專利名稱：一種克隆植物病毒基因組特定序列的方法
技術領域：
本發明涉及基因克隆技術領域，特別是涉及一種克隆植物病毒基因組特定序列的方法。
背景技術：
馬鈴薯病毒病害是馬鈴薯作物上非常普遍的一類病害，廣泛存在于世界各種植區，它可 導致馬鈴薯退化，降低其產量，帶來嚴重的經濟損失。目前報道的馬鈴薯病毒多達二十多種 ，以馬鈴薯命名的病毒就有16種，其中危害較為嚴重的是PVX (馬鈴薯X病毒)、PVY (馬鈴 薯Y病毒)和PLRV (馬鈴薯巻葉病毒)等幾種。隨著馬鈴薯抗病毒基因工程的蓬勃發展，利 用一定的方法檢測并獲得病毒基因組序列成為一個重要的基礎性研究工作。
RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)技術是馬鈴薯病毒檢測和基因克隆中應用最廣 泛的技術。它主要包括RNA的提取，反轉錄，RNA擴增三個部分，此方法有簡單、快速、靈敏 和特異性強等優點，但由于RNA極其容易降解以及組織中酚類、多糖和蛋白質等干擾因素的 存在，高質量的RNA模板很難獲得，這也是RT-PCR技術的一個主要技術瓶頸。1990年Jansen 等人，首次將免疫捕捉和PCR技術有機結合，建立了抗原捕捉PCR (Antigen-capture Polymeranse-chain Reaction, AC-PCR)。此后研究者們又將此方法理念應用于植物病毒的 檢測和基因克隆上，將免疫捕捉和RT-PCR結合在一起，建立了免疫捕捉反轉錄PCR ( Immunocapture- Reverse Transcription-PCR， IC-RT-PCT)，此方法更加簡單、快速、靈 敏，但由于抗體制備成本比較高，而且有些植物的病毒抗體制備困難，所以此技術沒有得到 廣泛的應用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種克隆植物病毒基因組特定序列的方法，避開RNA 模板和抗體的制備，降低成本，同時保留現有方法簡單、快速、靈敏的特點。
本發明根據植物病毒已報道的基因組序列設計相關功能基因(復制酶、外殼蛋白等)序 列的特異性引物，然后將研磨后的植物病葉汁加到塑料離心管中包被，使暴露的病毒顆粒無 特異地附著于離心管內壁上，加入反轉錄體系，獲得病毒特定序列的cDNA;再通過PCR、電 泳檢測過程最終獲得所需的目的序列，具體如下
克隆植物病毒基因組特定序列的方法
(1)設計植物病毒基因組特定序列的特異性引物；(2) 研磨將植物病害葉片和研磨緩沖液以0.2 lg/lml的比例放入研缽中，研磨成葉汁 勻漿，吸入離心管中離心；其中，研磨緩沖液為
在100ml pH為7. 2的0. 02mol/L磷酸緩沖液中加入l 3g聚乙烯吡咯烷酮；
(3) 包被吸取離心后的上清液于離心管中，35 39。C水浴2.5 3.5小時，移去病葉汁 ，用PBST溶液清洗3次，DEPC水洗一次，離心后吸去管底余液；其中，PBST溶液的配方為
在100ml pH為7. 5的0. 01mol/L磷酸緩沖液中加入0. 03 0. 07ml Tween —20;
(4) 反轉錄配制20yl反轉錄體系，42。C反轉錄lh，將反應管轉至9(TC水浴15min，即 得cDNA;
(5) 目的片段PC財廣增用得到的cDNA配制25yl PCR反應體系，進行目的片段的PC財廣
增；
(6) 電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。 具體的，上述克隆植物病毒基因組特定序列的方法
(1) 設計植物病毒基因組特定序列的特異性引物；
(2) 研磨將植物病害葉片和研磨緩沖液以0.2 lg/lml的比例放入研缽中，研磨成葉汁 勻漿，吸入離心管中離心10min;其中，研磨緩沖液為
在100ml pH為7. 2的0. 02mol/L磷酸緩沖液中加入l 3g聚乙烯吡咯烷酮；
