下分另U添加了 0jnM、 0.5pM、 l.OinM、 2.0nM、 4.0jiM、 8.0jiM的Rad51B蛋白質情況下的實驗結果。
圖10表示Evl (1 - 221)變異體的純化結果。(a)表示Evl (1 - 221)變異體的純化工序。(b )表示對純化的各工序的樣品進行15 % SDS - PAGE并用考馬斯亮藍進行染色的結果。泳道l是分子量標記物，泳道2及3分別是IPTG添加前及添加后的全宿主細胞提取液。另外，泳道4 7分別是Ni-NTA瓊脂糖組分、羥基磷灰石透過組分、凝血酶處理后的組分、Superdex 200的峰組分。
圖11表示Evl (222-418)變異體的純化結果。(a)表示Evl (222-418 )變異體的純化工序。(b )表示對純化的各工序的樣品進行15 % SDS-PAGE并用考馬斯亮藍進行染色的結果。泳道l是分子量標記物，泳道2及3分別是IPTG添加前及添加后的全宿主細胞提取液。另夕卜，泳道4 ~7分別是Ni-NTA瓊脂糖組分、羥基磷灰石的峰組分、凝血酶處理后的組分、Superdex 200的峰組分。
圖12是對Evl蛋白質的EVH2域的活性進行了研究的結果。U)表
示Evi蛋白質的域結構;M^本實施例中使用的缺失變異體的模式圖。圖中
示出EVH1、富含脯氨酸區域及EVH2。 ( b )表示研究Evl缺失變異體的活性的結果。泳道1~4分別是在無蛋白質時、Evl蛋白質(4jnM)的存在下、Evl (1 - 221)變異體(4 ji M)的存在下、Evl (222 - 418 )變異體(4 |i M)的存在下的活性的研究結果。(c)表示Rad51B蛋白質對Evl缺失變異體的活性的影響的研究結果。泳道1是無蛋白質時的結果，泳道2是僅添加Rad51B蛋白質的結果。泳道3及4、 5及6、 7及8分別是添加Evl蛋白質(4mM)、 Evl (1-221)變異體(4nM)、 Evl (222-418)變異體(4juM)進行實驗的結果，泳道4、 6及8是還添加了 Rad51B蛋白質(4mM)進行實驗的結果。
圖13表示與DNA拓樸異構酶I型蛋白質及Evl蛋白質共存下的單鏈DNA的連環體化的促進效果有關的結果。(a)示出基于Topol (源自大腸桿菌)的單鏈DNA的連環體化的促進效果。泳道1表示僅僅是單鏈DNA的負對照的結果，泳道2表示使1 jjM的Evl蛋白質發生反應時的結果，泳道3表示使5U的Topol (大腸桿菌(E. coli )， New England Biolabs 7>司)發生v^應時的結果，泳道4表示在1 n M的Evl蛋白質和0.05U的Topol的混合存在下使其發生反應時的結果，泳道5表示在1 n M的Evl蛋白質和0.5U的Topol的混合存在下使其發生反應時的結果，泳道6表示在1 pM的Evl蛋白質和5U的Topol的混合存在下使其發生反應時的結果。(b )示出基于hsTopol (源自人)的單鏈DNA的連環體化的促進效果。泳道1表示僅僅是單鏈DNA的負對照的結果，泳道2表示使0.5 n M的Evl蛋白質發生反應時的結果，泳道3表示使2.8nM的hsTopoI(人(human )， JenaBioscience公司)發生反應時的結果，泳道4表示在0.5 ju M的Evl蛋白質和2.8nM的hsTopol的混合存在下使其發生反應時的結果。
圖14表示阿克拉霉素對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接(catenation)活性的影響。(a)是阿克拉霉素對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的抑制效果。泳道1表示僅僅是單鏈DNA的負對照的結果，泳道2表示使4ji M的Evl蛋白質發生反應時的結果，泳道3表示使4 n M的Evl蛋白質和IjliM的阿克拉霉素發生反應時的結果，泳道4表示使4juM的Evl蛋白質和5nM的阿克拉霉素發生>^應時的結果，泳道5表示使4jiM的Evl蛋白質和10jiM的阿克拉霉素發生反應時的結果，泳道6表示使4nM的Evl蛋白質和20nM的阿克拉霉素發生反應時的結果，泳道7表示使20jiM的阿克拉霉素發生反應時的結果。(b)是阿克拉霉素對Evl蛋白質的DNA結合活性的影響。除了佳發生及JL的Evl蛋白質為0.3 [aM之外，其余與(a)相同。圖15表示克菌定對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的影響。(a)是克菌定對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的抑制效果。泳道1表示僅僅是單鏈DNA的負對照的結果，泳道2表示使4 u M的Evl蛋白質發生反應時的結果，泳道3表示使4nM的Evl蛋白質和liLiM的克菌定發生反應時的結果，泳道4表示使4nM的Evl蛋白質和5jiM的克菌定發生反應時的結果，泳道5表示使4pM的Evl蛋白質和10pM的克菌定發生反應時的結果，泳道6表示使4nM的Evl蛋白質和20pM的克菌定發生反應時的結果，泳道7表示使20nM的克菌定發生反應時的結果。(b)是克菌定對Evl蛋白質的DNA結合活性的影響。除了佳發生反應的Evl蛋白質為0.3nM之外，其余與(a)相同。
圖16表示DIDS對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的影響。(a)是DIDS對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的抑制效果。泳道1表示僅僅是單鏈DNA的負對照的結果，泳道2表示使4 |Li M的Evl蛋白質發生反應時的結果，泳道3表示使4 n M的Evl蛋白質和1 ju M的DIDS發生反應時的結果，泳道4表示使4pM的Evl蛋白質和5pM的DIDS發生反應時的結果，泳道5表示使4 ji M的Evl蛋白質和10 n M的DIDS發生反應時的結果，泳道6表示使4 n M的Evl蛋白質和20 ji M的DIDS發生反應時的結果，泳道7表示使20 n M的DIDS發生反應時的結果。(b )是DIDS對Evl蛋白質的DNA結合活性的影響。除了使發生及^應的Evl蛋白質為0.3nM之外，其余與(a)相同。
