專利名稱：：O139群霍亂弧菌檢測用組合物、試劑盒和檢測方法
技術領域：
：本發明涉及霍亂弧菌的特異性檢測用組合物、試劑盒和檢測方法，特別涉及0139群霍亂弧菌的特異性檢測用組合物、試劑盒和檢測方法。
背景技術：
：霍亂是由霍亂弧菌(Vibriochlorae)引起的烈性腸道傳染疾病，患者的臨床癥狀常表現為大量米湯狀排泄，造成迅速脫水。如不及時治療，可導致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡。霍亂弧菌按照血清型可分為多個群，但是并不是所有的群都能引起疾病的流行。其中，能夠引起霍亂流行的主要有兩種血清型01群和0139群(K即erJB，MorrisJG，LevineMM.Cholera.Clin.Microbiol.Rev,1995,8:48-86)。因此在霍亂弧菌的檢測中，其血清型分型是有效檢測的重要組成部分。就其致病性檢測指標來說，早期研究發現，霍亂的強致病作用主要是因為霍亂弧菌分泌的霍亂毒素導致的腹瀉所致。因此在0139群霍亂弧菌引發的霍亂出現之前，一直使用霍亂毒素(choleratoxin，CT)作為檢測其病原性的標準。歷史上的前7次霍亂流行都由01群霍亂弧菌引發。在1992年末，在印度出現了由0139群引發的霍亂，并迅速傳至周圍國家。自從0139群霍亂弧菌引發霍亂爆發以后，并且隨著對0139群和01群霍亂弧菌研究的深入，發現有一些非0139群也非01群的霍亂弧菌也表達霍亂毒素CT，但是并不會引發霍亂的爆發。同時，在偶然情況下01和0139群霍亂弧菌由于缺失ctx基因而不表達霍亂毒素，同時也不會引發霍亂的爆發。所以，要準確檢測致病性霍亂弧菌的存在需要同時檢測兩個指標霍亂毒素CT和血清型指標(ChakrabortyS，MukhopadhyayAK，BhadraRK，etal.VirulencegenesinenvironmentalstrainsofVibriocholerae.Appl.Environ.Microbiol,2000，66:4022-4028)。鑒于霍亂流行的危害性較大，使霍亂弧菌的檢測尤為重要。但是傳統的弧菌檢測法需要先用堿性蛋白胨培養液培養增菌，培養分離出菌株之后才能檢測，由于其對菌株培養的需要，使這種傳統檢測方法并不總是適用。因為霍亂弧菌在嚴苛的生存條件下，例如抗生素、營養素缺乏、氣候寒冷等，就會進入一種可存活但不可培養的狀態，不適于基于菌株培養的傳統檢測方法(LyonW.T.TaaManPCRfordetectionofVibriocholerae01,0139，non_01，andnon_0139inpurecultures,rawoysters,andsyntheticseawater.Appl.Environ.Microbiol，2001，67:4685-4693)。并且，傳統弧菌檢測方法耗時較長，不利于對樣品的迅速檢測處理。由于傳統的霍亂弧菌檢測方法費時費力，不利于快速檢測，并且涉及菌的培養，對于操作人員來說具備一定的危險性，近年來針對霍亂及霍亂毒素的PCR反應快速檢測技術開始出現。對于PCR檢測來說，引物的選擇至關重要，直接影響檢測的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導致檢測的假陽性結果或者假陰性結果的出現。另外，對于產毒型霍亂弧菌的檢測，單獨檢測一個基因，往往不足以判斷其致病性。2003年Fukushima等利用SYBR熒光染料建立了多重熒光實時PCR檢測體系(HiroshiF，YoshieT，RyotaroS.Duplexreal—timeSYBRGreenPCRassaysfordetectionof17speciesof3foodorwaterbornepathogensinstools.J.Clin.Microbiol,2003，41:5134-5146)，雖然縮短了檢測時間和工作量，但是由于采用非毒素基因的單一靶位點檢測，用于檢測致病菌時，其檢測結果存在一定的假陽性率。對于食品等樣品中霍亂弧菌的檢測是預防與監測霍亂的重要步驟。并且霍亂弧菌的檢測對于患者疾病的確診與菌株的分型也有重要意義。
