含抗grp78抗體作為有效成分的藥物組合物的制作方法

專利名稱：含抗grp78抗體作為有效成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療癌癥的方法和抗癌劑。
背景技術(shù)：
GRP蛋白(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白)是位于ER的分子伴侶。已知是在如缺乏葡萄糖時， 或高級結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的蛋白質(zhì)蓄積于小泡(ER)內(nèi)時，細胞響應(yīng)來自細胞內(nèi)外的各種ER壓 力而誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)家族(非專利文獻1)。GRP78是分子量為78kDa的GRP蛋白，又被稱為BiP (免疫球蛋白結(jié)合蛋白)。通 過GRP78過量表達實驗或反義抑制(Knock down)實驗發(fā)現(xiàn)，GRP78與針對ER壓力引起的 細胞死亡的防御反應(yīng)相關(guān)(非專利文獻1)。癌化細胞或癌化所致的變化的體內(nèi)環(huán)境所呈現(xiàn)的如低營養(yǎng)、低氧、低pH常被認 為是伴隨ER壓力而發(fā)生的狀態(tài)。為支持此情況，在多種癌細胞株和臨床癌癥檢體中發(fā)現(xiàn) GRP78蛋白的表達升高(非專利文獻2 5)。通過實驗發(fā)現(xiàn)，具有抑制拓撲異構(gòu)酶的活性 或抑制血管生成的活性的抗癌劑的抗癌性的獲得與GRP78蛋白表達升高及其抗凋亡活性 密切相關(guān)(非專利文獻6、7)。臨床中也發(fā)現(xiàn)，GRP78表達抗進的乳癌患者組相比GRP78表 達低下的組，用阿霉素進行的化學(xué)療法的效果差(非專利文獻8)。這些報道提示，GRP78的表達抗進在癌細胞的存活、惡化、抗癌劑耐受的機理中發(fā) 揮作用(非專利文獻1)。如上所述，已知GRP78是位于ER的分子伴侶，而有報道稱在一部分癌細胞中， GRP78蛋白位于細胞表面。且通過幾種全然不同方法提示了應(yīng)用以所述定位于細胞表面的 GRP78為靶標(biāo)的抗腫瘤劑的可能性。用毒胡蘿卜內(nèi)酯(Tg)處理橫紋肌肉瘤細胞株TE671/RD后進行FACS分析證實，有 少數(shù)細胞膜被抗GRP78抗體著色，表明GRP78位于細胞膜上(非專利文獻9)。但所述報道僅表明由Tg處理所誘導(dǎo)的細胞死亡時的瞬時現(xiàn)象，并非表示癌細胞 的恒常的GRP78位置變化的數(shù)據(jù)。且由于所用抗體為市售的源自山羊的多克隆抗體，也不 清楚其表位。此后，其它研究小組通過噬菌體結(jié)合測定得到了 2種GRP78結(jié)合肽(WIFPWIQL、 WDLAWMFRLPVG)，并報道所述肽不僅與固定于平板上的GRP78蛋白結(jié)合，還吸附于前列腺癌 細胞株DU145的細胞表面并被所述細胞攝入(非專利文獻10)。此實驗揭示了 GRP78位于 癌細胞的細胞膜上的可能性。還確認了可將所述GRP78結(jié)合肽用作抗腫瘤劑的可能性。即有報道稱于所述 GRP78結(jié)合肽上附加凋亡誘導(dǎo)肽序列(KLAKLAK)2(非專利文獻11)而合成的肽不僅體外誘 導(dǎo)DU145細胞的細胞死亡，還在利用小鼠移植模型的體內(nèi)實驗中表現(xiàn)出抗腫瘤效果(非專 利文獻10)。另外，其它研究小組在探索已知抑制血管生成的纖溶酶原的被稱為Kringle5(K5) 的結(jié)構(gòu)域所識別的靶標(biāo)分子的過程中發(fā)現(xiàn)，K5的靶標(biāo)是血管內(nèi)皮細胞所表達的GRP78蛋白(非專利文獻16)。還發(fā)現(xiàn)重組的K5通過GRP78不僅抑制血管生成，還誘導(dǎo)在低氧條件下 培養(yǎng)的各種癌細胞株的細胞死亡(非專利文獻16)。這一連串的實驗表明，可將與在癌細胞或血管內(nèi)皮細胞的細胞表面表達的GRP78 結(jié)合的肽用作抗腫瘤劑。但還不清楚所述肽識別被認為表達于細胞表面的GRP78的哪部 分，所以利用所述肽開發(fā)藥物還被認為有些困難。與所述觀點不同，另外2個獨立的研究小組用各自不同的方法報道了 GRP78位于 細胞膜上。一個研究小組發(fā)現(xiàn)，識別受體的α 2巨球蛋白(α 2Μ*)對前列腺癌細胞株(1_LN) 發(fā)揮增殖因子的功能(非專利文獻12)；此后該小組發(fā)現(xiàn)所述受體即為GRP78(非專利文獻 13)。此發(fā)現(xiàn)表明，長期被認為是ER蛋白的GRP78蛋白還在細胞膜上發(fā)揮增殖因子的受體 的功能。而另一小組發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的血清中存在識別肽序列“CNVSDKSC”的抗體(抗 CNVSDKSC抗體)，并在分析所述抗體識別的抗原蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)，所述抗原蛋白即為 GRP78蛋白(非專利文獻14)。但實際上GRP78內(nèi)不存在序列“CNVSDKSC”或其類似序列， 尚不清楚所述來自前列腺癌患者的抗體識別GRP78的哪部分。此后，其它研究小組對所述肽“CNVSDKSC”進行三級結(jié)構(gòu)分析，并搜索了 GRP78 中是否存在具有同樣的三級結(jié)構(gòu)的區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于GRP78的Leu98-Leu115的序列 “LIGRTWNDPSVQQDIKFL”相當(dāng)于所述序列。在制備出針對所述序列的兔多克隆抗體后發(fā)現(xiàn)， 所述抗體可對諸如前列腺癌株1_LN、DU145、黑色素細胞株DM413的癌細胞的細胞表面進行 染色。且發(fā)現(xiàn)，所述抗體同加入α 2M*時所觀察到的一樣，可升高前列腺癌細胞的細胞內(nèi)鈣 濃度、誘導(dǎo)前列腺癌細胞的細胞增值，及呈現(xiàn)出對TNF α的抗凋亡作用(非專利文獻15)。 如此，從針對GRP78的Leu98-Leu115的抗體模擬了 α 2Μ*的配體活性得知，GRP78中的此區(qū) 域是α 2Μ*的結(jié)合序列(非專利文獻15)。此報告證實了 GRP78存在于前列腺癌等的細胞表面，且清楚了 GRP78的 Leu98-Leu115(LIGRTWNDPSVQQDIKFL)作為α 2Μ*的結(jié)合位點暴露于細胞外。而且，通過其它方法發(fā)現(xiàn)針對GRP78的98-115的區(qū)域的抗體可使癌細胞的細胞表 面著色，從而清楚了所述區(qū)域可為GRP78的細胞外表位。盡管已如述在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)GRP78蛋白表達升高，且已清楚其定位于細胞膜， 但仍難于利用這些知識制備以GRP78為靶標(biāo)的新的抗體治療藥物。原因是，第一，因為尚不 知所述GRP78結(jié)合肽與GRP78蛋白的那個區(qū)域結(jié)合，所以不可能制備出預(yù)期與所述肽具有 同樣效果的抗體。實際上也不存在可替代所述肽的作用的單克隆抗體。第二，盡管與GRP78 的98-115的區(qū)域結(jié)合的抗體可結(jié)合于癌細胞的細胞表面，但頂多能模擬α 2Μ*的增殖促進 作用，尚期待不了所述抗體具有抗腫瘤活性。因此認為難于利用與GRP78結(jié)合的抗體抑制腫瘤活性。非專利文獻1 :Lee AS. Trends Biochem Sci. 2001，26，504-10非專利文獻 2 =Patierno, et al. 1998，Cancer Re s. 47，6220-24非專利文獻3:Bini et al. 1997, Electrophoresis. 18,2832-41非專利文獻 4 =Gazit et al. 1999，Breast Cancer Res. Treat. 54，135—46非專利文獻 5 :Fernandez et al. 2000, Breast Cancer Res. Treat. 59，15-26
非專利文獻6:Reddy et al，J. Bio. Chem. 2003，278，20915-24非專利文獻7:Dong et al，2005，Cancer Res. 65，5785-5791非專利文獻8 :Lee et al. 2006，Cancer Res. 66,7849-7853非專利文獻 9 :Delpino et al. 1998, Molecular MembraneBiology, 15, 21-26非專利文獻10 =Arap et al. 2004，CANCER CELL. 6，275-284非專利文獻11 Javadpour et al. 1996，J. Med. Chem. 39，3107-3113非專禾Ij 文獻 12 =Asplin et al. 2000, Archives of Biochemistryand Biophysics. 383，135-141非專利文獻13 =Misra et al. 2002，J. Biol. Chem. 277，42082-42087非專利文獻14 :Mintz et al. 2003，Nat Biotech. 21，57-63非專利文獻 15 =Gonzalez-Gronow et al. 2006，Cancer Res. 66，11424-11431非專利文獻 16 =Davidoson et al.，2005，Cancer Res. 65,4663-467
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明擬解決的課題本發(fā)明旨在提供使用抗GRP78抗體的新的藥物組合物。本發(fā)明更具體旨在提供使 用抗GRP78抗體的新的癌癥治療方法、含抗GRP78抗體的新的細胞增值抑制劑和抗癌劑，及 新的抗GRP78抗體。解決課題的方法發(fā)明人嘗試了制備以定位于癌細胞的細胞膜的GRP78為靶標(biāo)的抗腫瘤抗體。為 此，需要首先鑒定可成為暴露于癌細胞的細胞表面的抗體的表位的氨基酸。所以純化了 GRP78蛋白，用其免疫小鼠，并篩選了僅使癌細胞著色的抗體。結(jié)果成功得到了特異性結(jié)合 于癌細胞的細胞表面的抗GRP78抗體。然后嘗試鑒定了識別所得抗體的序列。通過分析 發(fā)現(xiàn)，所述抗體特異性識別GRP78的376-415的40個氨基酸。即發(fā)現(xiàn)了 GRP78的376-415 氨基酸區(qū)域暴露于細胞外。接下來證實識別所述表位的抗體被細胞迅速攝入。通過制備所 述抗體上附加了毒素的scFv抗體，并分析對癌細胞株的體外作用發(fā)現(xiàn)，所得經(jīng)毒素標(biāo)記的 scFv抗體特異性殺傷癌細胞。使用移植了癌細胞的異種移植小鼠模型分析抗體的作用時觀 察到，抗體的施用顯著抑制了移植腫瘤的增殖。此結(jié)果證實，所述抗體不僅在體外，還在體 內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤活性。以上認識提示，可將針對GRP78的細胞外區(qū)域的抗體用作抗腫瘤劑。本發(fā)明的發(fā)明人基于以上認識意識到可解決上述課題。具體提供下列(1)_(28)中記載的方案。(1)含與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)結(jié)合的抗體的藥物組合物。(2) (1)的組合物，其是抗癌劑。(3)⑴或⑵的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。(4) (1)-(3)中任一項的組合物，其中所述抗體是與位于細胞表面的GRP78結(jié)合的 抗體。(5) (1)-(4)中任一項的組合物，其中所述抗體是被表達GRP78的細胞攝入的抗體。(6) (1)-(5)中任一項的組合物，其中所述抗體是與SEQ IDNO 3所示表位結(jié)合的抗體。(7) (1)-(6)中任一項的組合物，其中所述抗體是結(jié)合有傷細胞物質(zhì)的抗體。(8)與GRP78結(jié)合的單克隆抗體。(9) (8)的抗體，其特征在于與在細胞表面表達的GRP78結(jié)合。(10)⑶或(9)的抗體，其特征在于被表達GRP78的細胞攝入。(11) (S)-(IO)中任一項的抗體，其特征在于與SEQ ID NO 3所示表位結(jié)合。(12) (S)-(IO)中任一項的抗體，其特征在于識別與下列(a)-(f)中任一項的抗體 識別的表位相同的表位(a)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 9所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 10所示氨基酸序列，且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 11所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 13所示氨基酸序列；(b)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 18所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 19所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 20所示氨基酸序列，且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 21所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 22所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 23所示氨基酸序列；(c)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 61所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 62所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 63所示氨基酸序列，且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 64所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 65所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 66所示氨基酸序列；(d)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 71所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 72所示氨基酸序列、