(3) 包被吸取離心后的上清液于離心管中，35 39。C水浴2.5 3.5小時，移去病葉汁 ，用PBST溶液清洗3次，DEPC水洗一次，離心后吸去管底余液；其中，PBST溶液的配方為
在100ml pH為7. 5的0. 01mol/L磷酸緩沖液中加入0. 03 0. 07ml Tween —20;
(4) 反轉錄在吸去管底余液的離心管中加入ll. 5y 1 DEPC水、4yl 5XRT-PCR buffer 、lyl lOmmol/1 dNTP、 lyl 10mmol/l下游引物和l y 1 0. lmol/L DTT， 70。C7K浴變性5min ，迅速置于冰上5min，再加入l y 1 200U/y 1的M-MLV和O. 5 y 1 40U/y 1的RNA酶抑制劑；42 。C反轉錄lh，將反應管轉至90。C水浴15min，即得cDNA;
(5) 目的片段PC財廣增配制25y 1 PCR反應體系，94。C預變性4min，進行如下循環 94。C變性45s、在特異性引物的退火溫度下退火45s、 72。C延伸60s，循環35次；最后72。C延 伸10min; 25yl PCR反應體系為
2.5yl 10XPCR buffer、 0. 5 y 1 1Ommol/L dNTP、 0. 5 y 1 1Ommol/L上游引物、0. 5 y 1 1Ommol/L下游弓l物、0. 125yl 5U/yl Taq,禾口5yl cDNA，用滅菌ddH20補足25 y 1;
(6) 電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。 詳細的，前述方法為(1) 設計植物病毒基因組特定序列的特異性引物；
(2) 研磨將植物病害葉片和研磨緩沖液以0.2g/ml的比例放入研缽中，研磨成葉汁勻漿 ，吸入1.5ml離心管中，9000r/min的速度離心10min;其中，研磨緩沖液配方為
在100ml pH為7. 2的0. 02mol/L磷酸緩沖液中加入2g聚乙烯吡咯烷酮；
(3) 包被吸取200yl離心后的上清液于0. 5ml離心管中，37。C水浴3小時，移去病葉汁 ，用PBST溶液清洗3次，DEPC水洗一次，短暫離心后吸去管底余液；其中，PBST溶液的配方 為
在100ml pH為7. 5的0. 01mol/L磷酸緩沖液中加入0. 05ml Tween —20;
(4) 反轉錄在吸去管底余液的離心管中加入ll. 5y 1 DEPC水、4yl 5XRT-PCR buffer 、lyl lOmmol/1 dNTP、 lyl 10mmol/l下游引物和l y 1 0. lmol/L DTT， 70。C7K浴變性5min ，迅速置于冰上5min，再加入l y 1 200U/y 1的M-MLV和O. 5 y 1 40U/y 1的RNA酶抑制劑；42 。C反轉錄lh，將反應管轉至90。C水浴15min，即得cDNA;
(5) 目的片段PC財廣增配制25y 1 PCR反應體系，94。C預變性4min，進行如下循環 94。C變性45s、在特異性引物的退火溫度下退火45s、 72。C延伸60s，循環35次；最后72。C延 伸10min; 25yl PCR反應體系為
2.5yl 10XPCR buffer、 0. 5 y 1 1Ommol/L dNTP、 0. 5 y 1 1Ommol/L上游引物、0. 5 y 1 1Ommol/L下游弓l物、0. 125yl 5U/yl Taq,禾口5yl cDNA，用滅菌ddH20補足25 y 1;
(6) 電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
前述方法中，所述植物病毒為馬鈴薯病毒，包括馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯巻 葉病毒。