發明內容為了更加準確地特異性檢測樣品0139群霍亂弧菌的存在，本發明提供一種特異性檢測樣品中0139群霍亂弧菌的組合物。該組合物包括下列引物上游引物5'-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3'(序列號l);下游引物5'-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3'(序列號2)。該引物為針對0139群霍亂弧菌基因組0抗原編碼基因rfb-0139設計并經預實驗篩選出的特異性引物，利用該組合物，可以使用PCR方法特異性檢測樣品中0139群霍亂弧菌的存在。其中，可進一步包括探針5'-熒光基團-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA(序列號3)-熒光淬滅基團-3'。從而使該組合物可適用于熒光實時定量PCR(realtimePCR)檢測方法，其中所述熒光基團可以是Tet，其熒光淬滅基團可以是ECLIPSE。本領域普通技術人員均知，也可以使用本領域已知的其他熒光基團和熒光淬滅基團標記上述探針。更進一步地，為了滿足既能有效地檢測0139群致病性霍亂弧菌、又能同時判斷該霍亂弧菌產生霍亂腸毒素的能力，本發明的一個實施方式提供一種特異性檢測樣品中產毒型0139群霍亂弧菌的組合物。該組合物中包括下列兩對引物第一對引物-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3';-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3';上游引物5'下游引物5'第二對引物上游引物5'下游引物5'-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3'(序列號4)，-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3'(序列號5)。其中第一對引物為針對基因組0抗原編碼基因rfb-0139的引物，第二對引物為針對霍亂毒素基因ctxA的引物。使用該組合物，既檢測了其基因組0抗原編碼基因rfb-0139，又特異性檢測了霍亂毒素基因ctxA，所以利用該組合物可以通過PCR方法檢測樣品中產毒型0139群霍亂弧菌的存在。并且，上述組合物中可進一步包括探針5'-熒光基團-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團_3'和5'-熒光基團-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT(序列號6)-熒光淬滅基團-3'。從而使得該組合物和試劑盒可由于通過熒光實時定量PCR檢測產毒型0139群霍亂弧菌的存在。其中所述熒光基團和熒光淬滅基團可為Tet和ECLIPSE,或FAM和ECLIPSE。并且，在一個反應體系的不同探針中，使用不同的熒光基團。本領域普通技術人員可根據本領域知識自行選擇合適的熒光基團和熒光淬滅基團。本發明的又一個實施方式提供一種特異性檢測樣品中0139群霍亂弧菌的PCR檢測試劑盒，其中包括PCR反應體系和上述組合物中的任意一種。優選所述PCR反應體系為實時定量PCR反應體系。其中優選使用TaqMan探針體系進行標記和檢測。本發明進一步提供一種檢測樣品中0139群霍亂弧菌的方法，使用上述組合物中的任意一種，或上述試劑盒中的任意一種，該方法包括提取樣品中的細菌基因組DNA;使用上述組合物中的任意一種作為反應采用的引物和/或探針，或使用上述試劑盒中的任意一種，用PCR法檢測其中目的片段的存在，從而判斷樣品中0139群霍亂弧菌的存在。可采用本領域技術人員可知的PCR反應條件，優選為95士2t:預變性超過lmin，95士2t:變性超過5s，60士2t:延伸超過10s，共反應超過30個循環，最后可選地在72士2t:下延伸超過2min。當上述PCR法為普通PCR法時，其反應條件進一步優選為94t:預變性2min，94t:變性30s，6(TC延伸lmin，共反應40個循環，最后72。C延伸7min。當上述PCR法為實時定量PCR法時，其反應條件進一步優選為94t:預變性2min，94t:變性10s，6(TC延伸30s，共反應45個循環。上述PCR法中優選使用熒光實時定量PCR法檢測。在上述熒光實時定量PCR中，優選使用T叫Man探針法。本檢測體系所檢測標本無需活菌，在樣品處理的第一步DNA提取的裂解過程中就可使霍亂弧菌迅速死亡，減少了對操作人員的生物危害。本方法無需增菌，整個反應在2小時內完成，大大節省了人力與時間，可用于快速檢測。并且，利用本發明的一些優選實施方式，例如，如上所述同時使用第一對和第二對引物進行PCR時，可以特異性檢測樣品中的產毒型0139群霍亂弧菌的存在，S卩，不僅僅能夠對樣品中的霍亂弧菌分型，而且能夠判斷其產生霍亂毒素的能力，特異性區分致病性霍亂弧菌和非致病性霍亂弧菌。在更加優選的實施方式中，采用本發明所述的特異性探針，利用T叫Man實時熒光PCR技術進行檢測，該方法由于自動化程度高，無需開蓋檢測產物，還減少了產物污染的機會。