CDR3具有SEQ ID NO 73所示氨基酸序列，且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 74所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 75所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 76所示氨基酸序列；(e)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 81所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 82所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 83所示氨基酸序列，且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 84所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 85所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 86所示氨基酸序列；(f)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 91所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 92所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 93所示氨基酸序列，且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，CDRl具有SEQ ID NO 94所示氨基酸序列、CDR2具有SEQ ID NO 95所示氨基酸序列、CDR3具有SEQ ID NO 96所示氨基酸序列。(13) (8)-(12)中任一項的抗體，其特征在于對表達GRP78的細胞具有傷細胞活性。(14) (13)的抗體，其特征在于結(jié)合有傷細胞物質(zhì)。(15)使用抗GRP78抗體將傷細胞物質(zhì)遞送至細胞內(nèi)的方法。(16)通過結(jié)合于抗GRP78抗體的傷細胞物質(zhì)抑制細胞增殖的方法。(17) (15)或(16)的方法，其中所述細胞是癌細胞。(18)抗GRP78抗體用于將傷細胞物質(zhì)遞送至細胞內(nèi)的用途。(19)具有被細胞攝入活性的抗GRP78抗體用于抑制細胞增殖的用途。(20) (18)或(19)的用途，其中所述細胞是癌細胞。(21) (18)-(20)中任一項的用途，其特征在于所述抗GRP78抗體結(jié)合有傷細胞物質(zhì)。(22)制備藥物組合物的方法，包括(a)提供抗GRP78抗體；(b)確認(a)中的抗體是否具有被細胞攝入活性；(c)篩選具有被細胞攝入活性的抗體；(d)向(C)中篩選出的抗體結(jié)合傷細胞物質(zhì)。
(23) (22)的方法，其中所述藥物組合物是抗癌劑。(24)使用抗GRP78抗體診斷癌癥的方法。(25) (24)的方法，其特征在于使用結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體。(26) (24)或(25)的方法，其特征在于檢測被攝入細胞內(nèi)的抗GRP78抗體。(27)結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體。(28)由SEQ ID NO 3的氨基酸序列構(gòu)成的多肽或其片段。發(fā)明效果本發(fā)明示可通過提供具有GRP78結(jié)合活性，且可被細胞攝入的新抗體來提供可用 于治療暴露GRP78于細胞表面的各種腫瘤或癌癥的新的藥物組合物。還可通過使用具有所 述特征的抗體來提供診斷各種腫瘤或癌癥的方法。附圖簡述

圖1 通過蛋白印跡法分析所得抗體與GRP78的結(jié)合活性的圖。泳道1中為由 DU145細胞制備的細胞裂解物，泳道2中為由大腸桿菌制備的GST-GRP78融合蛋白，泳各抗 體進行染色?？寡迨羌毎诤锨安杉男∈罂寡?。圖2 通過FACS分析所得抗GRP78抗體與DU145細胞的細胞表面的結(jié)合活性的圖。圖3 通過FACS分析GA-20抗體與各種癌細胞的細胞表面的結(jié)合活性的圖。圖4 (A)通過FACS分析GA-20抗體與各種永生細胞株的細胞表面的結(jié)合活性的 圖；(B)使用GA-20進行蛋白印跡來分析各種永生細胞株的GRP78蛋白表達的圖。圖5 通過FACS分析GA-20、GA-21抗體被攝入細胞內(nèi)的活性的圖。使各抗體與 DU145細胞反應(yīng)，在0°C或37°C溫育2小時后，用第二抗體(經(jīng)FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗 體)檢測結(jié)合于細胞表面的抗體。圖6 通過細胞免疫染色分析與DU145的細胞表面結(jié)合的GA-20抗體，不與所述細 胞的細胞表面結(jié)合的GA-31抗體是否被攝入細胞內(nèi)的圖。將各抗體加入培養(yǎng)中的DU145細 胞，并于37°C連續(xù)培養(yǎng)3小時。隨后如圖6下所示流程處理細胞，并檢測被攝入細胞內(nèi)的抗 體。圖7 通過蛋白印跡分析結(jié)合于GRP78的各抗體的表位的圖。上圖為表位分析中 使用的GST-GRP78融合蛋白(1-6)的模式圖。下圖為對各GST-GRP78融合蛋白(1_6)進行 SDS-PAGE，并通過蛋白印跡法分析針對各蛋白的各抗體的反應(yīng)性的結(jié)果。圖8 為進一步純化GA-20、GA-21的GRP78內(nèi)的表位而進行的蛋白印跡分析結(jié)果 的圖。上圖是限定于更小范圍的GST-GRP78融合蛋白的模式圖。下圖為對各GST-GRP78融 合蛋白(1-5)進行SDS-PAGE，并通過蛋白印跡法分析針對各蛋白的GA-20、GA-21抗體的反 應(yīng)性的結(jié)果。圖9 顯示通過以與GRP78的結(jié)合活性為指標(biāo)的ELISA系統(tǒng)檢測由大腸桿菌純化 的經(jīng)毒素標(biāo)記的GA-20scFV抗體(GA20-PE40)從哪個級分洗脫出的分析結(jié)果。上圖為表示 檢測GA20-PE40與GRP78的結(jié)合活性的ELISA系統(tǒng)的模式圖，下圖顯示ELISA結(jié)果所得洗 脫級分的結(jié)合活性?！俺跏技壏帧北硎具M行GA20-PE40的表達誘導(dǎo)的大腸桿菌裂解物，“通過級分”表示施于HisTrap柱的裂解物徑直通過柱的級分，“洗滌級分”表示洗滌柱的級分，
“洗脫級分1”- “洗脫級分7”表示從柱洗脫出的洗脫級分。圖10 顯示經(jīng)純化的GA20-PE40對DU145細胞(圖10A)、22Rvl細胞(圖10B)或 DG44細胞(圖10C)的傷細胞活性。向各細胞以10%的濃度加入洗脫級分(洗脫級分2、3、 4)，隨后測定活細胞數(shù)，并量化了相對PBS加入組的細胞數(shù)的比例。圖11 通過FACS分析所得抗GRP78抗體與22Rvl細胞的細胞表面的結(jié)合活性。圖12:圖12(A)是在分析GA-20抗體及通過再免疫得到的4種新抗體(GC-18抗 體、GC-20抗體、⑶-4抗體、⑶-17抗體)的表位時使用的GST-GRP78融合蛋白的模式圖。圖 12 (B)是通過SDS-PAGE和CBB染色確認通過加入IPTG而誘導(dǎo)大腸桿菌表達各GST-GRP78 融合蛋白的結(jié)果。圖13 通過蛋白印跡法分析各抗體的表位的圖。顯示了對各GST-GRP78融合蛋白 進行SDS-PAGE，并分析各抗體的反應(yīng)性的蛋白印跡結(jié)果。下表顯示從蛋白印跡結(jié)果得到的 各抗體的表位的結(jié)果。圖14 為調(diào)節(jié)經(jīng)純化的⑶17scFv_PE40的純度，對所述經(jīng)純化的⑶17scFv_PE40 進行SDS-PAGE后進行CBB染色的圖。圖15 顯示為分析經(jīng)純化的⑶17scFV-PE40與GRP78蛋白的結(jié)合活性及蛋白的 穩(wěn)定性而進行的ELISA的結(jié)果。將4°C保存、37°C靜置過夜的⑶17scFV-PE40及經(jīng)凍融的 ⑶17scFV-PE40稀釋成各濃度，并通過ELISA分析了與GST-GRP78的結(jié)合活性。下表以EC5tl 值顯示了各樣品的與GRP78蛋白的結(jié)合活性。圖16A 顯示經(jīng)純化的⑶17scFV-PE40對各種細胞株的傷細胞活性的結(jié)果。將 GD17scFv-PE40稀釋成各濃度后加入癌細胞株(圖16A)，并在培養(yǎng)數(shù)日后分析活細胞數(shù)。表 中顯示了給出最大活性的50%的活性時的抗體濃度(EC5tl值)。圖16B 顯示經(jīng)純化的⑶17scFV-PE40對各種細胞株的傷細胞活性的結(jié)果。將 ⑶17scFV-PE40稀釋成各濃度后加入正常細胞株(圖16B)，并在培養(yǎng)數(shù)日后分析活細胞數(shù)。 表中顯示了給出最大活性的50%的活性時的抗體濃度(EC5tl值)。圖17 顯示了使用⑶-17抗體通過蛋白印跡法分析各種細胞株的GRP78蛋白表達 的圖。圖18 分析小鼠移植模型中⑶17scFV-PE40的體內(nèi)抗腫瘤活性的結(jié)果。在移植 22Rvl(第0天)后第17天、第21天、第23天、第26天和第29天時施用PBS(媒質(zhì))或 0. 5mg/kg的⑶17scFV-PE40，并隨后經(jīng)時測定了腫瘤體積。
具體實施例方式本發(fā)明的抗GRP78抗體只要是可與GRP78蛋白(SEQ ID NO 2)結(jié)合的抗體即可， 不限其來源(如小鼠、大鼠、人)、種類(如單克隆抗體、多克隆抗體)及形狀(如經(jīng)改變抗 體、經(jīng)縮減抗體、經(jīng)修飾抗體)。本發(fā)明所用抗GRP78抗體優(yōu)選與GRP78特異性結(jié)合。且本發(fā)明所用抗GRP78抗體 優(yōu)選為單克隆抗體。已知GRP78位于如癌細胞的細胞膜上。本發(fā)明所用抗GRP78抗體的優(yōu)選實施方式 之一可為例如，識別GRP78位于細胞膜上時暴露于細胞外的區(qū)域的抗體。例如，可通過用GRP78蛋白(SEQ ID NO 2)作為免疫原來制備抗體，并從制備出的抗體中篩選可與在細胞膜上表達GRP78的癌細胞(例如前列腺癌細胞株DU145等)結(jié)合的 抗體，從而得到所述抗體。更具體而言，可通過實施例中記載的方法得到識別GRP78位于細 胞膜上時暴露于細胞外的區(qū)域的抗體。本發(fā)明中所述GRP78位于細胞膜上時暴露于細胞外的區(qū)域優(yōu)選是抗體與所述區(qū) 域結(jié)合時不模擬α 2巨球蛋白的增值促進作用的區(qū)域，尤其優(yōu)選GRP78的98號-115號氨 基酸之外的區(qū)域。優(yōu)選的GRP78位于細胞膜上時暴露于細胞外的區(qū)域為例如SEQ IDNO 2的氨基酸 序列的376號-415號氨基酸的區(qū)域(SEQ ID NO 3)。所以，識別GRP78位于細胞膜上時暴 露于細胞外的區(qū)域的抗體優(yōu)選為例如識別GRP78的376號-415號氨基酸的區(qū)域的抗體。對 識別GRP78的376號-415號氨基酸的區(qū)域的抗體無特定限制，可為例如識別384號-391 號氨基酸(即SEQ ID NO :3的9號-16號氨基酸)的抗體、識別392號-407號氨基酸(即 SEQ ID NO :3的17號-32號氨基酸)的抗體、識別400號-415號氨基酸(即SEQ ID NO 3的25號-40號氨基酸)的抗體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如實施例中記載 的方法)確認抗體是否識別目標(biāo)表位。本發(fā)明所用抗體的其它優(yōu)選實施方式為例如具有被細胞攝入活性的抗體。本發(fā)明 所述“具有被細胞攝入活性的抗體”指與位于細胞表面的GRP78結(jié)合時可被輸送至細胞內(nèi) (如細胞質(zhì)內(nèi)、小泡內(nèi)、其它小細胞器內(nèi))的抗體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法確認抗體是否具有被細胞攝入活性，例如可通 過使結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體與表達GRP78的細胞(例如前列腺癌細胞株DU145等) 接觸，并確認所述標(biāo)記物是否被攝入細胞內(nèi)的方法；使結(jié)合有傷細胞物質(zhì)的抗GRP78抗體 與表達GRP78的細胞接觸，并確認是否可誘導(dǎo)所述表達GRP78的細胞的細胞死亡的方法等 進行確認。更具體而言，可通過如實施例中記載的方法等確認抗體是否具有被細胞攝入活 性。本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗體可為例如識別GRP78位于細胞膜上時暴露于細胞外的 區(qū)域、且具有被細胞攝入活性的抗體?？赏ㄟ^首選根據(jù)上述方法篩選出識別GRP78位于細 胞膜上時暴露于細胞外的區(qū)域的抗體，隨后從篩選出的抗體中再篩選具有被細胞攝入活性 的抗體來得到所述抗體。本發(fā)明所用的優(yōu)選抗體可為例如下列(a)-(s)的抗體。(a)含具有下述⑶Rl-⑶R3的重鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 9所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 10所示氨基酸序列。(b)含具有下述⑶Rl-⑶R3的輕鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 11所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 13所示氨基酸序列。(c)含(a)的重鏈可變區(qū)和(b)的輕鏈可變區(qū)的抗體。(d)含具有下述⑶Rl-⑶R3的重鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 18所示氨基酸序列；
CDR2具有SEQ ID NO 19所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 20所示氨基酸序列。(e)含具有下述⑶Rl-⑶R3的輕鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 21所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 22所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 23所示氨基酸序列。(f)含(d)的重鏈可變區(qū)和(e)的輕鏈可變區(qū)的抗體。(g)含具有下述⑶Rl-⑶R3的重鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 61所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 62所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 63所示氨基酸序列。(h)含具有下述⑶Rl-⑶R3的輕鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 64所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 65所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 66所示氨基酸序列。(i)含(g)的重鏈可變區(qū)和(h)的輕鏈可變區(qū)的抗體。(j)含具有下述⑶Rl-⑶R3的重鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 71所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 72所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 73所示氨基酸序列。(k)含具有下述⑶Rl-⑶R3的輕鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 74所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 75所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 76所示氨基酸序列。(1)含(j)的重鏈可變區(qū)和(k)的輕鏈可變區(qū)的抗體。(m)含具有下述⑶Rl-⑶R3的重鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 81所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 82所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 83所示氨基酸序列。(η)含具有下述⑶Rl-⑶R3的輕鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 84所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 85所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 86所示氨基酸序列。(ο)含(m)的重鏈可變區(qū)和(η)的輕鏈可變區(qū)的抗體。(ρ)含具有下述⑶Rl-⑶R3的重鏈可變區(qū)的抗體，其中CDRl具有SEQ ID NO 91所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 92所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 93所示氨基酸序列。(q)含具有下述⑶Rl-⑶R3的輕鏈可變區(qū)的抗體，其中