圖17表示P -玉紅霉素對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的影響。(a)是P -玉紅霉素對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的抑制效果。泳道1表示僅僅是單鏈DNA的負對照的結果，泳道2表示使4 n M的Evl蛋白質發生反應時的結果，泳道3表示使4nM的Evl蛋白質和lpM的P —玉紅霉素發生反應時的結果，泳道4表示使4 的Evl蛋白質和5jliM的P -玉紅霉素發生反應時的結果，泳道5表示使4nM的Evl蛋白質和10nM的P -玉紅霉素發生反應時的結果，泳道6表示使4nM的Evl蛋白質和20 的P -玉紅霉素發生反應時的結果，泳道7表示使20juM的P -玉紅霉素發生反應時的結果。(b)是P -玉紅霉素對Evl蛋白質的DNA結合活性的影響。除了使發生反應的Evl蛋白質為0.3 ji M之外，其余與(a)相同。圖18表示3 - ATA對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的影響。(a)是3 - ATA對Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性的抑制效果。泳道1表示僅僅是單鏈DNA的負對照的結果，泳道2表示使4 p M的Evl蛋白質發生反應時的結果，泳道3表示使4nM的Evl蛋白質和lpM的3-ATA發生反應時的結果，泳道4表示使4 )i M的Evl蛋白質和5 n M的3 - ATA發生反應時的結果，泳道5表示使4pM的Evl蛋白質和10juM的3 -ATA發生反應時的結果，泳道6表示使4jnM的Evl蛋白質和20iLiM的3 -ATA發生反應時的結果，泳道7表示使20jiM的3-ATA發生反應時的結果。(b)是3-ATA對Evl蛋白質的DNA結合活性的影響。除了使發生>^應的￡￥1蛋白質為0.3"1\1之外，其余與U)相同。
具體實施例方式
本發明的第一實施方式是"一種組合物，含有以下的(a)或(b)所示的Evl蛋白質而成，用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA的5，末端和3，末端的結合。
(a) 由序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12或序列編號20所示的M酸序列構成的蛋白質，
(b) 由在序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號IO、序列編號12或序列編號20所示的M酸序列中，具有l或數個氨基酸的取代、缺失或插入的M酸序列所構成，且具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5，末端和3'末端結合的活性的多肽。"
這里，"Evl蛋白質"是指含有與序列編號2、 4、 6、 8、 10或12所示的氨基酸序列相同或實質上相同的M酸序列的蛋白質。"含有實質上相同的Jl&酸序列的蛋白質"，是含有與序列編號2、 4、 6、 8、 10或12所示的#^酸序列具有約60%以上、優選約70%以上、更優選約80%、 81%、82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最優選約99%的氨基酸同源性的M酸序列，且具有切斷單鏈DNA、及將單鏈DNA的5，末端和3，末端的結合的活性的蛋白質。
需要說明的是，在本說明書中，只要沒有特別記栽，"多肽"和"蛋白質"的含義相同。
或者，含有與序列編號2、 4、 6、 8、 10或12所示的M酸序列實質上相同的M酸序列的蛋白質，是指由序列編號2、 4、 6、 8、 10或12所示的M酸序列中的1或數個(優選1~30個左右，更優選1~10個左右，進一步優選1 5個)M酸缺失、取代或附加的M酸序列所構成，且具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合的活性的蛋白質。
上述氨基酸的缺失、附加及取代，可以存在于已分離的天然多肽中，另外，也可以是利用在該技術領域中公知的方法改變對本發明的蛋白質進行編碼的基因從而重新導入的情形。例如，關于特定的氨基酸殘基的取代，可以使用市售的試劑盒(例如Mutan TM - G( TAKARA 7>司)、Mutan TM-K (TAKARA公司))等，利用G叩pedduplex法、Kunkel法等乂i^p的方法或以它們為基準的方法進行威基的取代而實施。
另外，在本發明的實施中使用的蛋白質的C末端通常為羧基(-COOH)或羧酸酯基(-COO-)，但該^&可以被酰胺(-CONH2)、酯(-COOR)等進行化學修飾。在這里，作為酯中的R，可以舉出d-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基)、<:3-8環烷基(例如環戊基、環己基)、d-6芳基(例如苯基、oc -萘基)、苯基-d-2烷基(例如節基、苯乙基)、cx -萘基-d-2烷基(例如a -萘基甲基)等。除此之外，還可以為作為經口用酯而通用的特戊酰氧甲酯。當本發明的Evl蛋
白質除了 c末端之外而在其多肽鏈中具有a時，該g被酰胺化或被酯
化而得到的化合物也包括在本發明的蛋白質中。作為該酯，可以舉出上述的各酯。同樣地，本發明的蛋白質的N末端通常為^ ( -NH2)，但該氨基可以被甲酰基、乙晚基等d-6醃基等化學修飾。除此之外，N端側在
內的氨基酸的側鏈上的取代基(例如-OH、 -SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被合適的官能團(例如甲醃基、乙統基等)化學修飾而得到的化合物、進行糖鏈結合得到的化合物，也包括在本發明的蛋白質中。
關于含有本發明的Evl蛋白質中的部分^J^酸序列的肽(也稱為部分肽)，只要該部分肽具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5'末端和3，末端結合的活性，就可以包括在本發明的組合物中。作為這樣的部分肽，是含有與序列編號20所示的JL^酸序列相同或實質上相同的^J^酸序列的多
1肽。在這里，"含有實質上相同的^J^酸序列的多肽"，是指含有與序列編
號20所示的>^酸序列具有約60%以上、優選約70%以上、更優選約80%、 81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、卯％、91%、 92%、 93%、 94°/。、 95%、 96%、 97%、 98%、最優選約99%的氨基酸同源性的M酸序列，且具有切斷單鏈DNA、及將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合的活性的多肽。
或者，含有與序列編號20所示的M酸序列實質上相同的M酸序列的多肽，是指由序列編號20所示的M酸序列中的l或數個(優選1~30個左右，更優選1~10個左右，進一步優選1~5個)#^酸缺失、取代或附加的M酸序列所構成，且具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合的活性的多肽。
上述氨基酸的缺失、附加及取代，可以存在于已分離的天然多肽中，另外，也可以是利用該技術領域中公知的方法改變對本發明的蛋白質進行編碼的基因從而重新導入的情形。例如，特定的氨基酸殘基的取代，可以使用市售的試劑盒(例如Mutan TM - G (TAKARA公司)、Mutan TM —K (TAKARA^S司))等，利用Guppedduplex法、Kunkel法等7^知的方法或以它們為基準的方法進行威基的取代而實施。
Evl蛋白質或其他部分肽可以從天然來源獲得，或者可以作為重組體獲得。為了獲得重組體，為了表達Evl蛋白質或其部分肽，重組載體成為必需。另外，可以在本發明的組合物中^^有該重組載體。在本重組載體中，對Evl蛋白質或其部分肽進行編碼的核酸以可以表達的方式插入。
在這里，所謂"可以表達"，是指為了表達具有所需要的M酸序列的Evl蛋白質或其部分肽而將對它們進行編碼的核酸與閱讀框一起插入到表達用的載體中的狀態，以使其他必要的構成要素例如啟動子、選擇標記物等發揮功能而將其構建在該載體中的狀態。