利用本發明的組合物、試劑盒和/或方法對0139群霍亂弧菌檢測時，同時使用針對兩個基因(rfb-0139和ctxA)的上述兩對引物的普通雙重PCR體系的實施方式的檢測敏感性達到102拷貝每反應體系；除了使用上述兩對引物，還使用了T叫Man技術，加入上述兩個特異性探針的實時熒光雙重PCR檢測體系的實施方式的檢測范圍為1X102至1X109拷貝；采用上述兩對引物的普通雙重PCR實施方式對0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測敏感性達1X1(^pg每反應體系，而實時熒光雙重PCR實施方式對0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測敏感性可達1Xl(^pg每反應體系，并且該檢測快速簡便，整個反應在2小時內完成。圖1為普通雙重PCR檢測敏感度的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為分子量標準，"-"為陰性對照，泳道10°10"為每個PCR反應所加質粒DNA模板拷貝數分別為10°10"拷貝每反應體系。圖2為雙重實時熒光PCR檢測敏感度的擴增曲線圖，標識"壙，曲線為ctxA熒光檢測信號，平滑線為rfb-0139熒光檢測信號，由左到右每PCR反應的模板量分別為109101拷貝質粒DNA;水平信號線為陰性對照。圖3為普通雙重PCR及實時熒光雙重PCR檢測體系對0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測圖，其中(A)M為分子標準，泳道N為陰性對照，泳道1-8為每個PCR反應所加基因組DNA模板數分別為1X10—2pg至1X105pg每反應體系。(B)標識"*"曲線為ctxA熒光檢測信號，平滑線為rfb-0139熒光檢測信號；由左到右每PCR反應的模板量分別為109拷貝質粒陽性對照和1X105pg至1X10—2pg基因組DNA;水平信號線為陰性對照。圖4為說明實時熒光雙重PCR檢測體系對檢測0139群霍亂弧菌基因組DNA的特異性的圖，其中標識"f曲線為ctxA熒光檢測信號，平滑線為rfb-0139熒光檢測信號，"+"為IX109拷貝質粒陽性對照每反應體系；"0139"為0139群霍亂弧菌基因組DNAIX103pg每反應體系；水平信號線為陰性對照和19種陰性對照菌基因組DNA。具體實施例方式為了特異性檢測0139群霍亂弧菌，發明人選擇了0139群霍亂弧菌的基因組0抗原編碼基因rfb-0139作為靶標序列，針對該基因設計了特異性引物，并經預實驗選擇了最具有特異性的一對引物(rfb0139-F和rfb0139-R，見下表1)用于本發明中。在本發明的一個實施方式中，選擇rfb0139-F和rfb0139-R作為特異性引物，用PCR方法檢測樣品中0139群霍亂弧菌的存在。使用該方法，可特異性檢測樣品中0139群霍亂弧菌的基因組0抗原編碼基因rfb-0139，進而特異性檢測樣品中0139群霍亂弧菌的存在，并且在檢測初期就通過裂解使霍亂弧菌死亡，不會對實驗操作人員造成威脅。優選使用熒光實時PCR法檢測，省去了普通PCR的凝膠電泳等時間，使其檢測和分析更加簡便，縮短了檢測的時間。更優選使用T叫Man技術標記的熒光實時PCR法，使用TaqMan技術時，其探針優選為rfb0139-探針5'-熒光基團-08(1^0八八1八08八8(:(:(1^八881-熒光淬滅基團-3'，該探針為針對該靶標序列特異性探針，增強了檢測的特異性。其熒光基團和熒光淬滅基團可以分別是Tet和ECLIPSE。同時，為了特異性檢測產毒型的O139群霍亂弧菌，發明人又將主要導致霍亂的嚴重癥狀一一腹瀉的霍亂毒素的基因ctxA作為PCR檢測的靶標序列，針對該基因設計了特異性引物。同樣，經過預實驗篩選，選擇出最具有特異性的一對引物(ctxA-F和ctxA-R，見下表1)用于本發明中。在本發明的另一個實施方式中，同時采用引物rfb0139-F和rfb0139-R，以及引物ctxA-F和ctxA-R，用雙重PCR的方法檢測樣品中產毒型0139群霍亂弧菌的存在。使用該方法，在一次檢測中既可以檢測0139群霍亂弧菌，又能夠判斷該菌產生霍亂毒素的能力，可以更準確地特異性檢測致病的產毒型0139群霍亂弧菌。優選采用熒光雙重實時PCR法檢測，更優選采用TaqMan技術標記，所使用的探針為rfb0139_探針5'-熒光基團-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT-熒光淬滅基團-3'，和ctxA-探針5'-熒光基團-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團_3'，其中兩個探針中使用不同的熒光基團。