CDRl具有SEQ ID NO 94所示氨基酸序列；CDR2具有SEQ ID NO 95所示氨基酸序列；CDR3具有SEQ ID NO 96所示氨基酸序列。(r)含(ρ)的重鏈可變區(qū)和(q)的輕鏈可變區(qū)的抗體。(s)識別與(a)-(r)中任一項的抗體識別的表位相同的表位的抗體?？赏ㄟ^例如下列方法得到與某抗體識別相同表位的抗體?？赏ㄟ^對相同表位的競爭結(jié)合來確認被檢抗體與某抗體共有表位?？赏ㄟ^例如競 爭阻斷測定法檢測抗體間的競爭。優(yōu)選的交叉阻斷測定法為例如競爭性ELISA測定法。具 體而言，在存在或不存在候選競爭抗體的情況下，對包被于微孔板的孔中的GRP78蛋白進 行預(yù)溫育，然后加入本發(fā)明的抗GRP78抗體。結(jié)合于孔中的GRP78蛋白的本發(fā)明的抗GRP78 抗體的量與和相同表位競爭結(jié)合的候選競爭抗體(被檢抗體)的結(jié)合能力間接相關(guān)。艮口， 隨著被檢抗體對同一表位的親和性增大，本發(fā)明的抗GRP78抗體與包被有GRP78蛋白的孔 的結(jié)合量就降低，而被檢抗體與包被有GRP78蛋白的孔的結(jié)合量就增加?？赏ㄟ^預(yù)先標(biāo)記抗體來易于測定與孔結(jié)合的抗體量。例如，可通過使用抗生物素 蛋白過氧化物酶綴合物及合適的底物來測定經(jīng)生物素標(biāo)記的抗體。特將利用了酶(如過氧 化物酶)標(biāo)記物的交叉阻斷測定法稱為競爭性ELISA測定法。可使用可進行檢測或測定的 其它標(biāo)記物標(biāo)記抗體。具體而言，公知發(fā)射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物。被檢抗體與本發(fā)明的抗GRP78抗體具有源于不同物種的恒定區(qū)時，也可由識別所 述抗體的恒定區(qū)的標(biāo)記抗體來測定結(jié)合于孔的抗體量。即便對于來源于同一物種的抗體， 只要當(dāng)類型不同時，即可由識別各類型的抗體來測定結(jié)合于孔的抗體量。相比在不存在候選競爭抗體的情況下進行的對照實驗得到的結(jié)合活性，只要候選 抗體可阻斷至少20%、優(yōu)選至少20-50%、更優(yōu)選至少50%的抗GRP78抗體的結(jié)合，則所述 候選競爭抗體實質(zhì)上是與本發(fā)明的抗GRP78抗體結(jié)合相同表位或可競爭結(jié)合相同表位的 抗體。本發(fā)明所用抗體的優(yōu)選實施方式之一為例如結(jié)合有傷細胞物質(zhì)的抗體。當(dāng)結(jié)合有 傷細胞物質(zhì)的抗體被攝入細胞內(nèi)時，可由所述傷細胞物質(zhì)誘導(dǎo)攝入所述抗體的細胞的殺傷 作用或細胞死亡。因此，結(jié)合有傷細胞物質(zhì)的抗體優(yōu)選還具有被細胞攝入活性。本發(fā)明的結(jié)合有傷細胞物質(zhì)的抗GRP78抗體的優(yōu)選實施方式可為例如對表達 GRP78的癌細胞(如DU145、22Rvl、MCF7)具有傷害活性或誘導(dǎo)細胞死亡的抗體。本發(fā)明所用傷細胞物質(zhì)只要是可誘導(dǎo)細胞殺傷作用或細胞死亡的物質(zhì)即可，可為 例如，毒素、放射性物質(zhì)、化學(xué)治療劑等。這些本發(fā)明的傷細胞物質(zhì)包括可轉(zhuǎn)化為具有體內(nèi) 活性的傷細胞物質(zhì)的藥物前體。所述藥物前體的活化可為酶轉(zhuǎn)化，也可為非酶轉(zhuǎn)化。本發(fā)明所述“毒素”指源于微生物、動物或植物的表現(xiàn)出細胞毒性的各種蛋白或多 肽。本發(fā)明所用毒素可為例如下列物質(zhì)。白喉毒素A鏈(Langone J. J.，et al. ,Methods in Enzymology，93，307-308，1983)、假單胞菌外毒素(Nature Medicine，2，350-353，1996)、 蓖麻毒素 A鏈(Fulton R. J. , et al. , J. Biol. Chem. ,261,5314-5319,1986 ；Sivam G.， et al. , Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；CumberA. J. et al. , J.Immunol. Methods,135, 15-24，1990 ；WawrzynczakE. J.，et al.，Cancer Res.，50，7519-7562，1990 ；Gheeite V.， etal.，J. Immunol. Methods，142，223-230，1991)、去糖基化蓖麻毒素 A 鏈(Thorpe P. Ε·，et al. , Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、相思豆毒素 A 鏈(ffawrzynczak E. J.，et al.， Br. J. Cancer,66,361—366,1992 ；ffawrzynczak Ε. J. ,et al. ,Cancer Res. ,50,7519—7562, 1990 ；Sivam G. , et al. , Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；Thorpe P. Ε. , et al. , Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、白樹毒素(Sivam G.，et al.，Cancer Res.，47，3169-3173， 1987 ；Cumber A.J. et al. , J. Immunol. Methods,135,15-24,1990 ；ffawrzynczak Ε. J., et al. , Cancer Res. ,50,7519-7562,1990 ；Bolognesi A. , et al. , Clin. exp. Immunol., 89,341-346，1992)、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP-s) (Bolognesi Α.，et al.，Clin. exp. 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Biochem. 176, 581-588,1988 ；Bolognesi Α. , et al.，Clin. exp. Immunol.，89，341—346，1992)。本發(fā)明所述“放射性物質(zhì)”指含放射性同位素的物質(zhì)。對放射性同位素?zé)o特定限 制，可使用任意放射性同位素，例如32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Re等。本發(fā)明所述“化學(xué)治療劑”指除所述毒素、放射性物質(zhì)之外的具有傷細胞活性的 物質(zhì)，包括細胞因子、抗腫瘤劑、酶等。對本發(fā)明所用化學(xué)治療劑無特定限制，優(yōu)選低分子 量的化學(xué)治療劑。分子量小，則認為與抗體結(jié)合后干擾抗體功能的可能性也低。本發(fā)明 的低分子量化學(xué)治療劑通常具有100-2000、優(yōu)選200-1000的分子量。在本發(fā)明中，雖無 特定限制，可使用例如下列化學(xué)治療劑。美法侖(Rowland G. F. , et al. , Nature 255， 487-488，1975)、順鉬(Hurwitz Ε. andHaimovich J. ,Method In Enzymology 178,369-375, 1986 ；SchechterB.，et al.，Int. J. Cancer 48，167-172，1991)、卡鉬(Ota, Y.，et al.， Asia-Oceania J. Obstet. Gynaecol. 19,449-457，1993)、絲裂霉素 C(Noguchi，Α.，et al.， Bioconjugate Chem. 3，132—137，1992)、阿霉素(多柔比星)(Shih, L. B.，et al.，Cancer Res. 514192-4198,1991 ；Zhu,Ζ.,et al. ,Cancer Immunol. Immumother 40，257-267，1995 ； Trail, P.Α., et al. , Science 261,212-215,1993 ；Zhu, Ζ. , et al. , Cancer Immunol. Immumother 40，257-267，1995 ；Kondo, Y.，et al.，Jpn. 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Biol. 65，483-493，1987)、長春新堿(Johnson J. R. , et al. , Br. J. Cancer 42，17， 1980)、長春地辛(Johnson J. R. , et al. ,Br. J. Cancer 44，472-475，1981)、白細胞介素2 (I L-2)、腫瘤壞死因子α (TNFa)、干擾素(INF)、羧肽酶、堿性磷酸酶、β-內(nèi)酰胺酶、胞苷脫 氨酶。在本發(fā)明中可使用一種傷細胞物質(zhì)，也可將兩種或多種傷細胞物質(zhì)組合使用?？笹RP78抗體與所述傷細胞物質(zhì)的結(jié)合可為共價結(jié)合，也可為非共價結(jié)合。本領(lǐng) 域公知制備結(jié)合有這些傷細胞物質(zhì)的抗體的方法?？蓪⒖笹RP78抗體與傷細胞物質(zhì)通過它們自身具有的連接基團直接連接，也可通 過接頭或中間支持物等其它物質(zhì)間接連接?？芍苯咏Y(jié)合抗GRP78抗體與傷細胞物質(zhì)的連接 基團可為例如使用SH基的二硫鍵。具體而言，用還原劑(如二硫蘇糖醇等)還原抗體Fc區(qū) 域的分子內(nèi)二硫鍵，且同樣還原傷細胞物質(zhì)內(nèi)的二硫鍵，然后將二者用二硫鍵結(jié)合?？稍诮Y(jié) 合前用活化劑(如埃爾曼試劑)活化抗體或傷細胞物質(zhì)中的任一方，從而促進兩者二硫鍵 的形成。其它直接結(jié)合抗GRP78抗體與傷細胞物質(zhì)的方法有例如使用希夫堿的方法、碳二 亞胺法、活化酯法(N-羥基琥珀酰亞胺法)、使用混和酸酐的方法、利用重氮反應(yīng)的方法等?？笹RP78抗體與傷細胞物質(zhì)也可通過其它物質(zhì)間接結(jié)合。對可用于間接結(jié)合的 其它物質(zhì)無特定限制，可為例如具有2個或多個氨基、羧基、巰基等中的任一種或者兩種或 多種的組合的化合物、具有肽接頭、能結(jié)合抗GRP78抗體的化合物等。所述具有2個或多 個氨基、羧基、巰基等中的任一種或者兩種或多種的組合的化合物可為例如，N-琥珀酰亞 胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP) (ffawrzynczak E. J.，et al.，Cancer Res.，50， 7519-7562,1990 ；Thorpe P. Ε. , et al. , Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；、琥珀酰亞胺 基-6-3-[2-吡啶二硫基]_ 丙酰胺)己酸酯(LC-SPDP) (Hermanson G. T.，B10C0NJUGATE Techniques, 230-232,1996)、硫代琥珀酰亞胺基-6_3-[2_吡啶二硫基]_丙酰胺)己酸酯 (Sulfo-LC-SPDP) (HermansonG. T.，B10C0NJUGATE Techniques，230-232，1996)、N-琥拍酰 亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯(SPDB) (ffawrzynczak Ε. J. , et al. ,Br. J. Cancer, 66, 361-366，1992)、琥珀酰亞胺基 oxycarbonyl-α-(2-吡啶二硫基)甲苯(Thorpe P. Ε. , et al. , Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、琥珀酰亞胺基 _6_ ( α -甲基-[2-吡啶二硫基]甲 苯酰胺)-己酸酯(LC-SMPT) (Hermanson G. Τ. , BI0C0NJUGATE Techniques，232-235，1996)、 硫代琥珀酰亞胺基-6_( α-甲基-[2-吡啶二硫基]甲苯酰胺)_己酸酯(Sulf0-LC-SMPT) (Hermanson G. T.，BIOCONJUGATETechniques，232-235，1996)、琥珀酰亞胺基 ~4~ (ρ-馬來 酰亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB) (Hermanson G. Τ. , BI0C0NJUGATE Techniques，242-243， 1996)、硫代琥珀酰亞胺基-4-(ρ-馬來酰亞胺基苯基)_ 丁酸酯(Sulfo-SMPB) (HermansonG. T.，BIOCONJUGATE Techniques，242-243，1996)、m_ 馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基 琥珀酰亞胺基酯(MBS) (Hermanson G. T.，BIOCONJUGATE Techniques, 237-238，1996)、 m-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基硫代琥珀酰亞胺基酯(Sulfo-MBS) (Hermanson G. T.， BIOCONJUGATE Techniques，237-238，1996)、S-乙酰基巰基琥珀酸酐(SAMSA) (Casellas P.，et al.，Eur. J.Biochem，176，581-588，1988)、二甲基-3，3-二硫代雙丙二酰亞胺酯 (prorionimidate)(DTBP)(Casellas P. ， et al. ， Eur. J. Biochem,176,581-588,1988)、 2_亞胺基硫烷(2-iminotiolane) (ThorpeP. Ε. , et al. , Cancer Res.，47，5924—5931，1987)寸。其它用于結(jié)合抗GRP78抗體與傷細胞物質(zhì)的物質(zhì)為例如肽、抗體、聚L-谷氨酸 (PGA)、羧甲基右旋糖苷、右旋糖苷、氨基右旋糖苷、抗生物素蛋白_生物素、順烏頭酸、谷氨 酸二酰胼、人血清白蛋白(HSA)等。