在這里，所謂"對Evl蛋白質進行編碼的核酸"，不僅包括由序列編號l、 3、 5、 7、 9或ll所示的磁Jjf列構成的核酸，還包括跟由與序列編號l、 3、 5、 7、 9或11所示的4^序列互補的減基序列構成的核酸在嚴^件下進行雜交，且對具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合的活性的多肽進行編碼的核酸。作為能夠跟含有序列編號l、 3、 5、 7、 9或ll所示的g序列的核酸在嚴4MHf下進行雜交的DNA,可以舉出含有與序列編號l、 3、 5、 7、 9或11所示的g序列具有優選約70 %以上、更優選約80 % 、 81 % 、 82 % 、83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、卯％、 91%、 92%、 93%、94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最優選約99%的多核苷酸序列同源性的4^序列的核酸等。
在這里，所謂"對Evl蛋白質的部分肽進行編碼的核酸"，不僅包括由序列編號19所示的a序列構成的核酸，還包括跟由與序列編號19所示的4序列互補的磁基序列構成的核酸在嚴;fMHf下進行雜交，且對具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5'末端和3，末端結合的活性的多肽進行編碼的核酸。
作為能夠跟含有序列編號19所示的g序列的核酸在嚴旨降下進行雜交的DNA，可以舉出含有如下所示M序列的核酸等，該^序列與序列編號19所示的4^序列具有優選約70 %以上、更優選約80 % 、 81 % 、82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、卯％、 91%、 92%、93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最優選約99%的多核普酸序列同源性。
在這里，所謂嚴4^4K是指容易被本領域普通技術人員確定的用于雜交的條件，通常是依賴探針長度、清洗溫度、及鹽濃度的經驗性諸條件。通常，如果探針變長則用于適度退火的溫度升高，如果探針變短則溫度降低。關于雜交物的形成，通常互補鏈在比其熔點稍低的溫度條件下依賴再次退火的核酸的能力。
具體而言，例如，作為低嚴格條件，可以舉出在雜交后的過濾器的清洗階段，在37"C 42X:的溫度條件下，在O.lxSSC、 0.1。/。SDS溶液中進行清洗等。另外，作為高嚴格條件，例如可以舉出在清洗階段，在65n、5xSSC及0.1。/。SDS中進行清洗等。通過進一步提高嚴^^ff，可以得到同源性高的多核普酸。
對Evl蛋白質或其部分肽進行編碼的核酸，可以按照常規方法從包括人、大鼠、小鼠、羊等哺乳類的真核生物的細胞獲得。或者，也可以從數據庫等獲得已經公知的Evl蛋白質的核酸序列信息，根據其序列信息得到源自需要的生物種的Evl基因。Evl基因的克隆可以根據該技術領域的一般知識進行。該基因可以M達該基因的細胞制備cDNA文庫，利用常規的篩選方法獲得。或者，^達該基因的細胞制備RNA，通過逆轉錄S^成了 cDNA，然后根據該基因序列制備PCR用引物，擴增cDNA，由此可以獲得該cDNA。
已整合了對Evl蛋白質或其部分肽進行編碼的核酸的重組載體，可以通過在適當的載體上連結該核酸而得到。重組載體在供于克隆的情況下，只要可以在宿主中復制，就沒有特別限定。另外，作為用于表達Evl蛋白質或其部分肽的載體，可以使用能在宿主中復制且能夠使編碼該蛋白質的DNA片段表達的啟動子等。
作為可以使用的載體，例如可以舉出質粒DNA、噬菌體DNA等。作為質粒DNA,可以舉出源自大腸桿菌的質粒(例如pBR322、 pBR325、pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC19、 pCBD-C、 pET15b等)、源白枯草菌的質粒(例如pUB110、pTP5、pC194等)、源自酵母的質粒(例如YEpl3、YEp24、 YCp50、 YIp30 )等；作為噬菌體DNA，可以舉出入噬菌體等。進而，也可以使用逆轉錄病毒、痘苗病毒等動物病毒、桿狀病毒、披膜病毒(Togaviridae)等昆蟲病毒載體。
作為在本發明中使用的啟動子，只要是對應于在基因表達中使用的宿主的合適的啟動子，就沒有特別限定。
例如，在使用動物細胞作為宿主的情況下，可以舉出SRoc啟動子、CMV啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、HSV-TK啟動子、EF - 1 oc啟動子等。
在宿主是大腸桿菌的情況下，可以舉出tac啟動子、trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、入PL啟動子、Ipp啟動子、T7啟動子等；在宿主是枯草菌的情況下，可以舉出SPOl啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。
在宿主是酵母的情況下，可以舉出PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。
在宿主是昆蟲細胞的情況下，優選多角體蛋白啟動子、P10啟動子等。在本發明的重組載體上，除了對Evl蛋白質或對其部分進行編碼的核酸序列、啟動子序列之外，還可以連結選擇標記物、終止子、增強子、剪切信號、PolyA附加信號、核糖體結合序列(SD序列)、SV40復制起點(SV40ori)等。
作為選擇標記物，沒有限定，但潮霉素耐受性標記物(Hygf)、 二氫葉酸還原酶基因(dhfr)、氨節青霉素耐受性基因(Ampr)、卡那霉素耐受性基因(Kanr)、新霉素耐受性基因(Neor、 G418)等是可以利用的。
另外，為了使容易進行重組蛋白質的分離、純化等，也可以在要表達的蛋白質或其一部分的N末端側、C末端側等融合純化用的標簽序列例如His標簽、HA標簽、GST等。
在宿主是大腸桿菌的情況下，可以利用堿性磷酸酶信號、OmpA信號等；在宿主是枯草菌的情況下，可以利用oc -淀粉酶信號序列、枯草芽孢桿菌信號序列等；在宿主是酵母的情況下，可以利用oc因子信號序列、轉化酶信號序列等；在宿主是動物細胞的情況下，例如可以利用胰島素信號序列、oc干擾素信號序列等。
對Evl蛋白質進行編碼的DNA或其一部分向上述載體的插入，可以直接或根據需要利用限制酶對克隆的DNA進行消化，附加連接物，整合到載體DNA的限制酶部位或多克隆位點而進行。連結的DNA可以在其5，末端側具有作為翻"^始密碼子的ATG,另外，在3，末端側具有作為翻譯終止密碼子的TAA、 TGA或TAG。這些翻if^始密碼子、翻譯終止密碼子，也可以使用合適的合成DNA接頭進行附加。連結的DNA有必要I^到載體中以使被該DNA編碼的本發明的多肽在宿主細胞中表達。
為了表達Evl蛋白質或其部分肽，有必要將已插入有編碼它們的核酸的表達載體轉化到合適的宿主細胞。作為用于進行轉化的宿主，只要可以表達Evl蛋白質就沒有特別限定。例如，可以舉出屬于大腸桿菌