使用該方法，不僅可以準確地檢測致病的產毒型0139群霍亂弧菌，而且其操作更加簡便，在加入所需試劑開始反應后，不需再次開蓋加樣和取樣，避免了污染的發生。并且其結果可以直接讀出，而不需要后續的諸如凝膠電泳之類的操作，大大節省了檢測的時間。而且，這兩個探針均為針對相應基因設計的特異性探針，更加增強了其檢測的特異性。其中所述熒光基團和熒光淬滅基團對可以是Tet和ECLIPSE，以及FAM和ECLIPSE。但是6并不限于這兩對熒光基團和熒光淬滅基團，本領域技術人員可以根據需要選擇合適的熒光基團及其對應的熒光淬滅基團。下面結合具體實施例詳細說明本發明的優選實施方式。需要指出的是，這里列出的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本發明的目的。引物和T叫Man探針的設計與合成利用Genbank的Blast工具對0139群霍亂弧菌的ctxA基因與rfb-0139基因序列進行分析，選擇其穩定的保守區域作為檢測靶標序列，并針對這兩個檢測靶標序列設計引物和探針(見表l)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中ctxA基因的檢測探針5'端標記FAM熒光基團，3'端標記ELIPSE熒光淬滅基團，rfb-0139基因的檢測探針5'端標記Tet熒光基團，3'端標記ECLIPSE熒光淬滅基團。表l引物及探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>檢測菌種的準備本實施例中所使用的0139群霍亂弧菌滅活疫苗由國家生物制品檢定所惠贈。19種其他腸道致病菌或醫院感染中常見的致病菌致病性大腸桿菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、痢疾志賀氏菌、宋內志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、腸炎耶爾森菌、類志賀鄰單胞菌、腦膜炎黃桿菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍德菌、綠膿桿菌、傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌由衛生部臨床檢驗中心微生物實驗室提供。實施例l采用普通PCR法的檢測細菌基因組DNA的抽提抽提各細菌基因組DNA(TAKARA公司的MiniBEST試劑盒)。利用紫外分光光度計測定各細菌基因組DNA的純度和濃度，0139群霍亂弧菌基因組DNA用TE緩沖液稀釋至lX105pg/iil到1X10—3pg/iil的梯度標準品，其余19種其他腸道致病菌或醫院感染中常見的致病菌的基因組DNA用TE緩沖液稀釋至5X104pg/y1，各種基因組DNA均少量分裝，-2(TC保存備用。質粒標準品的構建與制備采用TA克隆技術構建目的質粒。在經過電泳確認擴增片段分子量后，將rfb-0139和ctxA特異性序列的PCR產物連至pMD18-T載體(日本TaKaRa公司)上，重組陽性克隆培養后抽提質粒(Omega質粒提取試劑盒)，采用pMD18_T載體的RVM引物進行測序(美國BeckmanCoulter公司試劑盒)，利用CEQ8000軟件進行序列分析，并與原目的序列進行比對。序列完全正確的目的質粒用紫外分光光度法定量(Eppendorf紫外分光光度計)后，用1XTE(pH8.O)TE緩沖液稀釋到l(T拷貝/iU作為儲存液，-2(TC保存備用，使用時連續10倍稀釋至濃度在1.0X10—4考貝/ill1.0X1(T拷貝/yl之間，取10iil標準品作為實時定量PCR的模板，使參加每個PCR反應的質粒數形成l個拷貝到10"拷貝的梯度分布。普通雙重PCR反應條件普通雙重PCR反應體系為25iU，取10X含鎂的緩沖液2.5iU，dNTPs(各2.5mmol/L)2ii1，25iimol/L引物各0.5iil(終濃度為500nM)，模板DNAlO.Oii1，BlendTaqplusDNA聚合酶1.0U，加滅菌水至終體系25。PCR循環參數94。C預變性2min，94°C變性30s，6(TC延伸lmin，共反應40個循環，最后72t:延伸7min。擴增后取5ulPCR產物在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳后用溴化乙錠(EB)染色，并在凝膠成像系統上觀察分析，結果見圖1和圖3A。