還可通過基因工程方法將蛋白類傷細胞物質(zhì)與抗體結(jié)合。具體而言，可將例如編 碼所述傷細胞肽的DNA與編碼抗GRP78抗體的DNA框內(nèi)融合，并整合入表達載體內(nèi)，從而構(gòu) 建重組載體?？赏ㄟ^培養(yǎng)將所述載體導(dǎo)入合適的宿主細胞內(nèi)而得到的轉(zhuǎn)化細胞，并表達重 組DNA，從而得到結(jié)合了毒性肽的抗GRP78抗體的融合蛋白。得到抗體的融合蛋白時，一般 在抗體的C端設(shè)置蛋白類藥劑或毒素。也可通過肽接頭連接抗體與蛋白類藥劑或毒素?？筛鶕?jù)公知方法得到本發(fā)明的抗GRP78單克隆抗體。本發(fā)明的抗GRP78抗體尤其 優(yōu)選為源于哺乳動物的單克隆抗體。源于哺乳動物的單克隆抗體包括由雜交瘤產(chǎn)生的單 克隆抗體，及由經(jīng)通過基因工程方法含抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的單克隆抗體寸?？墒褂霉夹g(shù)(例如，如下)制備產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。首先將GRP78蛋 白用作致敏抗原，根據(jù)常規(guī)免疫方法進行免疫。將獲自免疫動物的免疫細胞根據(jù)常規(guī)細胞 融合方法融合于公知的親代細胞，從而得到雜交瘤。再根據(jù)常規(guī)篩選方法從所述雜交瘤篩 選出產(chǎn)生目的抗體的細胞，從而篩選出產(chǎn)生抗GRP78抗體的雜交瘤。具體而言，可如下制備單克隆抗體。首先，可通過表達GRP78基因來得到用作得到 抗體的致敏抗原的GRP78蛋白(SEQ ID NO :2)。已知人GRP78基因的堿基序列(SEQ ID NO 1)。即可通過將編碼GRP78的基因序列插入公知的表達載體并轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞后，通 過公知方法從所述宿主細胞或培養(yǎng)上清中純化目的人GRP78蛋白。也可同樣使用經(jīng)純化的 天然GRP78蛋白?？赏ㄟ^組合或單獨使用單次或多次多個常規(guī)層析法(如離子層析法或親 和層析法等)進行生成。如本發(fā)明所用，還可將把GRP78蛋白的期望部分多肽與不同多肽融 合而成的融合蛋白用作免疫原?？衫美缈贵w的Fc片段或肽標(biāo)簽等制備用作免疫原的 融合蛋白?？赏ㄟ^將編碼期望的兩種或多種多肽片段的基因框內(nèi)融合，并將所述融合基因 插入如上所述的表達載體中，從而制備表達融合蛋白的載體。融合蛋白的制備方法記載于 Molecular Cloning2nd ed. (Sambrook, J. et al. ,Molecular Cloning 2nd ed. ,9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. Press,1989)。可將如述純化的GRP78蛋白用作對哺乳動物進行免疫的致敏抗原。也可將GRP78 的部分肽用作致敏抗原。例如，可將下列肽用作致敏抗原根據(jù)人GRP78的氨基酸序列化學(xué)合成得到的肽；通過將人GRP78基因的一部分整合入表達載體而進行表達得到的肽；
通過將人GRP78蛋白用蛋白分解酶分解得到的肽。對GRP78的用作部分肽的區(qū)域及其大小無特定限制。優(yōu)選區(qū)域可選自GRP78的 376號-415號氨基酸的區(qū)域(SEQ ID NO 3)。構(gòu)成致敏抗原的肽的氨基酸數(shù)優(yōu)選至少為3 或更多(例如5或更多，或者6或更多)。更具體而言，可將8-50個殘基、優(yōu)選10-30個殘 基的肽用作致敏抗原。對用所述致敏抗原進行免疫的哺乳動物無特定限制。為根據(jù)細胞融合法得到單克 隆抗體，優(yōu)選在選擇免疫動物時考慮其與用于細胞融合的親代細胞的適合性。一般優(yōu)選將 嚙齒動物用作免疫動物。具體而言，可將小鼠、大鼠、倉鼠或兔用作免疫動物。另外，也可將 猴用作免疫動物。可根據(jù)公知方法使用致敏抗原對所述動物進行免疫。例如，可通過常規(guī)方法一腹 腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原來對哺乳動物進行免疫。具體而言，可從第4天-第21天每日給 哺乳動物施用數(shù)次所述致敏抗原?？蓪⒅旅艨乖肞BS(磷酸緩沖鹽水)或生理鹽水等以 適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)進行稀釋后用于免疫。也可將致敏抗原與佐劑共施用。例如可與弗氏完全 佐劑混和、乳化后用作致敏抗原。還可在用致敏抗原進行免疫時使用合適的支持物。尤其 當(dāng)將分子量小的部分肽用作致敏抗原時，優(yōu)選將致敏抗原肽與白蛋白、匙孔血藍蛋白等支 持物蛋白結(jié)合后進行免疫。如述免疫哺乳動物，并確認血清中期望抗體的量升高后，從哺乳動物收集免疫細 胞，并用于細胞融合。尤其將脾細胞用作優(yōu)選的免疫細胞?？蓪⒉溉閯游锏墓撬枇黾毎米骺膳c所述免疫細胞融合的細胞。骨髓瘤細胞優(yōu) 選具有用于篩選的合適的篩選標(biāo)記。篩選標(biāo)記指可在特定培養(yǎng)條件下存活(或不能存活) 的性狀。已知的篩選標(biāo)記有次黃嘌呤_鳥嘌呤_磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷(以下簡稱HGPRT缺 陷)、或胸苷激酶缺陷(以下簡稱TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的細胞具有次黃嘌 呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱HAT感受性)。HAT感受細胞由于不能在HAT 選擇培養(yǎng)基中進行DNA合成而死亡，但可在與正常細胞融合后利用正常細胞的補救途徑繼 續(xù)DNA合成，從而可在HAT選擇培養(yǎng)基中增殖?？稍诤?-硫鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤(以下簡稱8AG)、或5’溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基 中篩選HGPRT缺陷型或TK缺陷型細胞。由于正常細胞會將這些嘧啶類似物摻入DNA中 而死亡，但具有這些酶缺陷的細胞由于不摻入這些嘧啶類似物，從而可在選擇培養(yǎng)基中存 活。另外，被稱為G418抗性的篩選標(biāo)記被新霉素抗性基因賦予了對2-脫氧鏈霉胺系抗生 素(慶大霉素類似物)的抗性。已知適于進行細胞融合的各種骨髓瘤細胞。例如可利用 P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123，1548-1550)、P3x63Ag8U. 1 (Current Topicsin Microbiologyand Immunology (1978)81,1-7) > NS-I(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)6，511-519)、MPC-11 (Margulies. D. H. et al.，Cell(1976)8，405-415)、 SP2/0(ShuIman, M. et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO (de St. Groth，S.F.et al.， J. Immunol. Methods (1980) 35，卜21)、S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323), R210 (Galfre, G. et al.，Nature (1979) 277，131-133)等骨髓瘤細胞。可根據(jù)公知方法(例如Kohler&Milstein 法等)(Kohler. G. andMilstein，C.， Methods Enzymo 1. (1981)73,3-46)進行所述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。更具體而言，可在促細胞融合劑的存在下，在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行所述細胞的融合?？墒褂美缇垡叶?PEG)、仙臺病毒(HVJ)等促融合劑。還可根據(jù)需要加入可進一 步提高融合效率的二甲基亞砜等輔助劑。可任意設(shè)定免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例。例如使免疫細胞優(yōu)選為骨髓瘤細 胞的1-10倍?？蓪⒗邕m于增殖所述骨髓瘤細胞株的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液及其 它用于培養(yǎng)這種細胞的常規(guī)培養(yǎng)液用作用于進行所述細胞融合的培養(yǎng)液。還可向培養(yǎng)液中 加入胎牛血清(FCS)等血清補充液?？赏ㄟ^將預(yù)定量的所述免疫細胞和骨髓瘤細胞均勻混合于所述培養(yǎng)液中，再混和 預(yù)熱至約37°C的PEG溶液來進行細胞融合，從而形成目的融合細胞(雜交瘤)。細胞融合 中，通常可加入30-60% (w/v)濃度的平均分子量為約1000-6000的PEG。隨后逐次加入所 述合適的培養(yǎng)液，并通過重復(fù)離心除去上清的操作來除去不利于雜交瘤生長的細胞融合劑寸。可通過利用相應(yīng)于細胞融合中使用的骨髓瘤具有的篩選標(biāo)記的選擇培養(yǎng)液篩選 如述得到的雜交瘤。例如，可通過在HAT培養(yǎng)液(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng) 液)中進行培養(yǎng)來篩選HGPRT或TK缺陷型細胞。即，將HAT感受性骨髓瘤細胞用于細胞融 合時，可使成功與正常細胞融合的細胞在HAT培養(yǎng)液中選擇性增殖。盡管目的雜交瘤之外 的細胞(非融合細胞)在死亡，但也有充分的時間利用所述HAT培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。具體而 言，一般可通過數(shù)日-數(shù)周的培養(yǎng)來篩選目的雜交瘤。隨后，可通過進行常規(guī)的有限稀釋來 對產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤進行篩選及單克隆?；蚩筛鶕?jù)國際公開W003/104453中記載的方 法制備識別GRP78的抗體。可使用公知的基于抗原抗體反應(yīng)的篩選方法適宜篩選并單克隆目的抗體。例如， 向由聚苯乙烯等構(gòu)成的珠或市售的96孔微孔板等支持物結(jié)合抗原，并使與雜交瘤的培養(yǎng) 上清進行反應(yīng)。隨即洗滌支持物后使與經(jīng)酶標(biāo)記的第二抗體進行反應(yīng)。如果培養(yǎng)上清中含 與致敏抗原反應(yīng)的抗體，則第二抗體將通過所述抗體與支持物結(jié)合。最后可通過檢測結(jié)合 于支持物上的第二抗體來確定培養(yǎng)上清中是否存在目的抗體。通過有限稀釋法克隆產(chǎn)生具 有針對抗原的結(jié)合能力的期望抗體的雜交瘤成為可能。此時可使用諸如用于免疫的抗原， 適用實施上相同的GRP78蛋白。另外，除通過向人以外的動物免疫抗原的所述得到雜交瘤的方法之外，也可通過 抗原致敏淋巴細胞來得到目的抗體。具體而言，首先用GRP78蛋白體外致敏人淋巴細胞。 接下來，將免疫致敏的淋巴細胞與合適的融合偶體融合。可將例如源于人的具有永久分裂 能力的骨髓瘤細胞作為融合偶體(參照特公平1-59878號公報)。通過所述方法得到的抗 GRP78抗體是具有與GRP78蛋白的結(jié)合活性的人抗體。再通過向具有全套人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物施用作為抗原的GRP78蛋白而得到 抗GRP78人抗體。可通過與合適的偶體的細胞融合或用Epstein-Bar病毒感染等處理使經(jīng) 免疫動物的抗體產(chǎn)生細胞永生化?？蓮娜缡龅玫降挠郎毎蟹蛛x針對GRP78蛋白的人抗 體(參照國際公開 W094/25585、W093/12227、W092/03918、W094/02602)?？赏ㄟ^進一步克 隆經(jīng)永生化的細胞來克隆產(chǎn)生具有目的反應(yīng)特異性的抗體的細胞。將轉(zhuǎn)基因動物作為免疫 動物時，所述動物的免疫系統(tǒng)將人GRP78識別為異物。所以容易得到針對人GRP78的人抗 體。可將如述制得的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤在常規(guī)培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)。另外，也可將所 述雜交瘤長期保存于液氮中。
可根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)所述雜交瘤，并從所述培養(yǎng)上清中得到目的單克隆抗體?；?可通過將雜交瘤施用于與之合適的哺乳動物中并增殖，從而從其腹水中得到單克隆抗體。 前者的方法適于得到高純度的抗體。本發(fā)明中也可利用從產(chǎn)生抗體的細胞中克隆的抗體基因編碼的抗體。可通過 將克隆的抗體基因整合入合適的載體上后導(dǎo)入宿主來表達抗體。用于分離抗體基因、導(dǎo) 入載體及轉(zhuǎn)化宿主的方法已被建立(參照例如Vandamme，Α. Μ. et al.，Eur. J. Biochem. (1990)192,767-775)。例如，可從產(chǎn)生抗GRP78抗體的雜交瘤細胞得到編碼抗GRP78抗體的可變區(qū)(V 區(qū))的cDNA。為此，首先從雜交瘤提取總RNA。從細胞提取mRNA的方法可使用例如胍超速離 心法(Chirgwin,J. Μ. et al.，Biochemistry (1979) 18，5294-5299)、AGPC 法(Chomczynski, P. et al.，Anal. Biochem. (1987) 162. 156-159)等?？墒褂萌鏼RNA純化試劑盒(GE Healthcare Bioscience制)純化提取的mRNA。 也有市售的可從細胞直接提取總mRNA的試劑盒，如QuickPr印mRNA純化試劑盒(GE Healthcare Bioscience制)。也可使用如述試劑盒從雜交瘤得到總mRNA?？墒褂梅崔D(zhuǎn)錄酶 由所得mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA?？墒褂肁MV反轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(生 物化學(xué)工業(yè)公司制)等合成cDNA?？赏ㄟ^使用5，-Ampli FINDERRACE試劑盒(Clontech 制)和 PCR 的 5，-RACE 法合成 cDNA 并進行擴增(Frohman，M. A. et al.，Proc Natl. Acad. Sci. USA(1988)85,8998-9002, Belyavsky, A. et al.，Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919-2932)。還可在如述合成cDNA的過程中在cDNA的兩端導(dǎo)入下述合適的限制性酶切位 點ο從所得PCR產(chǎn)物純化目的cDNA片段，隨后連接到載體DNA上。如述制備重組載體， 將其導(dǎo)入如大腸桿菌，并在篩選集落后，從形成集落的大腸桿菌制備出期望的重組載體?？?使用公知方法(如雙脫氧核苷酸鏈終止法等)確認所述重組載體是否含有目的cDNA堿基 序列?？