上述馬鈴薯X病毒的外殼蛋白全序列特異性引物為 上游引物5'-GAATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3'， 下游引物5'-GCTTATGGTGGTGGGAGAGTGAC-3'; 馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白全序列特異性引物為 上游引物5'-CGGCAAATGACACAATTGATCG-3'， 下游引物5'-GATCACATGTTCTTGACTCCAAG-3'; 馬鈴薯巻葉病毒的外殼蛋白全序列特異性引物為 上游引物5'-GCATGAGTACGGTCGTGGTTAAAG-3'， 下游引物5'-GACTATTTGGGGTTTTGCAAAGCC-3'。
馬鈴薯X病毒的外殼蛋白全序列特異性引物的退火溫度為55'C，馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白全序列特異性引物的退火溫度為5(TC，馬鈴薯巻葉病毒的外殼蛋白全序列特異性引物的退火 溫度為53。C。
與現有技術相比，本發明提供了一種新的克隆植物病毒基因組特定序列的方法，該方法 分為離心管與病毒顆粒的非特異性結合和反轉錄PCR兩個部分，既避開了RNA的提取和抗體制 備過程，降低了成本，又繼承了現有方法簡單、快速、靈敏度高等優點，方法中使用的研缽 、鑷子等金屬器皿和槍頭、離心管等塑料耗材，經高壓濕熱滅菌(121°C) 60min即可使用， 與傳統的RT-PCR相比，本發明的準備工作省去了對器皿的高溫烘烤或DEPC水處理，上述改進 步驟，簡化了實驗過程，縮短了時間，降低了成本。另外，試驗證明本發明的靈敏度高，重 復性好，可行性強，有很好的應用前景。
圖l:馬鈴薯Y病毒(PVY)外殼蛋白基因序列擴增產物電泳圖； 圖2:馬鈴薯巻葉病毒(PRLV)外殼蛋白基因序列擴增產物電泳圖3:馬鈴薯X病毒(PVX)外殼蛋白基因序列擴增產物電泳圖。
具體實施例方式
在本發明技術方案所述的參數范圍內，均可較好的實施本發明。下面僅以優選實施方式 來詳細說明本發明。
實施例l:
(1) 根據GenBank中已報道的馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因序列設計特異性引物 上游引物5' -CGGCAAATGACACAATTGATCG-3'
下游引物5'-GATCACATGTTCTTGACTCCAAG-3'。
(2) 分別稱取O. 2g貴州農科院農業生物技術重點實驗室保存的馬鈴薯Y病毒感染的馬鈴薯 葉片，同時用健康馬鈴薯葉片做對照，放入研缽中，加入lml研磨緩沖液(在100ml pH為7.2 的0.02mol/L磷酸緩沖液中加入2g聚乙烯吡咯烷酮配制而成，此緩沖液可以保證植物病毒的 狀態，比不含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸緩沖液效果好，這是因為聚乙烯吡咯烷酮是中粘合劑， 明顯提高了病毒的包被效果。)，研磨成勻漿，將勻漿分別吸入1.5ml離心管中，9000rmp離 心10min;
磷酸緩沖液NaCl 0.016g/ml、 KC1 0. 0004g/ml、 KH2P04 0. 0004g/ml、 Na2HP04 H20 0.006 g/ml。
(3) 包被吸取200yl離心后的馬鈴薯葉汁上清液于0. 5ml離心管中，37。C水浴3小時， 移去馬鈴薯葉汁，用PBST溶液(在100ml pH為7. 5的0.01mol/L磷酸緩沖液中加入0.05mlTween — 20配制而成)清洗3次，DEPC水洗一次，短暫離心后吸去管底余液，此時馬鈴薯Y病 毒顆粒附著在離心管內壁上；
磷酸緩沖液NaCl 0.008g/ml、 KC1 0.0002g/ml、 KH2P04 0.0002g/ml、 Na2HP04 H20 0.003g/ml。