(Escherichia coli)等的埃希氏菌屬、枯草菌(Bacillus Subtilis)等桿菌屬、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等假單胞菌屬、苜蓿根瘤菌
(Rhizobium meliloti)等根瘤菌屬的細菌；酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae )、 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、 畢赤酵母
(Pichia pastoris )等酵母；猴細胞COS - 7、 Vero、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、或Sf9、 Sf21等昆蟲細胞。
作為重組載體向大腸桿菌的導入方法，可以利用^f吏用釣離子的方法、電穿孔法等。作為重組載體向酵母的導入方法，可以利用電穿孔法、原生質球法、乙酸鋰法等。作為動物細胞或重組載體向動物細胞的導入方法，可以使用DEAE葡彩瞎法、電穿孔法、磷酸鉀法、利用陽離子性脂質的方法等。
Evl蛋白質或其部分肽，可以通過培養轉化體，使該蛋白質或其部分肽表達，從轉化體的培養物分離該蛋白質或其部分肽，由此進行制造。所謂"培養物"，是指培養上清、或者培養細胞或培養菌體或細胞或菌體的破碎物的任意。
作為培養以大腸桿菌、酵母菌等微生物為宿主的轉化體的培養基，只要是含有微生物可以同化的碳源、氮源、無機鹽類等，且可以有效進行轉化體的培養的培養基，可以使用天然培養基、合成培養基的任意。作為碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化物，乙酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。作為氮源，除了氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽或其他含氮化合物之外，還可以使用蛋白胨、肉提取物、玉米漿等。作為無機鹽類，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸釣等。
培養是在適于宿主細胞的條件下進行的。例如，作為培養大腸桿菌時的培養基，優選LB培養基、M9培養基等。為了才艮據需凍—吏啟動子有效發揮功能，可以添加異丙基-P-D-硫代半乳糖苷、3P -吲咮基丙烯酸類的藥劑。在是大腸桿菌的情況下，培養通常在約15 37t:下進行約3 24小時，根據需要還可以增加通氣、攪拌。在宿主是枯草菌的情況下，培養通常在約30 40X:下進行約6 24小時，根據需要還可以增加通氣、攪拌。
作為用于培養酵母的培養基，可以舉出SD培養基、YPD培養基。培養基的pH優選調節至約5~8。培養通常在約20 35"C下進行約24~72小時，根據需要增加通氣、攪拌。在培養宿主是昆蟲細胞或昆蟲的轉化體時，作為培養基，可以舉出含有牛血清的Grace昆蟲培養基等。培養基的pH優選調節至約6.2 6.4。培養通常在約27X:下進行約3 5天，根據需要增加通氣、攪拌。在培養宿主是動物細胞的轉化體時，作為培養基，例如可以使用含有
約5 ~ 20 %的胎牛血清的MEM培養基、DMEM培養基、RPMI - 1640培養基等。pH優選約6 8。培養通常在約30 40X:下進行約15 60小時，根據需要增加通氣、攪拌。為了從上述培養物分離純化Evl蛋白質或其部分肽，例如可以通過下述的方法進行。
當從培養菌體或細胞中提取Evl蛋白質或其部分肽時，可以適當使用如下所示的方法等，即培養后，利用^^知的方法收集菌體或細胞，將其在合適的緩沖液中懸浮，通it^聲波、溶菌酶和/或凍結融解等破壞菌體或細胞，然后通過離心分離、過濾得到Evl蛋白質或其部分肽的粗提取液。可以在緩沖液中含有尿素、鹽酸胍等蛋白質變性劑、Triton X-100等表面活性劑。當培養液中有Evl蛋白質或其部分肽被分泌出來時，在培養結束后，用其自身公知的方法分離菌體或細胞和上清，收集上清。如此得到的培養
上清或提取液中含有的Evl蛋白質或其部分肽的純化，可以適當組合乂^的分離、純化法來進行。作為這些公知的分離、純化法，可以使用鹽析或溶劑沉淀法等利用溶解度的方法，透析法、超濾法、^Jt濾法、及SDS- PAGE等主要利用分子量的差的方法，離子交換層析法等利用電荷差的方法，親和層析法等利用特異親和性的方法，逆相高速液體層析法等利用疏水性的差的方法，等電點電泳法等利用等電點的差的方法等。
含有Evl蛋白質或其部分肽、或者它們的表達載體而成的組合物，可以用于將單鏈DNA切斷、和/或將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合。在本組合物中，除了 Evl蛋白質或其部分肽、或者它們的表達載體等之外，只要是單鏈DNA的切斷、結合反應所需的物質，就可以含有任意物質。例如，除了 Mg"等金屬離子、ATP等之外，還可以含有將pH保持恒定的緩沖液等輔助物質。
在本發明的其他實施方式中，也包括如下所示的的組合物，所述組合物除了上述的有效成分及輔助物質等之外，還含有Rad51B蛋白質或Rad51B蛋白質的表達載體。
在這里，"Rad51B蛋白質"是指含有與序列編號14、 16或18所示的^J^酸序列相同或實質上相同的Jl^酸序列的蛋白質。在這里，所謂"含有實質上相同的M酸序列的蛋白質"，是指含有與序列編號14、 16或18所示的M酸序列具有約60%以上、優選約70%以上、更優選約80%、81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最優選約99°/。的絲酸同源性的M酸序列，且具有ATPase (三磷酸腺苷酶)活性及與作為對同源重組特異的DNA結構的霍利迪(HoUiday)結構結合的活性的蛋白質。
或者，含有與序列編號14、 16或18所示的M酸序列實質上相同的M酸序列的蛋白質，是指由序列編號14、 16或18所示的M^列中的l或數個(優選1 30個左右，更優選1 10個左右，進一步優選1~5個)Jl&酸缺失、取代或附加的M酸序列所構成，且具有ATPase (三磷酸腺苷酶)活性及與對同源重組特異的作為DNA結構的霍利迪(Holliday)結構結合的活性的蛋白質。
上述氨基酸的缺失、附加及取代，可以存在于已分離的天然多肽中，另外，也可以是利用在該技術領域中公知的方法改變對本發明的蛋白質進行編碼的基因從而重新導入的情形。例如，關于特定的氨基酸戎基的取代，可以使用市售的試劑封例如Mutan TM - G( TAKARA公司)、Mutan TM-K ( TAKARA公司))等，利用Guppedduplex法、Kunkel法等'i^p的方法或以它們為基準的方法進行威基的取代而實施。
Rad51B蛋白質可以從天然環境獲得，或者可以通過使重組體表達而獲得。在使Rad51B蛋白質的重組體表達的情況下，可以根據使上述的Evl蛋白質表達的方法，選擇表達用載體及表達所需的構成要素，另外，關于重組體的獲得，也可以根據獲得上述的Evl蛋白質的重組體的方法來實施。