赏ㄟ^使用用于擴增可變區(qū)基因的引物的PCR得到編碼可變區(qū)的基因。首先將提 取出的mRNA作為模板合成cDNA，得到cDNA文庫。合成cDNA文庫的話，使用市售的試劑盒 較為方便。實際上從少數(shù)細胞得到的mRNA極少，將其直接純化則產(chǎn)率低。所以通常在加入 已知不含抗體基因的載體RNA后進行純化?；虍?dāng)可提取一定量的RNA時，可有效提取出產(chǎn) 生抗體的細胞的RNA。當(dāng)從例如> 10、或> 30、優(yōu)選> 50的產(chǎn)生抗體的細胞提取RNA時，可 不必加入載體RNA。可以所得cDNA文庫作為模板，通過PCR法擴增抗體基因。已知用于通過PCR法擴 增抗體基因的引物?？筛鶕?jù)文獻如J. Mol. Biol. (1991)222,581-597等的公開設(shè)計用于擴 增人抗體基因的引物。這些引物由不同于免疫球蛋白亞類的堿基序列構(gòu)成。所以在將不明 亞類的cDNA文庫作為模板時，要在考慮到所有可能性的情況下進行PCR。具體而言，在要得到例如編碼人IgG的基因時，可利用可擴增編碼重鏈Y I-Y 5、 輕鏈κ鏈和λ鏈的基因的引物。為擴增I gG可變區(qū)基因，一般可將與相當(dāng)于鉸鏈區(qū)的部 分復(fù)性的引物用作3’側(cè)的引物。而可將對應(yīng)于各亞類的引物用作5’側(cè)的引物。將由用于擴增重鏈和輕鏈的各亞類的基因的引物得到的PCR產(chǎn)物作為各自獨立 的文庫?？衫萌缡龊铣傻奈膸熘貥?gòu)由重鏈和輕鏈組合而成的免疫球蛋白?？梢灾貥?gòu)而成的免疫球蛋白與GRP78的結(jié)合活性作為指標(biāo)篩選目的抗體。本發(fā)明的抗體與GRP78的結(jié)合優(yōu)選具有特異性。可通過例如如下步驟篩選與 GRP78結(jié)合的抗體。(1)使含由獲自雜交瘤的cDNA編碼的V區(qū)的抗體與GRP78接觸；(2)檢測GRP78與抗體的結(jié)合；及(3)篩選與GRP78結(jié)合的抗體。已知檢測抗體與GRP78的結(jié)合的方法。具體而言，使被檢抗體與固定于支持物上 的GRP78反應(yīng)，再使識別抗體的標(biāo)記抗體與所述被檢抗體反應(yīng)。如果可從經(jīng)洗滌后的支持 物上檢測到標(biāo)記抗體，則證明所述被檢抗體與GRP78結(jié)合?？蓪⑦^氧化物酶或半乳糖 苷酶等具有酶活性的蛋白或者FITC等熒光物質(zhì)用作標(biāo)記物。也可利用表達GRP78的細胞 的固定標(biāo)本評價抗體的結(jié)合活性。也可將利用噬菌體載體的淘選法用作以結(jié)合活性為指標(biāo)的抗體篩選法。當(dāng)如上所 述將抗體基因作為重鏈和輕鏈的亞類的文庫得到時，利用噬菌體載體的篩選方法較有利。 可將編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因通過合適的配體序列連接成單鏈Fv(SCFV)?？赏ㄟ^將 編碼scFv的基因插入噬菌體載體得到在表面表達scFv的噬菌體。將此噬菌體與目的抗原 接觸，并回收與抗原結(jié)合的噬菌體，即可回收編碼具有目的活性的scFv的DNA。可根據(jù)需要 重復(fù)此操作來濃縮具有目的結(jié)合活性的scFv。本發(fā)明所述編碼抗體的多核苷酸可編碼抗體全長，也可編碼抗體的一部分?？贵w 的一部分指抗體分子的任意部分。以下也將抗體的一部分稱為抗體片段。本發(fā)明的優(yōu)選 的抗體片段含抗體互補決定區(qū)(CDR)。本發(fā)明的抗體片段更優(yōu)選含全部構(gòu)成可變區(qū)的3個 CDR。得到編碼目的抗GRP78抗體的V區(qū)的cDNA后，用識別插入到所述cDNA兩端的限制 性酶切位點的限制性內(nèi)切酶消化所述cDNA。優(yōu)選的限制性內(nèi)切酶識別出現(xiàn)在構(gòu)成抗體基因 的堿基序列上的可能性低的堿基序列，并消化。又為將1個拷貝的消化片段以正確的方向 插入載體內(nèi)，優(yōu)選提供附著末端的限制性內(nèi)切酶。可通過將經(jīng)如上所述消化的編碼抗GRP78 抗體的V區(qū)的cDNA插入到合適的表達載體上而得到抗體表達載體。此時，可通過將編碼抗 體恒定區(qū)(C區(qū))的基因與所述編碼V區(qū)的基因框內(nèi)融合來得到嵌合抗體。本文所述嵌合 抗體指恒定區(qū)與可變區(qū)源自不同的生物。所以，不僅是如小鼠_人異種嵌合抗體，人-人同 種嵌合抗體也屬本發(fā)明的嵌合抗體。也可通過預(yù)先向具有恒定區(qū)的表達載體內(nèi)插入所述V 區(qū)基因來構(gòu)建表達嵌合抗體的載體。具體而言，例如可將編碼期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA插入表達載體的5’側(cè)， 并設(shè)置消化所述V區(qū)基因的限制性內(nèi)切酶的限制性內(nèi)切酶識別序列?？赏ㄟ^將兩者用相同 組合的限制性內(nèi)切酶消化，并進行框內(nèi)融合來構(gòu)建表達嵌合抗體的載體。為制備本發(fā)明的抗GRP78抗體，可將抗體基因在受表達調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達的形 式整合入表達載體。用于表達抗體的表達調(diào)控區(qū)包括例如增強子或啟動子。然后可通過將 所述表達載體轉(zhuǎn)化到合適的宿主細胞來得到表達編碼抗GRP78抗體的DNA的重組細胞。對于抗體基因的表達，可將編碼抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA整合入各 自不同的表達載體上?？赏ㄟ^將整合了 H鏈和L鏈的載體共轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)來表達具有 H鏈和L鏈的抗體分子。也可將編碼H鏈和L鏈的DNA整合入單個表達載體內(nèi)而轉(zhuǎn)化宿主細胞(參照國際公開W094/11523)。已知用于將分離的抗體基因?qū)牒线m的宿主來制備抗體的宿主和表達載體的組 合。可將這些表達系統(tǒng)中的任一種應(yīng)用于本發(fā)明。如果使用真核細胞作為宿主，可使用動 物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體而言，可用于本發(fā)明的動物細胞為例如哺乳動物細胞 (CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela、Vero等)、兩棲動物細胞(非洲爪蟾卵母細胞 等)、昆蟲細胞(sf9、sf21、Tn5等)。已知源于植物細胞，如煙草屬(Nicotiana)(如煙草(Nicotianatabacum)等)的 細胞的抗體基因表達系統(tǒng)。植物細胞的轉(zhuǎn)化可利用經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)的細胞。還可使用真菌細胞，如酵母菌屬(Saccharomyces)(如酵母(Saccharomyces serevisiae))、畢赤酵母屬(Pichia)(如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、曲霉菌屬 (Aspergillus)(如黑曲霉(Aspergillus niger))等。也已知利用原核生物的抗體基因表達系統(tǒng)。例如，當(dāng)使用細菌細胞時，可將諸如大 腸桿菌(E. coli)、枯草芽孢桿菌等細菌細胞用于本發(fā)明。使用哺乳動物時，可構(gòu)建將常用的有用的啟動子、待表達的抗體基因、其3’側(cè)下游 的多聚A信號功能性連接的表達載體。例如啟動子/增強子可例舉人巨細胞病毒立即早期 啟動子/增強子。另外其它用于本發(fā)明的抗體表達的啟動子/增強子為例如病毒啟動子/增強子、 或人延伸因子la (HEFla)等源于哺乳動物細胞的啟動子/增強子?？衫脝幼?增強 子的病毒具體有例如反轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。使用SV40啟動子/增強子時，可利用Mulligan等的方法(Nature (1979) 277， 108)。另外，可根據(jù) Mizushima 等的方法(Nucleic AcidsRes. (1990) 18,5322)容易將 HEFla啟動子/增強子用于目的基因的表達。使用大腸桿菌時，可通過將常用的有用的啟動子、用于分泌抗體的信號序列及待 表達的抗體基因功能性連接來表達所述基因。啟動子有例如IacZ啟動子、araB啟動子。 使用 IacZ 啟動子時可利用 Ward 等的方法(Nature (1989) 341，544-546 ；FASEBJ. (1992)6， 2422-2427)。也可根據(jù) Better 等的方法(Science (1988) 240，1041-1043)將 araB 啟動子 用于表達目的基因。當(dāng)在大腸桿菌的胞質(zhì)中產(chǎn)生時，可將pelB信號序列(Lei，S. P. et al.， J. Bacteriol. (1987) 169,4379)用作分泌抗體的信號序列。在分離出產(chǎn)生于胞質(zhì)中的抗體 后，使用蛋白質(zhì)變性劑(如胍的鹽酸鹽)將抗體重折疊(refold)成具有期望的結(jié)合活性的 形式。插入到表達載體的復(fù)制原點可源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV) 等。為增加宿主細胞中基因的拷貝數(shù)，還可向表達載體中插入篩選標(biāo)記。具體而言，可使用 如氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移 酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等篩選標(biāo)記。可通過將這些表達載體導(dǎo)入宿主細胞，并體外或體內(nèi)培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞來產(chǎn) 生目的抗體?？筛鶕?jù)公知方法培養(yǎng)宿主細胞。例如，可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作 為培養(yǎng)液，還可聯(lián)用胎牛血清(FCS)等血清補充液?？赏ㄟ^單獨使用或適宜組合使用公知的常規(guī)蛋白純化方法純化如上所述表達、產(chǎn)生的抗體。例如，可適宜選擇、組合親和柱(如蛋白A柱)、層析柱、過濾、超濾、鹽析、透析等 分離、純化抗體(AntibodiesA Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。另外，除上述宿主細胞外，也可將轉(zhuǎn)基因動物用于產(chǎn)生重組抗體。即可從導(dǎo)入了 編碼目的抗體的基因的動物得到所述抗體。例如，可通過將抗體基因框內(nèi)插入編碼在乳液 中固有產(chǎn)生的蛋白的基因內(nèi)來構(gòu)建融合基因。可利用例如山羊β酪蛋白等分泌到乳汁中 的蛋白?？蓪⒑迦肓丝贵w基因的融合基因的DNA片段注入山羊胚中，并將所述經(jīng)注入的 胚導(dǎo)入雌性山羊?？蓮挠山邮芩雠叩纳窖蛏龅霓D(zhuǎn)基因山羊(或其后代)產(chǎn)生的乳汁 中得到期望抗體與乳汁蛋白的融合蛋白。為增加轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含期望抗體的乳汁的 量，可對所述轉(zhuǎn)基因山羊適宜使用激素(Ebert, K.M. et al.，Bio/Technology (1994) 12， 699-702)?？蓪⒃从趧游锟贵w的C區(qū)用作本發(fā)明的重組抗體的C區(qū)。例如，可使用小鼠抗 體 H鏈 C 區(qū)的 Cy 1、C γ 2a、C γ 2b、C γ 3、Cy , C δ , C α U C α 2, C ε，L鏈C 區(qū)的 Ck、(入。 也可使用小鼠抗體之外的動物抗體，如大鼠、兔、山羊、羊、駱駝、猴等的動物抗體。已知這些 抗體的序列。另外，為改善抗體或其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，可對C區(qū)進行修飾。根據(jù)本發(fā)明將抗體 施用于人時，可通過人為改變基因重組型抗體來降低針對人的異種抗原性等?；蛑亟M型 抗體包括例如嵌合(Chimeric)抗體、人化(Humanized)抗體?？筛鶕?jù)公知方法制備這些經(jīng)改變的抗體。嵌合抗體指將不同來源的可變區(qū)與恒定 區(qū)連接而成的抗體。例如，由小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)與人抗體的重鏈、輕鏈的恒定 區(qū)構(gòu)成的抗體是小鼠-人_異種嵌合抗體?？赏ㄟ^將編碼小鼠抗體的可變區(qū)的DNA與編 碼人抗體的恒定區(qū)的DNA連接，并將其整合入表達載體來制備表達嵌合抗體的重組載體。 培養(yǎng)經(jīng)所述載體轉(zhuǎn)化的重組細胞，并表達整合的DNA來得到培養(yǎng)過程中生產(chǎn)出的所述嵌合 抗體?？稍谇逗峡贵w和人化抗體的C區(qū)使用人抗體的C區(qū)。例如，可將Cy 1、C γ 2、C γ 3、 CY4、Cy、CS、Cal、Ca2禾口 Ce用作H鏈的C區(qū)。還可Mf C κ禾口 C λ用作L鏈的C區(qū)。 已知這些C區(qū)的氨基酸序列，及編碼它們的堿基序列。另外，為改善抗體本身、或產(chǎn)生抗體 的安全性，可對人抗體的C區(qū)進行修飾。嵌合抗體一般由源于人以外的動物的抗體V區(qū)與源于人抗體的C區(qū)構(gòu)成。與此相 比，人化抗體則由源于人以外的動物的抗體互補決定區(qū)(CDR)與源于人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR) 及源于人抗體的C區(qū)構(gòu)成。人化抗體由于對人體內(nèi)的抗原性低，因此可用作本發(fā)明的治療 劑的有效成分。抗體可變區(qū)通常由4個構(gòu)架區(qū)(FR)間隔的3個互補決定區(qū)(OTR)構(gòu)成。⑶R是實 質(zhì)上決定抗體特異性的區(qū)域。CDR的氨基酸序列具有多樣性。而構(gòu)成FR的氨基酸序列，則 即便是在具有不同結(jié)合特異性的抗體之間，也呈高度相同性。因此，一般情況下，不會由于 CDR的移植，而降一種抗體的結(jié)合特異性移植給其它抗體。也將人化抗體稱為重構(gòu)(reshaped)抗體。具體而言，已知將人以外的動物(例如 小鼠)的抗體CDR移植于人抗體的人化抗體等。已知用于得到人化抗體的一般的基因重組方法。具體而言，作為將小鼠抗體的⑶R移植到人FR上的方法，已知例如過表達PCR。在 過表達PCR中，向用于合成人抗體的FR的引物附加編碼待移植小鼠抗體CDR的堿基序列。 針對4個FR中的每個使用引物。將小鼠CDR移植于人FR時，一般選擇與小鼠FR具有高度相同性的人FR，使與保持CDR的功能無關(guān)。即，一般優(yōu)選利用由與鄰接于待移植小鼠CDR的 FR的氨基酸序列具有高度相同性的氨基酸序列構(gòu)成的人FR。另外，以相互框內(nèi)連接的形式設(shè)計待連接的堿基序列。由各引物各自合成人FR。 結(jié)果得到在各FR附加了編碼小鼠CDR的DNA的產(chǎn)物。可以相互重疊的形式設(shè)計編碼各產(chǎn) 物的小鼠CDR的堿基序列。接下來，將以人抗體基因為模型合成的產(chǎn)物的重疊的CDR部分 相互復(fù)性而進行互補鏈合成反應(yīng)。由所述反應(yīng)使人FR通過小鼠CDR序列被連接起來。最后，由復(fù)性于連接了 3個⑶R與4個FR的V區(qū)基因的5’端和3’端的附加有合 適的限制性內(nèi)切酶識別序列的引物擴增所述基因的全長。