(4)反轉錄反轉錄反應在被包被有馬鈴薯Y病毒顆粒的離心管中進行，反應體系為20 yl，在吸去管底余液的離心管中加入ll. 5y 1 DEPC水、4yl 5XRT-PCR buffer、 lyl 1Ommo1/1 dNTP、 lyl 10mmol/l下游引物和l y 1 0. lmol/L DTT， 70。C水浴變性5min (加熱 后，植物病毒蛋白外殼變性，病毒RNA充分暴露出來)，迅速置于冰上5min，再加入l y 1 200U/y 1的M-MLV和O. 5y 1 40U/y 1的RNA酶抑制劑;42。C反轉錄lh，將反應管轉至90。C水浴 15min，使酶失活，即得cDNA。
(5) 將反轉錄得到的cDNA進行PC財廣增配制25y 1 PCR反應體系，94。C預變性4min， 進行如下循環94。C變性45s、 5(TC退火45s、 72。C延伸60s，循環35次；最后72。C延伸10min ;25y 1 PCR反應體系為
2.5yl 10XPCR buffer、 0. 5 y 1 1Ommol/L dNTP、 0. 5 y 1 1Ommol/L上游引物、0. 5 y 1 1Ommol/L下游引物、0.125yl 5U/yl Taq酶和5yl cDNA，用滅菌去離子水補足25 y 1;
(6) 電泳檢測1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
結果如圖l所示M:分子量標準(北京天根生產的MarkerII) ;1:健康馬鈴薯葉片 擴增產物，未見擴增的目的片段；2:含馬鈴薯Y病毒的葉片組織經本發明TC-RT-PCR方法( Tube Capture - Reverse Transcription-PCR，試管捕捉反轉錄)所得目的片段，大小 (804bp)與預設計片段一致。將得到的特異性擴增目的片段進行測序鑒定，結果證明，擴增 出的目的片段與已報道馬鈴薯Y病毒外殼蛋白序列的同源性在90。/。以上，由此可以確定其為馬 鈴薯Y病毒外殼蛋白基因序列，從而證明了利用本發明來獲得馬鈴薯Y病毒基因組序列是可靠 的。
實施例2:
以貴州農科院生物技術重點實驗室保存的含馬鈴薯巻葉病毒的馬鈴薯病害葉片和健康馬 鈴薯葉片為材料，設計特異性引物為
上游引物5' -GCATGAGTACGGTCGTGGTTAAAG-3' 下游引物5' -GACTATTTGGGGTTTTGCAAAGCC-3' 以實施例l的操作步驟進行TC-RT-PCR反應。
結果如圖2: M:分子量標準(北京天根生產的MarkerII) ; 1:健康葉片擴增產物，未見擴增的目的片段；2:馬鈴薯巻葉病毒病害葉片組織經TC-RT-PCR反應所得目的片段，大小 (627bp)與預設計片段相符合。將得到的特異性擴增目的片段進行測序鑒定，結果證明，擴 增出的目的片段與已報道馬鈴薯巻葉病毒外殼蛋白基因序列的同源性在95%以上，從而確定 其為馬鈴薯巻葉病毒外殼蛋白基因序列，再次證明了利用本發明來獲得馬鈴薯巻葉病毒基因 組序列是可靠的。 實施例3:
以貴州農科院生物技術重點實驗室保存的含馬鈴薯X病毒的馬鈴薯病害葉片和健康馬鈴 薯葉片為材料，設計特異性引物為
上游引物5' -GAATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3' 下游引物5' -GCTTATGGTGGTGGGAGAGTGAC-3' 以實施例l的操作步驟進行TC-RT-PCR反應。
結果如圖3: M:分子量標準(北京天根生產的MarkerII) ; 1:健康葉片擴增產物，未 見擴增的目的片段；2:馬鈴薯X病毒病害葉片組織經TC-RT-PCR反應所得目的片段，大小 (714bp)與預設計片段相符合。將得到的特異性擴增目的片段進行測序鑒定。測序結果證明 ，擴增出的目的片段與已報道馬鈴薯X病毒外殼蛋白基因序列的同源性在96。/。以上，從而確定 其為馬鈴薯X病毒外殼蛋白基因序列，再次證明了利用本發明來獲得馬鈴薯X病毒基因組序列 是可靠的。
從上述三個實施例可以看出本發明的克隆方法可以用來獲得不同馬鈴薯病毒的相關功能 基因序列，另外，因其比較高的靈敏度，也可用于馬鈴薯病毒的常規檢測。