另外，在本發明的實施方式中，也包含如下所示的組合物，所述組合物除了 Evl蛋白質或Evl蛋白質的表達載體之外，還含有DNA拓樸異構酶I型蛋白質或DNA拓樸異構酶I型蛋白質的表達載體。在這里，"DNA拓樸異構酶I型"通常也被稱為"TopoI"等，但并不拘泥于其慣用名稱，包括具有下述活性的酶的全部，所述活性是指向環狀(雙鏈)DNA的一個鏈導入切口，使另一個鏈通過，然后使切口再結合，結果DNA的超螺旋被消除的活性。因此，關于本發明中的"DNA拓樸異構酶I型"，包括源自原核生物及真核生物中任意的物質，另外，還包括將DNA超螺旋的正向或反向的任意一方消除的物質、將DNA超螺旋的正向瓦良向雙方消除的物質中的任意物質。DNA拓樸異構酶I型蛋白質，可以從天然環境獲得，還可以通過使重組體表達而獲得，或者可以購入市售品。在使DNA拓樸異構酶I型蛋白質的重組體表達的情況下，可以根據使上述的Evl蛋白質
表達的方法，選^^表達用的載體;s^達所必需的構成要素，另外，關于重
組體的獲得，也可以根據獲得上述的Evl蛋白質的重組體的方法來實施。
進而，在本發明的實施方式中，含有抑制Evl活性的組合物。Evl蛋白質具有將單鏈DNA切斷和/或結合的活性，但該活性通過抑制Evl活性的組合物進行適時的抑制調節，由此可以實現具有更優選形式的單鏈DNA的形成。作為抑制Evl活性的組合物的有效成分而含有的化合物，是阿克拉霉素(Aclarubicin )、克菌定(Dequalinium )、 DIDS (Disodium Salt )、p -玉紅霉素(P - Rubromycin)和/或3-ATA (3 - - 9 -硫代(10H)-吖咬酮3 - amino — 9 — thio (10H) -acridone)。這些4匕合物可以以鹽的形式含于抑制Evl活性的組合物中。
本發明的組合物，除了作為有效成分的化合物、蛋白質、DNA等之外，還可以含有用于調節pH的緩沖劑、用于調節離子強度的鹽、蛋白酶抑制劑等通常在作為試劑等提供時所必需的添加物質。關于該添加物質，可以根據本發明的組合物的用途，由本領域普通技術人員適當選擇及使用。
在本發明的其他實施方式中，提儉使用了本發明的組合物的單鏈DNA分子量標記物的制作方法、及所制作的單鏈DNA分子量標記物。本發明的單鏈DNA分子量標記物通過如下制備從分子量已知的單鏈DNA制作分子量為該分子量的整數倍的分子量的單鏈DNA。因此，本發明的分子量標記物，提供的是用作起始物質的單鏈DNA和/或分子量為該分子量的整數倍的單鏈DNA的混合物。進而，通過瓊脂糖電泳等分離該混合物的分子量標記物，切出與各分子量相對應的單鏈DNA而進行生成，就可以提供具有特定分子量的單鏈DNA。在本發明的單鏈分子量標記物的制作方法中，只要是單鏈DNA就可以使用任意DNA,但優選環狀單鏈DNA。
如前所述，如果使用含有本發明的Evl蛋白質而成的組合物，就可以切斷單鏈DNA并使其再次結合，所以可以制作含有各種長度(或分子量)的單鏈DNA。例如，當參考本發明的實施例進行說明時，如圖14~圖18的a所示，如果使含有本發明的Evl蛋白質而成的組合物作用于(J) xi74環狀單鏈DNA (5368個堿基)，就可以制作5368 x n個堿基(n為1以上的整數)的分子量標記物(以圖14~圖18的a的皿的相片的右側橫向橢圓模式地表示單鏈DNA。 一個橢圓表示5368個M的單鏈DNA的位置，兩個橢圓表示5368 x 2個堿基的單鏈DNA的位置，三個橢圓表示5368x 3個堿基的單鏈DNA的位置)。同樣地,如果使用不同分子量的單鏈DNA例如M13mpl8 (7250個堿基)，就可以制作7250 x n (n為1以上的整數)的分子量標記物(參考圖4)。
如果使用所制作的單鏈DNA分子量標記物，在通過輔助噬菌體等提取單鏈DNA時，可以對已取出的DNA的分子量進行研究。
需要說明的是，由本發明的組合物制作的單鏈DNA標記物，在經乙醇沉淀等之后，即便進行凍結干燥，其分子量也不會發生變化，所以可以用作穩定的單鏈DNA分子量標記物。
以下示出實施例，本發明并不限于此。
實施例
1.人Evl蛋白質的純化
利用PCR法從人cDNA庫(Clontech公司)分離Evl蛋白質(NCBI登錄號AAF21709) DNA片段(例如序列編號1)，在pET15b載體的Ndel位點進行克隆(Novagen公司)。在該構造中，使His標簽序列在已分離的基因的N末端側融合。Evl蛋白質使用:U^桿菌BL21 (DE3 )codonplus - RP林(Stratagene公司)來表達，通過包括除去6 x His標簽的步驟的四步驟進行純化。首先，佳束達Evl蛋白質的細胞在A緩沖液(20mM磷酸鉀(pH8.5 )、 700mM的NaCl、 5mM的2 -巰基乙醇、10mM的咪唑、10%的甘油)中懸浮，使用超聲波破碎器使細胞破碎。以30000 xg、 4"C離心分離得到的細胞破碎液20分鐘，平穩混合得到的上清和8ml的Ni -NTA瓊脂糖珠(QIAGEN公司)。在4匸下，利用一小時分批處理法使His標簽融合Evl蛋白質(His-Evl)結合。
用80ml的B緩沖液(20mM磷酸鉀(pH8.5 )、 700mM的NaCl、 5mM的2-巰基乙醇、30mM的咪唑、10 %的甘油)清洗Evl -結合珠，接著，用80ml的C緩沖液(20mM褲酸鉀(pH8.5)、 700mM的NaCl、 5mM的2-巰基乙醇、60mM的咪唑、10%的甘油)清洗，再次用80ml的B緩沖液清洗，然后將得到的Evl-結合珠填充到Econo-Column柱(BIO-RAD公司)。用300ml的D緩沖液(20mM磷酸鉀(pH8.5)、 lOOmM的NaCl、 5mM的2-巰基乙醇、30mM的咪唑、10%的甘油)清洗填充的Evl 一結合珠，通過30 ~ 300mM咪唑的直線濃度梯度將His — Evl洗脫出來。
向含有His-Evl的組分中添加等量的F緩沖液(10mM磷酸鉀(pH8.5 )、 100mM的NaCl、 5mM的2 -巰基乙醇、10 %的甘油)，進而與10ml的羥基磷灰石(BIO-RAD公司)在4"C下通過一小時分批處理法平穩混合。隨后，用80ml的G緩沖液(20mM磷酸鉀(pH8.5)、 100mM的NaCl、 5mM的2-巰基乙醇、10%的甘油)清洗樹脂，填充到Econo-Column柱中。用300ml的H緩沖液(10mM褲酸鉀(pH8.5 )、225mM的NaCl、 5mM的2-St基乙醇、10 %的甘油)清洗填充的樹脂，然后通過225 ~ 1000mM的NaCl及10 ~ 300mM的褲酸鉀(pH8.5 )的直線濃度梯度將His - Evl洗脫出來。
對于得到的His - Evl,每lmg添加5單位的凝血斷GE Healthcare Bio- Science公司)，對4L的J緩沖液(20mM磷酸鉀(pH8.5 )、 130mM的NaCl、 5mM的2-巰基乙醇、10%的甘油)，在4^下進行透氺斤。
在除去His標簽之后，Evl蛋白質進而使用Superdex 200凝膠過濾柱(HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade 、 GE Healthcare Bio -Science )層析法進行純化。純化后，對K緩沖液(20mM HEPES( pH7.3 )、lOOmM的NaCl、 5mM M 2 -巰基乙醇、30 %的甘油)、或L緩沖液(20mM的磷酸鉀(pH8.5 )、 700mM的NaCl、 5mM的2 -巰基乙醇、30 %的甘油)，將Evl蛋白質進行透析，在-20"C下保存。已純化的Evl蛋白質的濃度，利用Bradford法并以BSA為基準進行測定。圖la是已純化的Evl蛋白質進行12 % SDS - PAGE的結果。