實施例2采用熒光實時定量PCR反應法檢測采用與實施例相同的細菌基因組DNA和質粒標準品，其區別在于所采用的PCR方法為熒光實時定量PCR，并且使用了上述設計并合成的探針。實時熒光雙重PCR反應條件反應體系為25ii1，取10XPCR緩沖液2.5ii1、2.5mmol/L各dNTP2.0iU、25iimol/L引物各0.5ii1、5iimol/L探針各0.5ii1、BlendTaqplusDNA聚合酶1U、模板DNA10ul，加滅菌水至終體系25iU。PCR循環參數94。C預變性2min，94。C變性10s，60。C延伸30s，共反應45個循環。在擴增結束后按同一條件分析數據，確定各樣品的Ct值。實施例1和2的檢測體系的檢測敏感度的評價取質粒標準品每反應體系10°拷貝至1(T拷貝，或以1X10—2pg/iil到lX105pg/P1梯度濃度的0139群霍亂弧菌細菌基因組DNA為模板，評價了普通雙重PCR與實時雙重熒光TaqManPCR檢測體系的檢測敏感性，結果參見圖14。實施例1中對質粒標準品的檢測敏感度雙質粒梯度稀釋模板進行普通雙重PCR擴增后電泳檢測顯示，當每反應體系中ctxA基因和rfb-0139基因的質粒DNA模板數降低至1.0X101及以下拷貝時，普通PCR反應后電泳圖上未出現目的條帶，陰性對照也未見擴增條帶(圖1)。實施例2中對質粒標準品的檢測敏感度雙質粒梯度稀釋模板進行實時熒光PCR檢測時顯示，當反應體系ctxA基因和rfb-0139基因的質粒DNA模板數為102拷貝以上時，其熒光信號強度ARn高于檢測域值(ARn=30)，其檢測范圍是1.0X1021.0X109拷貝每反應體系(圖2)。兩個耙基因擴增反應的Ct值和模板之間均存在良好的相關性，rfb-0139相關性為0.998，擴增效率達到1.04，ctxA相關性為0.999，擴增效率為0.97。實施例1中對細菌基因組DNA的檢測敏感度將0139群霍亂弧菌基因組DNA梯度稀釋到1X105pg至1X10—2pg每反應體系時普通雙重PCR擴增后電泳檢測顯示，當基因組DNA梯度稀釋至每反應體系1X10°pg時普通雙重PCR反應后電泳圖上未出現ctxA和rfb-0139目的擴增條帶(圖3A)。實施例2中對細菌基因組DNA的檢測敏感度用與實施例1相同梯度濃度的基因組DNA進行熒光實時PCR檢測時顯示，在1.0X10°pg及以上時，其熒光信號強度ARn高于檢測域值(ARn=30)，該結果顯示實時熒光雙重PCR對0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測敏感度比普通雙重PCR的檢測敏感度高10倍(圖3B)。該雙重檢測體系中，兩個靶基因擴增反應的Ct值和模板之間有良好的相關性，ctxA相關性為0.997，擴增效率為1.02，rfb-0139相關性為0.999，擴增效率達到0.97。檢測特異性的評價以上述19種其他腸道致病菌或醫院感染中常見的致病菌的基因組DNA為模板評價了雙重T叫Man實時熒光PCR反應體系的特異性。利用實施例2中所述的體系對0139群霍亂弧菌滅活疫苗基因組DNA的1X103pg每反應體系進行檢測時可見明確的擴增曲線，對上述19種非霍亂弧菌的病原菌基因組DNA的5X105pg每反應體系進行檢測時均未產生陽性擴增曲線，說明我們使用的探針和引物與我們選定的19種陰性對照菌之間不存在交叉反應。用已知濃度(1.0X107每反應體系)陽性質粒標準品和陰性對照進行盲檢測，未出現假陽性和假陰性結果(圖4)。盡管上文中以優選的方式，通過具體實施例示例性說明了本發明的某些實施方式，但是本領域技術人員應了解，本發明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據本發明所屬
技術領域：
的知識對其進行修改，所作修改不會超出本發明要求保護的范圍。例如，本發明所使用的熒光實時PCR也可以根據需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光基團和熒光淬滅基團以外的標記物質，如Cy5、HEX、TAMRA、ROX、BHQ、Cy3、TxRd、JOE等標記物；或使用T叫man技術之外的其他標記體系，例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等熒光探針標記技術；或使用染料嵌合法如SYBRGreenI等不飽和染料與LCGreen等飽和染料，只要其使用了本發明所述的特異性引物序列，即可定量檢測目的基因的存在，進而特異性地檢測0139群霍亂弧菌的存在。所以，這些本領域技術人員所了解的改變和慣用手段的替換也落入本發明的保護范圍內。本發明的保護范圍應由所附的權利要求書所限定。