以上實施例中所用的反轉錄酶M-MLV購于Promega公司，RNA酶抑制劑和T叫酶購于大連寶 生物生物公司。所用器材經高壓濕熱(12rC)滅菌60min， 8(TC烘干。
權利要求
權利要求1一種克隆植物病毒基因組特定序列的方法，其特征在于(1)設計植物病毒基因組特定序列的特異性引物；(2)研磨將植物病害葉片和研磨緩沖液以0.2～1g/1ml的比例放入研缽中，研磨成葉汁勻漿，吸入離心管中離心；其中，研磨緩沖液為在100ml pH為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液中加入1～3g聚乙烯吡咯烷酮；(3)包被吸取離心后的上清液于離心管中，35～39℃水浴2.5～3.5小時，移去病葉汁，用PBST溶液清洗3次，DEPC水洗一次，離心后吸去管底余液；其中，PBST溶液的配方為在100ml pH為7.5的0.01mol/L磷酸緩沖液中加入0.03～0.07ml Tween—20；(4)反轉錄配制20μl反轉錄體系，42℃反轉錄1h，將反應管轉至90℃水浴15min，即得cDNA；(5)目的片段PCR擴增用得到的cDNA配制25μl PCR反應體系，進行目的片段的PCR擴增；(6)電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
2.按照權利要求l所述克隆植物病毒基因組特定序列的方法，其特征在于(1) 設計植物病毒基因組特定序列的特異性引物；(2) 研磨將植物病害葉片和研磨緩沖液以0.2 lg/lml的比例放入研缽中，研磨成葉 汁勻漿，吸入離心管中離心10min;其中，研磨緩沖液為在100ml pH為7. 2的0. 02mol/L磷酸緩沖液中加入l 3g聚乙烯吡咯烷酮；(3) 包被吸取離心后的上清液于離心管中，35 39。C水浴2.5 3.5小時，移去病葉汁 ，用PBST溶液清洗3次，DEPC水洗一次，離心后吸去管底余液；其中，PBST溶液的配方為在100ml pH為7. 5的0. 01mol/L磷酸緩沖液中加入0. 03 0. 07ml Tween —20;(4) 反轉錄在吸去管底余液的離心管中加入ll. 5y 1 DEPC水、4yl 5XRT-PCR buffer、 lyl lOmmol/1 dNTP、 lyl 10mmol/l下游引物和l y 1 0. lmol/L DTT， 7CTC水浴變性5min，迅速置于冰上5min，再加入l y 1 200U/y 1的M-MLV禾口O. 5 y 1 40U/y 1的RNA酶抑制 劑；42。C反轉錄lh，將反應管轉至9(TC水浴15min，即得cDNA;(5) 目的片段PC財廣增配制25y 1 PCR反應體系，94。C預變性4min，進行如下循環 94。C變性45s、在特異性引物的退火溫度下退火45s、 72。C延60s，循環35次；最后72。C延 伸10min; 25yl PCR反應體系為2.5yl 10XPCR buffer、 0. 5 y 1 1Ommol/L dNTP、 0. 5 y 1 10mmol/L上游引物、0. 5 y 1 10mmol/L下游弓l物、0. 125yl 5U/yl Taq,禾口5yl cDNA，用滅菌ddH20補足25 y 1;(6) 電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