2.使用了 Evl -或Rad51B -結合珠的下拉(Pull-down)測定
Rad51B蛋白質按照已經損 l"的方法進行純化(Yokoyama等，J. Biol.Chem.278: 2767-2772, 2003)。
根據說明書使Evl蛋白質及Rad51B蛋白質結合在Affi-gel 10珠(Bio-Rad公司)上。添加乙醇胺(pH8.0)以使殘留的酯瓶基的最終濃度成為lOOmM,在4X:下孵育一晚。用500 p 1的清洗緩沖液-1 ( 20mM的磷酸鉀(pH8.5 )、 30 %的甘油、700mM的NaCl、 5mM的2 -巰基乙醇、0.05% Triton X-100 )三次清洗Affi-gel 10-Evl珠，用清洗緩沖液-2(20mM HEPES — NaOH (pH7.3 )、 30%的甘油、卯mM的NaCl、 2mM的2 -巰基乙醇、0.1 %的Triton X-IOO、 2mM的硫酸銨、O.lmM的EDTA)三次清洗Affi-gel 10-Rad51B珠，然后將Affi-gel 10-蛋白質制備成50%懸浮液，在4C下保存。
在進行結合測定的情況下，將Affi-gel10-蛋白質懸浮液(30jLil)與10 n g的Evl或Rad51B蛋白質在室溫下孵育150分鐘。用100 M1的緩沖液-1 ( 20mM的磷酸鉀(pH8.5 )、 30 %的甘油、700mM的NaCl、 5mM的2 -巰基乙醇、0.3 %的Triton X-100 )四次清洗Affi - gel 10 - Evl珠。另外，用100 M1的緩沖液-2 (20mM HEPES - NaOH (pH7.3 )、 30 %的甘油、卯mM的NaCl、 2mM的2 -巰基乙醇、2mM的石克酸銨、O.lmM的EDTA、 0.35%的Triton X-100)四次清洗Affi-gel 10-Rad51B珠。將SDS - PAGE樣品處理緩沖液(2 x )和清洗后的珠直接混合，在100■€下進行2分鐘熱處理，用12%的SDS-PAGE分離之后，用考馬斯亮藍對蛋白質進行染色。
如圖lb所示，Rad51B蛋白質被Ev1-結合^Mi下。另外，Evl蛋白質被Rad51B結合^Mi下(圖lc )。
根據這些結果，可知Evl蛋白質與Rad51B直接結合。在Evl-結合珠用于Pull-down測定的情況下，Rad51B通過與Evl -結合珠1: 1的化學計量法結合(圖lb )。另一方面，大量的Evl蛋白質與Rad51B結^^珠一起沉降(圖lc)。因此，認為Evl蛋白質彼此聚合而形成復合體。通過凝膠過濾分析，Evl蛋白質在約600kDa的組分處被洗脫出來，示出Evl蛋白質形成了約13亞基的多聚體(multimer)(圖2 )。
3. DNA結合測定
接著，對Evl蛋白質和DNA的結合性進行了研究。
在10 jLi 1的反應溶液(20mM的HEPES (pH7.5 )、 lmM的DTT、lmM的MgCl2、 100mg/ml的BSA)中混合(J) x 174環狀單鏈DNA (40M M)或(|) x 174超螺旋雙鏈DNA (10 in M )，在37"C下使其^^應15分鐘。反應產物，使用1 x TAE (40mM的TRIS乙酸、lmM的EDTA)緩沖液，用0.8 %瓊脂糖^電泳(3V/cm、 3小時)進行解析。DNA帶用溴化乙錠染色(圖3)。由測定的結果可知，Evl蛋白質與單鏈DNA及超螺旋雙鏈DNA高效地結合(圖3 )。
4.單鏈DNA的連環體化測定
在20mM的HEPES — NaOH( pH7.5 )、 lmM的DTT、 lmM的MgCl2、O.lmg/ml的BSA中，在37匸下孵育(|) x 174或M13mpl8環狀單鏈DNA
(20nM)。隨后，利用0.2。/。的SDS、 1.3mg/ml的蛋白酶K對樣品進行除蛋白處理。用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳分離得到的產物，用SYBR Gold
(Invitrogen公司)對DNA帶進行染色。
與Evl蛋白質作用的DNA當中，環狀單鏈DNA形成了多聚體(圖4a中的泳道2、 4，圖4b中的泳道2),與此相對，超螺旋雙鏈DNA未見特別變化(圖4b中的泳道5)。 Evl蛋白質未誘導超螺旋雙鏈DNA的拓樸結構變化，所以認為Evl蛋白質的活性與拓樸異構酶I之類的活性(圖4b中的泳道6)不同。
接著，對針對Evl蛋白質活性的金屬離子的要求性進行了研究，結果示出強烈要求Mg2+ (圖5a)。雖在沒有M^+存在的情況下，認為也具有Evl蛋白質的連環體化活性，但活性通過Mg"而得到促進。關于MgS+的最佳濃度，受反應條件(其他成分，例如甘油濃度、鹽濃度)左右，例如為0.1mM~20mM,優選0.5mM ~ 15mM，更優選0.5mM ~10mM,進一步優選0.5mM 2mM左右。另外，關于Mg2+以外的金屬離子，Ca"也示出相同的效果(圖5b)。就Mn"而言，在本實驗條件下，形成巨大的DNA復合體樣的生成物，另外，就Zn"而言，未見類似MgH那樣的促進活性(圖5b )。
另外，形成的單鏈DNA的多聚體，即便在ioox:下處理IO分鐘也
不被消除(圖6),所以表明這些多聚體是在環上連結的環狀單鏈DNA的連環體。
接著，為了通過視覺捕捉環狀單鏈DNA因Evl蛋白質的作用而被連環體化的狀態，而用電子顯微鏡來觀察生成產物。5. 電子顯微鏡觀察
利用苯酚/氯仿法提取由Evl蛋白質形成的單鏈DNA連環體，隨后 通過乙醇沉淀進行回收。接著，在沒有ATP存在的情況下用RecA蛋白 質(New England Biolabs公司)覆蓋單鏈DNA連環體，在鍍碳的銅制 載網上用2%乙酸雙氧鈾進行染色。經染色的樣品通過基于鎢的旋轉噴 涂法而視覺化，用JEOLJEM2000FX電子顯微鏡進行觀察。
如圖7所示，觀察到含有2或3個單鏈DNA分子的環狀單鏈DNA 連環體。
綜上，根據單鏈DNA的連環體化的測定及電子顯微鏡的觀察結果， 認為Evl蛋白質通過切斷環狀單鏈DNA，隨后將5'末端和3，末端結合， 來形成連環體。因此，可以得出下述結論，即Evl蛋白質具有切斷單鏈 DNA的活性及將5'末端和3，末端結合的活性。
需要說明的是，得出即便是直鏈狀單鏈DNA也可以發生連環體化 的結果。
6. Rad51B的影響
接著，研究基于Evl蛋白質的單鏈DNA的連環體化是否受Rad51B 的影響。如圖8a所示，可知通過Evl蛋白質的DNA的連環體化，在ATP 的存在下，被Rad51B顯著促進(泳道4 )。與此相對，Rad51B依賴性的 促ii^沒有ATP存在的情況下并不那么顯著(圖8a中的泳道8)。因此， 提示ATP結合Rad51B蛋白質促i4^于Evl蛋白質的DNA的連環體化。 基于Rad51B的Evl蛋白質活性的促進效果，依賴于Rad51B的添加濃 度而上升，^M目對于4 n M的Evl蛋白質，即^f更添加1 n M以上的Rad51B， 也未見在其以上的促進效果(圖9 )。