序列表〈110〉蔡劍平〈120>0139群霍亂弧菌的特異性檢測用組合物和試劑盒〈130>DF10-081416〈160>6〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>tgatgttgtgggataagcaatctt24〈210>2〈211>20〈212>DNA<213>霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>ctcagcaatgcggtggtcta20〈210>3〈211〉26〈212〉DNA〈213>霍亂弧菌(Vibriochlorae)<400〉aacccgcccttctaatg'aacacgcca26〈210〉4〈211〉22<212〉DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400〉atgccaagaggacagagtgagt22〈210〉5〈211〉28〈212〉DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400〉tcaaactaattgaggtggaaacatatcc28〈210〉6〈211〉30〈212〉DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)<400〉tcgtgcctaacaaatcccgtctgagttcct30權利要求一種用于特異性檢測樣品中O139群霍亂弧菌的組合物，其中包括下列引物上游引物5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′，下游引物5′-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3′。2.如權利要求l所述的組合物，其中進一步包括探針5'_熒光基團-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團_3'。3.如權利要求2所述的組合物，其中所述熒光基團為Tet，所述熒光淬滅基團為ECLIPSE。4.如權利要求1所述的組合物，其中進一步包括另一對引物上游引物5'-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3'，下游引物5'-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3'。5.如權利要求4所述的組合物，其中進一步包括探針5'_熒光基團-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團_3'，和5'_熒光基團-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團_3'，并且在兩個探針中分別使用不同的熒光基團。6.如權利要求5所述的組合物，其中所述的兩對熒光基團和熒光淬滅基團為Tet和ECLIPSE,以及FAM禾PECLIPSE。7.—種用于特異性檢測樣品中0139群霍亂弧菌的試劑盒，其中包括PCR反應體系，和權利要求16中任一項所述的組合物。8.如權利要求7所述的試劑盒，其中所述PCR反應體系為實時定量PCR反應體系。9.一種特異性檢測樣品中0139群霍亂弧菌的方法，包括提取樣品中的細菌基因組DNA;使用權利要求16中任一項所述的組合物，或使用權利要求7或8所述的試劑盒，用PCR法擴增所述細菌基因組DNA;對PCR反應的結果進行分析。10.如權利要求9所述的方法，其中所述PCR法的反應條件為95±2°C預變性超過lmin，95±2。C變性超過5s，60±2°C延伸超過10s，共反應超過30個循環，最后在72士2t:下延伸超過2min;或95±2°C預變性超過lmin，95±2°C變性超過5s，60±2°C延伸超過10s，共反應超過30個循環。全文摘要本發明涉及一種O139群霍亂弧菌檢測用組合物、試劑盒和檢測方法。該組合物中包含針對產毒型O139群霍亂弧菌O抗原編碼基因rfb-O139和分泌霍亂毒素的致病毒素基因ctxA的特異性引物。本發明的組合物和試劑盒能夠靈敏地檢測出樣品存在的產毒型O139群霍亂弧菌，其檢測下限為1.0×102拷貝每反應體系。對其基因組DNA的檢測敏感度為1.0×100pg每反應體系。文檔編號C12Q1/10GK101768633SQ20081024746公開日2010年7月7日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者吳麗娟,楊輝,胡繼紅,蔡劍平,龔成申請人:蔡劍平