通過將如述得到的DNA與編碼人 抗體C區(qū)的DNA以框內(nèi)融合的形式插入到表達載體中而制備出用于表達人型抗體的載體。 通過建立導(dǎo)入了所述整合載體的重組細胞后，培養(yǎng)所述重組細胞，并表達編碼所述人化抗 體的DNA來從所述培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生所述人化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、 國際公開W096/02576)?？赏ㄟ^定性或定量測定、評價如上所述制成的人化抗體與抗原的結(jié)合活性來適宜 篩選出通過CDR連接時使所述CDR形成良好的抗原結(jié)合位點的人抗體的FR。也可根據(jù)需要 取代FR的氨基酸殘基，以使重構(gòu)人抗體的CDR形成抗原結(jié)合位點。例如，可通過用于將小 鼠CDR移植于人FR的PCR法向FR導(dǎo)入氨基酸序列變異。具體而言，可向復(fù)性于FR的引物 中導(dǎo)入部分堿基序列的變異。通過所述引物合成的FR中導(dǎo)入有堿基序列的變異?？赏ㄟ^ 使用上述方法測定、評價有氨基酸取代的變異型抗體與抗原的結(jié)合活性來篩選出具有期望 性質(zhì)的變異 FR 序列(Sato, K. et al. , Cancer Res，1993，53，851-856)。也已知得到人抗體的方法。例如，用期望的抗原或表達期望的抗原的細胞體外致 敏淋巴細胞。然后，通過將經(jīng)致敏的淋巴細胞與人骨髓瘤細胞融合而得到具有抗原結(jié)合活 性的期望的人抗體(參照特公平1-59878)。融合配偶或人骨髓瘤細胞可為例如U266。另外，可通過用期望的抗原免疫具有全套人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物來得到期望 的人抗體(參照國際公開 W093/12227、國際公開 92/03918、W094/02602、W094/25585、 W096/34096、W096/33735)。也已知使用人抗體文庫通過淘選得到人抗體的技術(shù)。例如，可 通過噬菌體展示法將人抗體V區(qū)在噬菌體表面表達為單鏈抗體(scFv)，并篩選出與抗原結(jié) 合的噬菌體。可通過分析篩選出的噬菌體基因來確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體V區(qū)的DNA 序列。確定與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列后，可通過將所述V區(qū)序列與期望的人抗體C區(qū) 序列框內(nèi)融合，然后插入到合適的表達載體內(nèi)而制備出表達載體。可通過將所述表達載體 導(dǎo)入如上所述的合適的表達細胞中，并表達編碼所述人抗體的基因來得到所述人抗體。這 些方法已公知(國際公開 W092/01047、W092/20791、W093/06213、W093/11236、W093/19172、 W095/01438.W095/15388)。本發(fā)明的抗體只要可結(jié)合GRP78蛋白，不僅包括以IgG為代表的二價抗體，還包括 一家抗體或以IgM為代表的多價抗體。本發(fā)明的多價抗體包括具有全相同的抗原結(jié)合位點 的多價抗體，或者具有部分或全不同的抗原結(jié)合位點的多價抗體。本發(fā)明的抗體不局限于 抗體的全長分子，只要可結(jié)合GRP78蛋白，也可為抗體或其修飾物。經(jīng)縮減抗體包括缺失全長抗體(例如全長IgG)的一部分的抗體片段。只要能結(jié) 合GRP78抗原，就允許抗體分子有部分缺失。本發(fā)明的抗體片段優(yōu)選包括重鏈可變區(qū)(VH) 和輕鏈可變區(qū)(VL)中的任一個或兩個。VH或VL的氨基酸序列可包含取代、缺失、附加和/
24或插入。只要能結(jié)合GRP78抗原，可缺失VH和VL中的任一個或兩個中的一部分。還可將 可變區(qū)嵌合體化或人化?？贵w片段的具體例子可為例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。經(jīng)縮 減抗體的具體例子可為例如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv(單鏈Fv)、雙抗體(Diabody)、 sc (Fv) 2 (單鏈(Fv) 2)等。這些抗體的多體(例如二聚體、三聚體、四聚體、多聚體)也屬本 發(fā)明的經(jīng)縮減抗體?？赏ㄟ^用酶處理抗體而產(chǎn)生抗體片段來得到抗體的片段?？僧a(chǎn)生抗體片段的 酶已知例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纖溶酶等。也可構(gòu)建編碼這些抗體的基因，將其導(dǎo) 入表達載體中后，在合適的宿主細胞中表達(例如參照Co，M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152,2968-2976 ;Better， Μ· & Horwitz， A. H. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496 ;Plueckthun，A. & Skerra，A. Methods in Enzymology(1989) 178,476-496 ； Lamoyi, Ε. , Methods in Enzymology(1989) 121,652-663 ；Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology(1989) 121,663-669 ；Bird, R. E. et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。消化酶切割抗體片段的特定位點而產(chǎn)生下述具有特定結(jié)構(gòu)的抗體片段。對于所述 通過酶切得到的抗體片段，如果采用基因工程方法，則可缺失抗體的任意部分木瓜蛋白酶消化F(ab) 2或Fab ；胃蛋白酶消化F (ab，)2或Fab，；纖溶酶消化Facb。雙抗體指通過基因融合構(gòu)建的二價(bivalent)抗體片段(Holliger P et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)、EP404, 097 號、W093/11161 號等)。雙抗 體是由2個多肽鏈構(gòu)成的二聚體。構(gòu)成二聚體的各多肽鏈在相同鏈中的VL和VH通常由接 頭連接。雙抗體中的接頭一般較短，以使VL與VH不相互結(jié)合。具體而言，構(gòu)成接頭的氨基 酸殘基為例如約5個殘基。因此，編碼在同一多肽鏈上的VL和VH不形成單鏈可變區(qū)片段， 而形成相異的單鏈可變區(qū)片段和雙體。結(jié)果，雙抗體具有了 2個抗原結(jié)合位點。可通過連接抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)來得到scFv。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈 V 區(qū)由接頭、優(yōu)選肽接頭連接(Huston，J. S. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1988，85， 5879-5883)。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可源自本說明書中記載的任意抗體。對連接 V區(qū)的肽接頭無特定限制?？蓪⒗缂s3-約25個殘基的任意單鏈肽用作接頭。可通過例 如上述PCR法連接V區(qū)。為使用PCR法連接V區(qū)，首先將編碼所述抗體H鏈或H鏈V區(qū)的 DNA序列和編碼所述抗體的L鏈或L鏈V區(qū)的DNA序列的全長或編碼期望的部分的氨基酸 序列的DNA用作模板。可通過使用具有對應(yīng)于待擴增DNA兩端序列的序列的弓I物對的PCR法分別擴增編 碼H鏈和L鏈V區(qū)的DNA。然后使用編碼肽接頭部分的DNA。也可利用PCR法合成編碼肽 接頭的DNA。此時，向所用引物的5’側(cè)附加可連接獨立合成的各V區(qū)的擴增產(chǎn)物的堿基序 列。接下來利用[H鏈V區(qū)DNA]-[肽接頭DNA] - [L鏈V區(qū)DNA]的各DNA和用于裝配PCR 的引物進行PCR反應(yīng)。用于裝配PCR的引物由復(fù)性于[H鏈V區(qū)DNA]的5’側(cè)的引物和復(fù) 性于[L鏈V區(qū)DNA]的3’側(cè)的引物組合而成。即，用于裝配PCR的引物是可擴增編碼待合 成scFv的全長序列的DNA的引物組。而“肽接頭DNA”上附加有可連接各V區(qū)DNA的堿基 序列。結(jié)果，由連接有這些DNA，且用于裝配PCR的引物最終生成scFv全長的擴增產(chǎn)物。一 旦制成編碼scFv的DNA，則可根據(jù)常規(guī)方法得到含所述DNA的表達載體及經(jīng)所述表達載體轉(zhuǎn)化的重組細胞。而且，可通過培養(yǎng)所得重組細胞，并表達編碼所述scFv的DNA來得到所 述 scFv。sc (Fv) 2是將2個VH和2個VL通過接頭等結(jié)合成單鏈的經(jīng)縮減抗體(Hudson et al.，J. Immunol. Methods 1999 ；231 177-189)?？赏ㄟ^將例如scFv通過接頭連接來制備 sc(Fv)2。另外，優(yōu)選以2個VH和2個VL以單鏈多肽的N端側(cè)為基點以VH、VL、VH、VL([VH] 接頭[VL]接頭[VH]接頭[VL])的順序并列為特征的抗體。2個VH與2個VL的順序不特別局限于上述設(shè)置，可為任意順序的并列。例如可為 下述設(shè)置。[VL]接頭[VH]接頭[VH]接頭[VL][VH]接頭[VL]接頭[VL]接頭[VH][VH]接頭[VH]接頭[VL]接頭[VL][VL]接頭[VL]接頭[VH]接頭[VH][VL]接頭[vH]接頭[VL]接頭[VH]可將可通過基因工程導(dǎo)入的任意肽接頭或合成化合物接頭(參照例如Protein Engineering, 9 (3), 299-305,1996中公開的接頭)用作結(jié)合抗體可變區(qū)的接頭。本發(fā)明優(yōu) 選肽接頭。對肽接頭的長度無特定限制，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要適宜選擇。構(gòu)成肽接 頭的氨基酸殘基通常為1-100個氨基酸、優(yōu)選為3-50個氨基酸、更優(yōu)選為5-30個氨基酸、 尤其優(yōu)選為12-18個氨基酸(例如15個氨基酸)。只要不阻礙scFv的結(jié)合作用，構(gòu)成肽接頭的氨基酸序列可為任意序列。也可利用合成化學(xué)物(化學(xué)橋聯(lián)劑)連接V區(qū)?？蓪蚵?lián)肽化合物等中常規(guī)使 用的橋聯(lián)劑用于本發(fā)明。可使用例如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、雙琥珀酰亞胺酰辛二酸 (DSS)、雙(硫代琥珀酰亞胺酰)辛二酸(BS3)、二硫雙(琥珀酰亞胺酰丙酸)(DSP)、二硫雙 (硫代琥珀酰亞胺酰丙酸)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酰亞胺酰琥珀酸)(EGS)、乙二醇雙(硫 代琥珀酰亞胺酰琥珀酸)(硫代-EGS)、二琥珀酰亞胺酰酒石酸(DST)、二硫代琥珀酰亞胺酰 酒石酸(硫代-DST)、雙[2-(琥珀酰亞胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BS0C0ES)、雙[2-(硫 代琥珀酰亞胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(硫代-BS0C0ES)等。在結(jié)合4個抗體可變區(qū)時一般需要3個接頭。幾個接頭間可相同或不同。本 發(fā)明優(yōu)選的經(jīng)縮減抗體優(yōu)選為雙抗體或sc(Fv)2?？赏ㄟ^使用酶(例如木瓜蛋白酶、胃 蛋白酶等)處理抗體形成抗體片段，或者構(gòu)建編碼所述抗體片段的DNA，將其導(dǎo)入表達 載體上后在合適的宿主細胞中表達來得到所述經(jīng)縮減抗體(參照例如Co，M. S. et al.， J.Immunol(1994) 152，2968-2976 ；Better, Μ. and Horwitz, Α.H.，Methods Enzymol. (1989) 178,476-496 ；Pluckthun, A. and Skerra, Α.，Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515 ；Lamoyi, Ε. , MethodsEnzymol. (1986) 121,652-663 ；Rousseaux, J. et al., MethodsEnzymol. (1986) 121,663-669 ；Bird, R. E. and Walker, B. W. ， Trends Biotechnol. (1991)9，132-137)。本發(fā)明的抗體可為結(jié)合了如聚乙二醇(PEG)等各種分子的經(jīng)修飾抗體?？赏ㄟ^對 本發(fā)明的抗體進行化學(xué)修飾來得到所述經(jīng)修飾抗體。本領(lǐng)域已建立了修飾抗體的方法。本發(fā)明的抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體指在同一抗體分子內(nèi)具有識別不同表位的可變區(qū)的抗體，其中所述表位可存在于不同分子中，也可存在于同一分子中。即本 發(fā)明的雙特異性抗體可具有識別GRP78分子上的不同表位的抗原結(jié)合位點。還可為其中一 個識別位點識別GRP78，而另一個識別位點識別傷細胞物質(zhì)的雙特異性抗體。本發(fā)明所述 “抗體”也包括這些抗體。本發(fā)明也可聯(lián)合識別GRP78之外的抗原的雙特異性抗體。可聯(lián)合例如識別與 GRP78同樣特異性表達于靶癌細胞的細胞表面的不同于GRP78的抗原的雙特異性抗體。已知制備雙特異性抗體的方法。例如，可通過結(jié)合所識別抗原不同的2種抗體來 制備雙特異性抗體。待結(jié)合抗體可為各是具有H鏈和L鏈的1/2分子，也可為僅由H鏈構(gòu) 成的1/4分子?；蛘呖赏ㄟ^融合產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤而制備產(chǎn)生雙特異性抗體的融合 細胞。也可通過基因工程方法制備雙特異性抗體?？贵w的結(jié)合活件可通過公知方法測定抗體的抗原結(jié)合活性(Antibodies ALaboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring HarborLaboratory，1988)。例如，可利用 ELISA(醇聯(lián) 免疫吸附測定法)、EIA(酶免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或熒光免疫法等。測定 針對在細胞中表達的抗原的抗體的結(jié)合活性的方法可例如上述Antibodies A Laboratory Manual的第359-420頁中記載的方法。另外，測定表達于懸浮在如緩沖液等的細胞表面的抗原與針對所述抗原的抗 體的結(jié)合的方法尤其可利用使用流式細胞儀的方法。所使用的流式細胞儀可為例如 FACSCanto II、FACSAria 、FACSArray , FACSVantage SE、FACSCalibur (以上均制 于 BD Biosciences 公司)或、EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADCEPICS XL ADC、Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(以上均制于 Beckman Coulter 公司)。測定被檢GRP78抗體針對抗原的結(jié)合活性的優(yōu)選方法之一為例如，用識別待與表 達GRP78的細胞反應(yīng)的被檢抗體的經(jīng)FITC標(biāo)記的第二抗體進行染色后，用FACSCal ibur (BD 公司)進行測定，并用CELLQUEST軟件(BD公司)分析其熒光強度。增殖抑制活性評價或測定基于抗GRP78抗體的抑制細胞增殖的效果的方法可優(yōu)選為以下方法。 評價或測定試管內(nèi)抑制細胞增值的活性的方法可為以活細胞對加入到培養(yǎng)基中的經(jīng)[3H] 標(biāo)記的胸苷的攝取作為DNA復(fù)制能力的指標(biāo)的測定方法。更簡便的方法有在顯微鏡下計數(shù) 將臺盼藍等染料排出細胞外的能力的染料排出法或MTT法。后者利用了活細胞具有可將四 硼酸鹽MTT (3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基四唑溴)轉(zhuǎn)化為藍色的甲月替產(chǎn)物 的能力。更具體而言，向被檢細胞的培養(yǎng)液中連同配體一起加入被檢抗體，經(jīng)過一段時間 后，向培養(yǎng)液中加入MTT溶液，并靜置一段時間以使細胞攝取MTT。結(jié)果，黃色化合物MTT被 細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫水酶轉(zhuǎn)化成藍色化合物。溶解此藍色化合物，顯色后，測定其吸光 度，并將其作為活細胞數(shù)的指標(biāo)。除MTT之外，也可適宜選擇已有市售的MTS、XTT、WST-U WST-8等(nacalaitesque等)。測定活性時，也可使用對照抗體。另外，評價或測定活體內(nèi)抑制細胞增殖的活性的方法可利用攜帶腫瘤的小鼠模 型。例如，將表達GRP78的癌細胞移植入非人被檢動物的皮內(nèi)或皮下，從當(dāng)日或次日起，每 日或者每數(shù)日靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)施用被檢抗體。期間測定腫瘤大小，從而評價已知細胞增殖