另一方面，與Rad51B示出序列類似性的Rad51蛋白質，無論有無 ATP都抑制通過Evl蛋白質的DNA的連環體化(圖8b)。才艮據這些結 果，提示在Evl和Rad51B蛋白質之間，通過特異的功能性相互作用，Evl 蛋白質的活性得到促進。
7. Evl蛋白質的EVH2域為了對成為通過Evl蛋白質將單鏈DNA連環體化的原因的功能域 進行鑒定，對含有1 - 221及222 - 418的氨基酸殘基的兩個Evl片段、 Evl (1 - 221)及Evl ( 222 - 418 )進行了純化。Evl (1 - 221)及Evl (222 - 418 )的純化以在純化Evl蛋白質全長時使用的方案為基準進行。
按照常規方法，制作用于表達Evl (1-221)及Evl (222-418) 的構造體后，分別轉化到大腸桿菌(BL21(DE3))，使蛋白質得以表達。 關于Evl (1-221)，在回收了細胞提取物之后，通過Ni-NTA瓊脂糖 柱(Invitrogen公司)，將得到的峰組分與羥基磷灰石(Bio - Rad公司) 混合。離心分離后，回收未與羥基磷灰石結合的上清，通過凝血酶處理 除去His標簽，利用Superdex 200 ( GE Healthcare公司)柱層析法， 分離Evl (1 - 221)和標簽。將通過Superdex 200柱層析法得到的Evl
(1-221)用于實驗(圖10)。關于Evl (222-418)，在回收了細胞提 取物之后，通過Ni - NTA瓊脂糖柱(Invitrogen公司)，使得到的峰組 分通過羥基磷灰石(Bio-Radz>3 )，回收峰組分。對于已回收的Evl
(222-418)，通過凝血酶處理除去His標簽，利用Superdex 200 ( GE Healthcare公司)柱層析法，分離Evl (222-418)和標簽。將通過 Superdex 200柱層析法得到的Evl ( 222 - 418)用于實驗(圖11 )。
Evl (1 - 221)變異體含有EVH1及富含脯氨酸域，Evl ( 222 - 418 ) 變異體含有EVH2域(圖12a )。如圖12b所示，Evl ( 222 - 418 )變異 體示出ssDNA連環體化活性(泳道4 ),而Evl (1 - 221)變異體未示 出ssDNA連環體化活性(泳道3)。另外，Evl (222-418)變異體的活 性被Rad51B蛋白質促進(圖12c中的泳道8 )，關于Evl (1 - 221)變異 體，即l更是添加Rad51B蛋白質也未檢測出活性(圖12c中的泳道6 )。
因此，EVH2域認為是Evl蛋白質的ssDNA連環體化活性所必需的。
8.在DNA拓樸異構酶I型蛋白質及Evl蛋白質共存下的單鏈DNA 的連環體化的促進效果
在10pl的反應液(20mM的HEPES、 ImM的DTT、 100pg/ml的 BSA、 lmM的MgCl2)中，添加20 jiM的(J) x 174單鏈DNA、 4pM的 Evl、及各濃度或單位數的DNA拓樸異構酶I型蛋白質(源自大腸桿菌 或源自人)，在371C下使其反應1小時。隨后，用(K2。/。的SDS、 1.3mg/ml的蛋白酶K對樣品進行除蛋白處理。用0.9 %的瓊脂糖皿電泳分離得到 的產物，用SYBRGold (Invitrogen公司)對DNA帶進行染色(圖13 )。
其結果可知，單鏈DNA的連環體化，在源自大腸桿菌(圖13a中 的泳道4~5)或源自人(圖13b中的泳道4)的DNA拓樸異構酶I型 蛋白質的共存下得到促進。
9.對影響Evl蛋白質引起的單鏈DNA鏈接活性的低分子化合物的 探索
對可以用于適時調節Evl蛋白質引起的單鏈DNA鏈接活性的低分 子化合物進行了探索，結果發現阿克拉霉素、克菌定、DIDS、 p -玉紅 霉素及3 — ATA ^ft合物。
上述^f匕合物的抑制活性如下所示被檢測出。
關于對鏈接活性的影響(圖14 ~圖18的a )，向反應液10 n 1 ( 20mM 的HEPES、 lmM的DTT、 100 n g/ml的BSA、 lmM的MgCl2)中，添 加各化合物使其終濃度為1、 5、 10、 20jiM，添加(J) xl74單鏈DNA使 其為20juM,添加Evl蛋白質使其為4jliM，在37"C下使其反應1小時。 反應后，添加2pl的PK溶液(0.2。/。的SDS、 1.3mg/ml的蛋白酶K)，在 37C下使其反應15分鐘。用0.8 %的HGT瓊脂糖皿將反應物進行電泳， 通過SYBR Gold檢測出DNA。
另外，關于單鏈DNA結合活性涉及的凝膠阻滯(gel shift)法(圖14 ~ 圖18的b )，向反應液20 p l( 20mM的HEPES、 lmM的DTT、 100 M g/ml 的BSA、 lmM的MgCl2)中，添加各化合物使其終濃度為1、 5、 10、 20 ji M，添加(|) x 174單鏈DNA使其為20 p M,添加Evl蛋白質使其為 0.3 )i M，在37"C下使其反應15分鐘。用0.8 %的HGT瓊脂糖艦將其進 行電泳，用溴化乙錠進行檢測。
9 - 1.阿克拉霉素(Aclarubicin )
阿克拉霉素是大幅度降低心臟毒性的蒽環類抗腫瘤藥。也是拓樸異 構酶I/II的催化活性抑制劑。另外，通過抑制20S蛋白酶體的胰凝乳蛋 白酶樣活性，也抑制泛素化蛋白質的分解。已知會抑制大動脈平滑肌細胞的IL - 1 P誘導性iNOS產生。臨床上是作為抗肺瘤性抗生素(產品 名Aclacinon )進行試用，與癌細胞的DNA結合而強烈抑制核酸合成、 RNA合成，由此用于緩解及改善胃癌、肺癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、 急性白血病的自覺以及他覺癥狀。此次，發現阿克拉霉素抑制Evl蛋白 質引起的單鏈DNA的鏈接活性(圖14a)。另外，4吏用凝膠阻滯試驗法 研究阿克拉霉素對Evl蛋白質向單鏈DNA的結合活性的影響(圖14b )。 其結果可知，阿克拉霉素不使Evl蛋白質的單鏈DNA的結合活性發生 變化。根據以上的解析，可知阿克拉霉素在不抑制Evl蛋白質向單鏈 DNA的結合活性的情況下，抑制單鏈DNA鏈接活性。
9 - 2. 克菌定(Dequalinium )
克菌定(氯化克菌定)是抗腫瘤及PKC抑制劑。另外，當照射UV 時，克菌定與PKCa或PKCP共價結合，對它們進行不可逆抑制。是 針對蜂神經毒肽敏感性低傳遞性Ca^活化K+通道的強力且選擇性的非 肽阻斷劑，阻滯神經傳遞。另外，選擇性地蓄積在癌細胞的線粒體中，
抑制能量產生。臨床上以產品名乂一卜'^ i;》卜口一f而使用。該藥劑
作用于細菌的蛋白質而殺滅口腔、咽喉的細菌，用于預防咽炎、扁桃體 炎、口炎、包括拔牙傷的口腔創傷的感染。此次，發現克菌定抑制Evl 蛋白質的單鏈DNA鏈接活性(圖15a)。另外，使用凝膠阻滯試驗法研 究克菌定對Evl蛋白質向單鏈DNA的結合活性的影響(圖15b)。其結 果可知，克菌定使Evl蛋白質向單鏈DNA的結合樣式發生變化。根據 以上的解析，認為克菌定使Evl蛋白質向單鏈DNA的結合樣式發生變 化，抑制Evl蛋白質的環狀單鏈DNA鏈接活性。
9 - 3. DIDS (Disodium Salt)
dids是對神經母細胞瘤細胞中的cr^uv進行抑制的陰離子輸送抑