3.按照權利要求2所述克隆植物病毒基因組特定序列的方法，其特征在于(1) 設計植物病毒基因組特定序列的特異性引物；(2) 研磨將植物病害葉片和研磨緩沖液以0.2g/ml的比例放入研缽中，研磨成葉汁勻 漿，吸入1.5ml離心管中，9000r/min的速度離心10min;其中，研磨緩沖液配方為在100ml pH為7. 2的0. 02mol/L磷酸緩沖液中加入2g聚乙烯吡咯烷酮；(3) 包被吸取200yl離心后的上清液于0. 5ml離心管中，37。C水浴3小時，移去病葉汁 ，用PBST溶液清洗3次，DEPC水洗一次，短暫離心后吸去管底余液；其中，PBST溶液的配方 為在100ml pH為7. 5的0. 01mol/L磷酸緩沖液中加入0. 05ml Tween —20;(4) 反轉錄在吸去管底余液的離心管中加入ll. 5y 1 DEPC水、4yl 5XRT-PCR buffer、 lyl lOmmol/1 dNTP、 lyl 10mmol/l下游引物和l y 1 0. lmol/L DTT， 7CTC水浴變 性5min，迅速置于冰上5min，再加入l y 1 200U/y 1的M-MLV禾口O. 5 y 1 40U/y 1的RNA酶抑制 劑；42。C反轉錄lh，將反應管轉至9(TC水浴15min，即得cDNA;(5) 目的片段PC財廣增配制25y 1 PCR反應體系，94。C預變性4min，進行如下循環 94。C變性45s、在特異性引物的退火溫度下退火45s、 72。C延伸60s，循環35次；最后72。C延 伸10min; 25yl PCR反應體系為2.5yl 10XPCR buffer、 0. 5 y 1 1Ommol/L dNTP、 0. 5 y 1 10mmol/L上游引物、0. 5 y 1 10mmol/L下游弓l物、0. 125yl 5U/yl Taq,禾口5yl cDNA，用滅菌ddH20補足25 y 1;(6) 電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。
4.按照權利要求1至3任一所述克隆植物病毒基因組特定序列的方法 ，其特征在于所述植物病毒為馬鈴薯病毒。
5. 按照權利要求4所述克隆植物病毒基因組特定序列的方法，其特征 在于所述馬鈴薯病毒為馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯巻葉病毒。
6. 按照權利要求5所述克隆植物病毒基因組特定序列的方法，其特征 在于馬鈴薯X病毒的外殼蛋白全序列特異性引物為 上游引物5'-GAATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3'， 下游引物5'-GCTTATGGTGGTGGGAGAGTGAC-3'; 馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白全序列特異性引物為 上游引物5'-CGGCAAATGACACAATTGATCG-3'， 下游引物5'-GATCACATGTTCTTGACTCCAAG-3'; 馬鈴薯巻葉病毒的外殼蛋白全序列特異性引物為 上游引物5'-GCATGAGTACGGTCGTGGTTAAAG-3'， 下游引物5'-GACTATTTGGGGTTTTGCAAAGCC-3'。
7. 按照權利要求6所述克隆植物病毒基因組特定序列的方法，其特征在于馬鈴薯X病毒的外殼蛋白全序列特異性引物的退火溫度為55'C，馬鈴薯Y病毒的外殼蛋 白全序列特異性引物的退火溫度為5(TC，馬鈴薯巻葉病毒的外殼蛋白全序列特異性引物的退 火溫度為53。C。
全文摘要
本發明公開了一種克隆馬鈴薯病毒基因組特定序列的方法(1)設計馬鈴薯病毒特定序列引物；(2)利用特定研磨緩沖液研磨馬鈴薯葉片；(3)包被；(4)反轉錄；(5)目的片段的PCR擴增；(6)電泳檢測，與現有技術相比，該方法分為離心管與病毒顆粒的非特異性結合和反轉錄PCR兩個部分，既避開了RNA的提取和抗體制備過程，降低了成本，又繼承了現有方法簡單、快速、靈敏度高等優點，試驗證明本發明的靈敏度高，重復性好，可行性強，有很好的應用前景。
文檔編號C12N15/10GK101457221SQ200810306720
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月31日
發明者劉作易, 英 朱, 李奇科, 邱又彬, 鄭世玲, 剛 陶, 黃永會 申請人:貴州省植物保護研究所