27的活性。以與在試管內(nèi)進行的評價相同的方式施用對照抗體，通過施用了抗GRP78抗體的 施用組的腫瘤大小相比施用了對照抗體的組的腫瘤大小顯著小來判定抑制細胞增殖的活 性。將小鼠用作非人被檢動物時，可適宜使用經(jīng)遺傳方法使胸腺缺陷而使其T淋巴細胞喪 失功能的裸鼠(nu/nu)?？赏ㄟ^使用所述小鼠來排除評價、測定所施用的抗體的抑制細胞增 值的活性的過程中的被檢動物中T淋巴細胞的干擾。抑制細胞增殖的方法本發(fā)明提供通過使表達GRP78的細胞與本發(fā)明的抗體接觸來抑制所述細胞的增 殖的方法。如上所述，本發(fā)明的抗體是與本發(fā)明的細胞增值抑制劑中所含GRP78蛋白結(jié) 合的抗體。待與抗GRP78抗體接觸的細胞只要是表達GRP78的細胞則無特定限制，但優(yōu)選 GRP78位于細胞膜上的細胞，或優(yōu)選疾病相關(guān)細胞。疾病相關(guān)細胞的優(yōu)選例可為癌細胞。存 在于惡性腫瘤內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞(腫瘤血管)也屬此類。對目的癌癥種類無特定限制，可為 例如前列腺癌、乳癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦腫瘤。使用抗GRP78抗體的遞送方法本發(fā)明涉及使用抗GRP78抗體將傷細胞物質(zhì)遞送到細胞內(nèi)的方法。本發(fā)明所用抗 體為結(jié)合有所述傷細胞物質(zhì)的抗GRP78抗體。此時優(yōu)選具有被細胞攝入活性的抗體?？赏?過使結(jié)合有傷細胞物質(zhì)的抗GRP78抗體與表達GRP78的細胞接觸來實施傷細胞物質(zhì)的遞 送。對本發(fā)明中待遞送傷細胞物質(zhì)的細胞無特定限制，但優(yōu)選GRP78位于細胞膜上的細胞， 或優(yōu)選疾病相關(guān)細胞。疾病相關(guān)細胞可為例如癌細胞。存在于惡性腫瘤內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞 (腫瘤血管)也屬此類。對目的癌癥種類無特定限制，可為例如前列腺癌、乳癌、胰腺癌、肺 癌、食道癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦腫瘤。本發(fā)明所述“接觸”可在體外進行，也可在體內(nèi)進行。此時加入的抗體形態(tài)可適宜 為溶液或通過凍干等方法得到的固體形態(tài)?？蔀楹绫砻婊钚詣?、賦形劑、染料、芳香劑、 防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、調(diào)味劑等的溶 液。對加入的濃度無特定限制，但培養(yǎng)液中的終濃度優(yōu)選為lpg/ml-lg/ml、更優(yōu)選為Ing/ ml-lmg/ml,更優(yōu)選為 1 μ g/ml-lmg/mL·另外，本發(fā)明所述體內(nèi)“接觸”可通過向有表達GRP78的細胞移植入體內(nèi)的非人動 物或具有內(nèi)源性表達GRP78的癌細胞的包括人在內(nèi)的動物施用來進行。施用方法可為經(jīng) 口、非經(jīng)口施用中的任一種。尤其優(yōu)選非經(jīng)口施用的方法，有關(guān)施用方法可具體為例如注 射施用、經(jīng)鼻施用、經(jīng)肺施用、經(jīng)皮施用等?？赏ㄟ^注射施用(例如靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注 射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等)全身或局部施用本發(fā)明的藥物組合物細胞增值抑制劑及抗 癌劑?？筛鶕?jù)被檢動物的年齡、癥狀適宜選擇施用方法。以水溶液的形式施用時可為僅含 抗體的水溶液，也可為含例如表面活性劑、賦形劑、染料、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、 懸浮劑、等滲劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、調(diào)味劑等的溶液。施用量可選例如每次施 用0. OOOlmg-lOOOmg/kg的施用量?；蛘呖蛇x例如0. 001-100000mg/患者的施用量。但本 發(fā)明的抗體的施用量不限于這些施用量。藥物組合物另一方面，本發(fā)明的特征在于含結(jié)合GRP78蛋白的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的 特征還在于含結(jié)合GRP78蛋白的抗體的細胞增值抑制劑，尤其是抗癌劑。優(yōu)選將本發(fā)明的 細胞增值抑制劑和抗癌劑施用給患癌癥的受試者或具有患癌癥的可能性的受試者。
本發(fā)明的含結(jié)合GRP78蛋白的抗體的細胞增值抑制劑可表現(xiàn)為包括將結(jié)合GRP78 蛋白的抗體施用給受試者的步驟的抑制細胞增值的方法，或結(jié)合GRP78蛋白的抗體用于制 備細胞增值抑制劑的用途。另外，本發(fā)明的含結(jié)合GRP78蛋白的抗體的抗癌劑可表現(xiàn)為包括將結(jié)合GRP78蛋 白的抗體施用給受試者的步驟的預(yù)防或治療癌癥的方法，或結(jié)合GRP78蛋白的抗體用于制 備抗癌劑的用途。本發(fā)明的藥物組合物(例如細胞增值抑制劑、抗癌劑)所含抗體只要可結(jié)合GRP78 蛋白則無特定限制，可使用本說明書中例示的任意抗體。本發(fā)明的藥物組合物的施用方法可通過經(jīng)口、非經(jīng)口施用中的任一種進行實施。 尤其優(yōu)選非經(jīng)口施用的施用方法，相關(guān)施用方法具體有例如注射施用、經(jīng)鼻施用、經(jīng)肺施 用、經(jīng)皮施用等。注射施用的例子為可通過例如靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下 注射等全身或局部施用本發(fā)明的藥物組合物?？筛鶕?jù)患者年齡、癥狀適宜選擇施用方法。施 用量可選例如每次施用0. OOOlmg-lOOOmg/kg的施用量?；蛘呖蛇x例如0. 001-100000mg/ 患者的施用量。但本發(fā)明的藥物組合物的施用量不限于這些施用量?？筛鶕?jù)常規(guī)方法將本發(fā)明的藥物組合物制成制劑(例如Remington’ s Pharmaceutical Science，latest edition，MarkPublishing Company，Easton，U.S.A)，也 可為共含藥物可接受媒質(zhì)或添加劑的制劑。所述媒質(zhì)可為例如表面活性劑、賦形劑、染料、 芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、調(diào)味劑 等，但不限于此，也可適宜使用其它常用載體。具體而言，可為例如輕質(zhì)無水硅酸、乳糖、結(jié) 晶纖維素、甘露醇、淀粉、羧甲纖維素鈣、羧甲纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、 聚乙烯乙醛二乙胺乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中級脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯(60)硬 化蓖麻油、白糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽類等。藥物制備方法本發(fā)明還提供包括下列步驟的制備藥物，尤其是抗癌劑的方法。藥物組合物的制備方法，包括下列步驟(a)提供抗GRP78抗體；(b)確認(a)的抗體是否具有被細胞攝入活性；(c)篩選具有被細胞攝入活性的抗體；(d)將(C)中篩選出的抗體與傷細胞物質(zhì)結(jié)合?？赏ㄟ^上述方法確認是否具有被細胞攝入活性。另外，其中所述抗GRP78抗體、傷 細胞物質(zhì)可使用上述抗GRP78抗體、傷細胞物質(zhì)。癌癥診斷本發(fā)明提供使用抗GRP78抗體的疾病診斷方法，尤其是癌癥診斷方法。本發(fā)明的診斷方法可通過檢測被攝入細胞內(nèi)的抗GRP78抗體來進行。用于本發(fā)明 的抗GRP78抗體優(yōu)選具有被細胞攝入活性，且優(yōu)選標(biāo)記有標(biāo)記物。因此，本發(fā)明的診斷方法的優(yōu)選實施方式可為例如使用標(biāo)記有標(biāo)記物、且具有被 細胞攝入活性的抗GRP78抗體的診斷方法。結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體可用上述抗GRP78 抗體。對結(jié)合抗GRP78抗體的標(biāo)記物無特定限制，可使用例如熒光染料、酶、輔酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)記物，具體可為例如放射性同位素(32P、 14C、125I、3H、131I等)、熒光素、羅丹明、丹酰氯、傘形酮、熒光素酶、過氧化物酶、堿性磷酸 酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、辣根過氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微過 氧化物酶、生物素等。如果使用生物素作為標(biāo)記物，則優(yōu)選在加入經(jīng)生物素標(biāo)記的抗體后 再加入結(jié)合了堿性磷酸酶等酶的抗生物素蛋白?？墒褂梦於┓?、馬來酰亞胺法、吡啶二硫 法、過碘酸法等公知方法結(jié)合標(biāo)記物和抗GRP78抗體。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法向抗體結(jié)合標(biāo)記物。在根據(jù)本發(fā)明的方法診斷的疾病是癌癥時對目的癌癥種類無特定限制，可為例如 前列腺癌、乳癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、黑素瘤、結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦腫瘤。本發(fā)明的診斷可在體內(nèi)進行，也可在體外進行。體外診斷可通過包括例如下列步驟的方法進行(a)提供采自受試者的樣品；(b)使(a)的樣品與結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體接觸；(c)檢測被攝入細胞內(nèi)的抗體。對所采樣品無特定限制，但優(yōu)選例如采自受試者的細胞、組織等。另外，將采自活 體組織或細胞固定的標(biāo)本或細胞培養(yǎng)液等獲自被檢樣品的二次樣品也屬本發(fā)明的樣品。體內(nèi)診斷可通過包括例如下列步驟的方法進行(a)給受試者施用結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體；(b)檢測被攝入癌細胞內(nèi)的抗體。抗GRP78抗體的施用量由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)記物種類、待診斷疾病種類等適 宜決定。可根據(jù)上述方法將經(jīng)標(biāo)記的抗GRP78抗體制成制劑。本發(fā)明還提供包括下列步驟的制備診斷試劑，尤其是癌癥診斷試劑的方法(a)提供抗GRP78抗體；(b)確認(a)的抗體是否具有被細胞攝入活性；(c)篩選具有被細胞攝入活性的抗體；(d)向(C)中篩選出的抗體結(jié)合標(biāo)記物?？赏ㄟ^上述方法確認是否具有被細胞攝入活性。另外，其中所述抗GRP78抗體、標(biāo) 記物可使用上述抗GRP78抗體、標(biāo)記物。GRP78 部分肽本發(fā)明提供由SEQ ID NO 3 (GRP78的376號-415號氨基酸)的氨基酸序列構(gòu)成 的多肽或其片段。由SEQ ID N0:3(GRP78的376號-415號氨基酸)的氨基酸序列構(gòu)成 的多肽或其片段可用作制備本發(fā)明的抗體的免疫原，或可用于評價制備出的抗體的結(jié)合活 性。本發(fā)明所述“片段”至少為5個氨基酸或更多、優(yōu)選10個氨基酸或更多，更優(yōu)選15個 氨基酸或更多。對由SEQ ID NO :3的氨基酸序列構(gòu)成的多肽片段的例子無特定限制，可為 由GRP78的384號-391號氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的片段(由SEQ ID NO 3的9_16氨基 酸序列構(gòu)成的片段)、由GRP78的392號-407號氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的片段(由SEQ IDNO 3的17-32氨基酸序列構(gòu)成的片段)、由GRP78的400號-415號氨基酸的氨基酸序列 構(gòu)成的片段(由SEQ ID NO 3的25-40氨基酸序列構(gòu)成的片段)等。實施例