制劑，顯示出抗潰瘍作用。另夕卜，還已知抑制向內質網的ATP輸送。此次， 發現DIDS抑制Evl蛋白質引起的單鏈DNA鏈接活性(圖16a)。另夕卜， 使用凝膠阻滯試驗法研究DIDS對Evl蛋白質向單鏈DNA的結合活性 的影響(圖16b)。其結果可知，DIDS抑制Evl蛋白質向單鏈DNA的 結合活性。根據以上的解析，認為DIDS通過抑制Evl蛋白質的單鏈DNA 結合活性來抑制Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性。9 - 4. P -玉紅霉素
P -玉紅霉素是HIV-I逆轉錄酶的抑制劑。另外，還知作為端粒酶 的抑制劑。此次，發現P -玉紅霉素抑制Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活 性(圖17a)。另外，使用凝膠阻滯試驗法研究P -玉紅霉素對Evl蛋白 質向單鏈DNA的結合活性的影響(圖17b)。其結果可知，由于P-玉 紅霉素而使Evl蛋白質向單鏈DNA的結合樣式發生變化。才艮據以上的 解析，認為P -玉紅霉素使Evl蛋白質的單鏈DNA結合樣式發生變化， 抑制Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性。
9一5. 3-ATA (3-^^ — 9—石危4戈(10H)—吖咬酮；3 —amino-9 - thio (10H) - acridone)
3-ATA是CDK4的抑制劑。另外，還知進行p - 16變異肺瘤的增殖 抑制。此次，發現3 - ATA抑制Evl蛋白質的單鏈DNA鏈接活性(圖 18a )。另夕卜，使用凝膠阻滯試驗法研究3 - ATA對Evl蛋白質向單鏈DNA 的結合活性的影響(圖18b)。其結果可知，3-ATA不使Evl蛋白質的 單鏈DNA結合活性發生變化。根據以上的解析，認為3-ATA在不抑 制Evl蛋白質的單鏈DNA結合活性的情況下，抑制Evl的單鏈DNA鏈 接活性。
工業上的可利用性
本發明的組合物，同時具有單鏈DNA的切斷活性及將單鏈DNA的5， 末端和3，末端結合的活性，所以對單鏈DNA進行基因工程上的操作， 可作為有效的工具而發揮作用。另外，當使用本發明的組合物時，也可 以提供單鏈DNA的分子量標記物等，所以本發明的組合物有望能在生 物、醫學領域的研究開發的發展中做出較大的貢獻。
權利要求
1.一種組合物，其特征在于，含有以下的(a)或(b)所示的Evl蛋白質而成，用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA的5’末端和3’末端的結合；(a)由序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12或序列編號20所示的氨基酸序列構成的蛋白質；(b)由在序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12或序列編號20所示的氨基酸序列中，具有1或數個氨基酸的取代、缺失或插入的氨基酸序列所構成，且具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5’末端和3’末端結合的活性的多肽。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，還含有M^ +或Ca2 + 。
3. 根據權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述Mg^的濃度為0.5mM ~ 2.0mM。
4. 根據權利要求1~3中任意一項所述的組合物，其特征在于，還含有Rad51B蛋白質及ATP。
5. 根據權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述Evl蛋白質相對于所述Rad51B蛋白質的摩爾比為1: 0.5~1: 4。
6. 根據權利要求4或者5所述的組合物，其特征在于，所述ATP的濃度為0.5mM ~ 2.0mM。
7. 根據權利要求1~3中任意一項所述的組合物，其特征在于，還含有DNA拓樸異構酶I型蛋白質。
8. —種組合物，其特征在于，含有包含以下(a)或(b)所示核酸的重組載體而成，用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA的5，末端和3，末端的結合；(a) 由序列編號l、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11或序列編號19所示的核苷酸序列構成的核酸，(b) 與由序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9、序列編號11或序列編號19所示的核苷酸序列構成的核酸的互補鏈在嚴^件下雜交的核酸，且該核酸編碼的多肽具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合的活性。
9. 一種組合物，其特征在于，含有包含以下(a)或(b)所示核酸的重組載體而成，用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA的5，末端和3，末端的結合，(a)對由序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10、序列編號12或序列編號20所示的^酸序列構成的多肽進行編碼的核酸；(b)對如下所示的多肽進行編碼的核酸，所述多肽由在序列編號2、序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號IO、序列編號12或序列編號20所示的JL&酸序列中具有1或數個氨基酸的取代、缺失或插入的氨基酸序列所構成，且具有切斷單鏈DNA及將單鏈DNA的5，末端和3，末端結合的活性。
10. —種制造單鏈DNA標記物的方法，其特征在于，使權利要求1~9中任意一項所述的組合物與單鏈DNA發生反應，來制造單鏈DNA標記物。
11. 一種單鏈DNA標記物，其特征在于，是用權利要求10所述的方法制造的。
12. —種Evl蛋白質活性抑制用組合物，其特征在于，含有選自阿克拉霉素、克菌定、DIDS、 P -玉紅霉素及3-ATA中的一種或多種化合物而成。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種用于催化單鏈DNA的切斷及單鏈DNA的結合的組合物。本發明提供含有Evl蛋白質而成的用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA的5’末端和3’末端的結合的組合物。進而，本發明提供除了Evl蛋白質之外還含有Rad51B蛋白質和/或DNA拓撲異構酶I型蛋白質而成的、用于進行單鏈DNA的切斷和/或、單鏈DNA的5’末端和3’末端的結合的組合物。
文檔編號C12N15/00GK101627120SQ20088000701
公開日2010年1月13日 申請日期2008年3月7日 優先權日2007年3月7日
發明者町田晉一, 胡桃坂仁志, 高久譽大 申請人:學校法人早稻田大學