實施例1 免疫1-1.制備免疫原1-1-1.構(gòu)建GRP78大腸桿菌表達載體為構(gòu)建GRP78大腸桿菌表達載體，首先根據(jù)以下方法克隆GRP78基因。首先，以 人結(jié)腸腺癌cDNA(MTC，多組織cDNA panel, CloneTech)為模板，使用Pyrobest Taq聚合酶 (TAKARA)根據(jù)以下條件進行RT-PCR來克隆全長GRP78基因。GRP-I :atgaagctct ccctggtggc(SEQ ID NO 26)GRP-2 :ctacaactca tctttttctg ctgta(SEQ ID NO 27)(94°C 30 秒鐘、58°C 30 秒鐘、72°C 120 秒鐘，27 個循環(huán))隨后，以所得PCR產(chǎn)物為模板，根據(jù)以下條件再次進行PCR，得到在SEQ ID NO :1的 堿基序列的nt55-1965的GRP78基因片段的5，端、3，端分別附加BamHI、XhoI酶切序列的 GRP78 cDNA 片段。GRP-GST-I :aaaggatccg aggaggagga caagaaggag gacgtggg(SEQID NO 28)GRP-GST-2 :tttctcgagc tacaactcat ctttttctgc tgtatcctc(SEQID NO 29)(94°C 30 秒鐘、64°C 30 秒鐘、72°C 120 秒鐘，25 個循環(huán))將其用BamHI、XhoI酶切后插入到同樣經(jīng)BamHI、XhoI酶切的大腸桿菌GST融合表 達載體(PGEX-6P-1，Amersham Pharmacia)的GST編碼區(qū)下游，從而構(gòu)建了 GRP78-GST融合 蛋白表達載體(PGEX-GRP78-全長)。1-1-2. GST融合GRP78蛋白的表達誘導(dǎo)和純化接下來，制備GRP78蛋白用作為得到GRP78結(jié)合抗體的免疫原。首先用pGEX-GRP78-全長轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)。將其培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基(300ml) 中，待OD61tl達0.5以上時加入IPTG至0.5mM，從而進行蛋白的誘導(dǎo)表達。培養(yǎng)5小時后通 過離心收集大腸桿菌。將收集的大腸桿菌懸浮于30ml的B_BER(PIAS公司)中進行裂解。然后將此經(jīng) 裂解的大腸桿菌裂解物用PBS稀釋10倍，并向其中加入經(jīng)PBS平衡的谷胱甘肽瓊脂糖 4B(Amersham Pharmacia)，在4°C溫育過夜。此后用PBS洗滌數(shù)次以除去未吸附蛋白，在蛋 白酶反應(yīng)液(50mMTris-HCl、150mM NaClUmM EDTAUmM DTT、pH7. 5)中使 PreScissuion 蛋 白酶(Amersham Pharmacia)于4°C反應(yīng)過夜。通過此操作將GRP78-GST融合蛋白的GST蛋 白與GRP78蛋白(19號-654號氨基酸)切分開。隨后，將經(jīng)蛋白酶消化而洗脫出的GRP78 蛋白用Superdex200HR 10 30柱(Amersham Pharmacia)進行凝膠過濾色譜分離，并回收目 的GRP78蛋白(19號-654號氨基酸)。1-2.免疫通過初次免疫時用完全佐劑(DIFC0:DF263810)，二次免疫之后用不完全佐 劑(DIFCO :DF263910)制成GRP78蛋白的乳劑，將其以50 μ g/小鼠皮下注射給各小鼠 [(MRL/lpr、雄性、4周齡)(Balb/c、雌性、6周齡)均購自日本Charles River]每3只而進 行免疫(TERM0注射器1ml、針26G)。初次免疫的2周后實施二次免疫，以后以1周的間隔 進行免疫4-5次。GRP78 (50 μ g)懸浮于100 μ 1的PBS中，并通過尾靜脈注射進行免疫來進 行最后一次免疫，并在3天后進行細胞融合。1-3.制備雜交瘤
如下進行細胞融合。從小鼠無菌摘出脾臟，在培養(yǎng)液1 (RPMI1640+PS)中研磨成單 細胞懸液。使其通過70 μ m的尼龍網(wǎng)(Falcon)而除去脂肪組織等，并進行細胞計數(shù)。將所 得B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(P3U1細胞)以約2 1的細胞數(shù)比例混合，并加入lmL50% PEG (Roche, cat# 783 641)，進行細胞融合。將融合的細胞懸浮于培養(yǎng)液2 [RPMI1640+PS、 10% FCS、HAT (Sigma, H0262) ,5% BMcondimed Hl (Roche #1088947)]中，并以 200 μ L/孔 注入合適個(10個)96孔平板中，于37°C進行培養(yǎng)。1周后用培養(yǎng)上清進行雜交瘤的篩選。
實施例2 識別位于細胞膜上的GRP78的抗GRP78抗體的篩選2-1.由GRP78結(jié)合抗體的ELISA的篩選(一次篩選)為得到位于細胞表面的抗GRP78抗體，首先進行結(jié)合GRP78的抗體的篩選。結(jié)合 抗體的篩選中使用了 ELISA。使包被有1 μ g/ml由大腸桿菌純化的GRP78蛋白的ELISA用平板(NUNC)與雜 交瘤的培養(yǎng)上清反應(yīng)，溫育1小時。之后與經(jīng)堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗小鼠IgG(ZYMED #62-6622)反應(yīng)1小時后，加入lmg/ml的底物(SIGMA :S0942_50TAB)使顯色。用讀板儀 (BioRad公司)測定OD4tl5,篩選ELISA陽性孔。2-2.通過FACS對位于細胞表面的抗GRP78抗體的篩選(二次篩選)通過FACS分析了經(jīng)一次篩選呈陽性的孔的培養(yǎng)上清對前列腺癌細胞株(DU145) 的反應(yīng)性。用含10% FCS、lmM 丙酮酸鈉、0. ImM NEAA 的 EMEM(invitrogen)對 DU145(獲自 ATCC)進行培養(yǎng)、傳代。用ImM EDTA/PBS剝離DU145，使其與雜交瘤的培養(yǎng)上清反應(yīng)，于4°C 溫育1小時。然后加入經(jīng)FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(BECKMAN COULTER PN IM0819)，于 4°C溫育30分鐘。然后通過FACS(BD)分析各雜交瘤培養(yǎng)上清對DU145細胞表面的結(jié)合活性。2-3.有限稀釋(Limiting dilution)選擇經(jīng)FACS分析稍微呈現(xiàn)對DU145細胞的結(jié)合活性的孔，對其進行有限稀釋 (Limiting dilution ;LD)，使孔中的雜交瘤成單克隆。即測定各孔的細胞數(shù)，儀3細胞/孔 接種96孔平板。培養(yǎng)約10天后，對形成集落的孔的培養(yǎng)上清再次進行ELISA，以結(jié)合活性 為指標(biāo)篩選產(chǎn)生抗體的單克隆。通過此連續(xù)操作得到6個克隆的GRP78結(jié)合抗體(GA-19 抗體、GA-20抗體、GA-21抗體、GA-23抗體、GA-28抗體、GA-31抗體)。2-4.確定亞型用IsoStrip (Roche#l 493 027)確定抗體的亞型。亞型確定中使用了經(jīng)PBS (-) 10 倍稀釋的雜交瘤的培養(yǎng)上清。以下顯示了經(jīng)純化的各抗體的亞型。表權(quán)利要求
含與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)結(jié)合的抗體的藥物組合物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其是抗癌劑。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的組合物，其中所述抗體是與位于細胞表面的GRP78結(jié)合的 抗體。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的組合物，其中所述抗體是被表達GRP78的細胞攝入的抗體。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的組合物，其中所述抗體是與SEQID NO :3所示表位結(jié)合的 抗體。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的組合物，其中所述抗體是結(jié)合有傷細胞物質(zhì)的抗體。
8.與GRP78結(jié)合的單克隆抗體。
9.權(quán)利要求8的抗體，其特征在于與在細胞表面表達的GRP78結(jié)合。
10.權(quán)利要求8或9的抗體，其特征在于被表達GRP78的細胞攝入。
11.權(quán)利要求8-10中任一項的抗體，其特征在于與SEQID NO :3所示表位結(jié)合。
12.權(quán)利要求8-11中任一項的抗體，其特征在于識別與下列(a)-(f)中任一項的抗體 識別的表位相同的表位(a)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體 其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列、⑶R2具有SEQ ID NO 9所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 10所示氨基酸序列， 且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 11所示氨基酸序列、 ⑶R2具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 13所示氨基酸序列；(b)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體 其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 18所示氨基酸序列、⑶R2具有SEQ ID NO 19所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 20所示氨基酸序列， 且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 21所示氨基酸序列、 ⑶R2具有SEQ ID NO 22所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 23所示氨基酸序列；(c)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體 其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 61所示氨基酸序列、⑶R2具有SEQ ID NO 62所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 63所示氨基酸序列， 且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中，⑶Rl具有SEQ ID NO 64所示氨基酸序列、 ⑶R2具有SEQ ID NO 65所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 66所示氨基酸序列；(d)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體 其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 71所示氨基酸序列、⑶R2具有SEQ ID NO 72所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 73所示氨基酸序列， 且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 74所示氨基酸序列、 ⑶R2具有SEQ ID NO 75所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 76所示氨基酸序列；(e)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體 其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 81所示氨基酸序列、⑶R2具有SEQ ID NO 82所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 83所示氨基酸序列， 且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 84所示氨基酸序列、 ⑶R2具有SEQ ID NO 85所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 86所示氨基酸序列；(f)具有下述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體 其中所述重鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 91所示氨基酸序列、⑶R2具有SEQ ID NO 92所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 93所示氨基酸序列， 且其中所述輕鏈可變區(qū)具有下述⑶Rl-⑶R3，其中， ⑶Rl具有SEQ ID NO 94所示氨基酸序列、 ⑶R2具有SEQ ID NO 95所示氨基酸序列、 ⑶R3具有SEQ ID NO 96所示氨基酸序列。
13.權(quán)利要求8-12中任一項的抗體，其特征在于對表達GRP78的細胞具有傷細胞活性。
14.權(quán)利要求13的抗體，其特征在于結(jié)合有傷細胞物質(zhì)。
15.使用抗GRP78抗體將傷細胞物質(zhì)遞送至細胞內(nèi)的方法。
16.通過結(jié)合于抗GRP78抗體的傷細胞物質(zhì)抑制細胞增殖的方法。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述細胞是癌細胞。
18.抗GRP78抗體用于將傷細胞物質(zhì)遞送至細胞內(nèi)的用途。
19.具有被細胞攝入活性的抗GRP78抗體用于抑制細胞增殖的用途。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述細胞是癌細胞。
21.權(quán)利要求18-20中任一項的用途，其特征在于所述抗GRP78抗體結(jié)合有傷細胞物
22.制備藥物組合物的方法，包括(a)提供抗GRP78抗體；(b)確認(a)中的抗體是否具有被細胞攝入活性；(c)篩選具有被細胞攝入活性的抗體；(d)向(c)中篩選出的抗體結(jié)合傷細胞物質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述藥物組合物是抗癌劑。
24.使用抗GRP78抗體診斷癌癥的方法。
25.權(quán)利要求24的方法，其特征在于使用結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體。
26.權(quán)利要求24或25的方法，其特征在于檢測被攝入細胞內(nèi)的抗GRP78抗體。
27.結(jié)合有標(biāo)記物的抗GRP78抗體。
28.由SEQID NO 3的氨基酸序列或其片段構(gòu)成的多肽。
全文摘要
本發(fā)明旨在提供使用抗GRP78抗體的新藥物組合物。本發(fā)明更具體旨在提供使用抗GRP78抗體的新的癌癥治療方法、含抗GRP78抗體的新的細胞增值抑制劑和抗癌劑，及新的抗GRP78抗體。發(fā)明人在探索制備以定位于癌細胞的細胞膜的GRP78作為靶標(biāo)的抗腫瘤抗體的過程中成功得到了特異性結(jié)合于癌細胞表面的抗GRP78抗體，從而解決了上述課題。
文檔編號C12N15/09GK101951953SQ20088000244
公開日2011年1月19日 申請日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日
發(fā)明者木村直紀 申請人:株式會社未來創(chuàng)藥研究所