專利名稱：：一種α-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達的制作方法
技術領域：
：一種a-葡萄糖苷酶(簡稱AGLU酶)基因的克隆與表達，本發明屬于酶基因工程和酶工程領域。具體地說涉及一種編碼黑曲霉(^^^^7/wm'gw)WX-07AGLU酶的DNA序列及其表達。
背景技術：
：a-葡萄糖苷酶(a-glucosidase，簡稱AGLU酶，EC3.2.1.20)，又名oc-D-葡萄糖苷水解酶，它可以從低聚糖的非還原末端切割a-l，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，并將游離的葡萄糖基以a-l，6糖苷鍵形式轉移到其他糖底物上，形成具有非發酵性的功能性低聚糖——低聚異麥芽糖(簡稱IMOs，主要包括異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖等)。低聚異麥芽糖是一類含有至少一個a-(1，6)糖苷鍵的低聚糖，主要是異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖，天然少量存在于醬油，蜂蜜中，它己經慢慢被用來替代傳統的蔗糖作為食品添加劑。它被攝入人體后不會被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被腸道的益生菌如雙歧桿菌作為碳源利用，故其具有良好的雙歧因子作用，可以改善人體腸道的功能。此外，由于低聚異麥芽糖的甜度只有普通糖的一半，可以有效防止兒童齲齒，適宜糖尿病人食用，可以作為飲料糖果和保健品的添加劑。在飼料工業中，低聚異麥芽糖被認為可以在提高家禽存活率的同時，又不會存在合成詞料帶來對人體的副作用，據報道，日本50%左右的飼料中都含有低聚異麥芽糖。目前，低聚異麥芽糖已經在食品、醫藥和詞料加工行業有了很廣泛的應用。生產AGLU酶的微生物種類有細菌、曲霉、古細菌等。現在工業上生產環糊精所使用的AGLU酶主要來自黑曲霉。目前，黑曲霉的AGLU酶的編碼基因(ag/"基因)得到了克隆，但是成功的都是采用曲霉屬作為宿主。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生產能力普遍較低，為了克服野生菌株的低生產能力，國內外研究者通過構建基因工程菌生產重組AGLU酶。在國內，對a-葡萄糖苷酶的研究還主要在a-葡萄糖苷酶的生產菌種選育和酶學性質方面，雖然有通過RT-PCR方法擴增得到A"/^ra-葡萄糖苷酶cDNA，構建重組質粒并嘗試在大腸桿菌中表達，但酶表達量偏低，而且重組蛋白是胞內酶，分離純化的成本相對高。迄今為止，國內生產低聚異麥芽糖用(x-葡萄糖苷酶主要依賴日本進口，為了降低低聚異麥芽糖的商業成本，首先必須降低a-葡萄糖苷酶的生產成本。^^7^gz7/w是最常用的a-葡萄糖苷酶的生產菌株，但同樣存在生產能力較低的缺陷。在國內的報道中，重組a-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中一般定位于胞內形成包涵體或存在于周質中，不利于重組a-葡萄糖苷酶的回收與使用。因此，構建重組菌大規模生產胞外a-葡萄糖苷酶，對降低a-葡萄糖苷酶的生產成本顯得非常重要。
發明內容本發明的一個目的是提供一種a-葡萄糖苷酶，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本發明的另一個目的是提供一種編碼該a-葡萄糖苷酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本發明的再一個目的是提供包含本發明基因的表達宿主細胞。本發明的技術方案一種a-葡萄糖苷酶，縮寫為AGLU酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。所述的(x-葡萄糖苷酶的基因，縮寫為基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。所述的ag/w基因的表達方法由黑曲霉0^/^^'〃^w'ger)WX-07總DNA獲得ag/w的cDNASEQIDNO:l，ag/w基因以質粒pPIC9K為表達載體，以畢赤酵母KM71為表達宿主，實現ag/w基因的可溶性表達；(1)黑曲霉G^;erg/〃^WX-07總DNA的提取黑曲霉WX-07菌株在YPD液體培養基中培養2天，菌絲體過濾，再用無菌水沖洗三次，用無菌濾紙吸干水分，將菌絲體轉入研缽內，加液氮研磨得菌粉，將菌粉放入事先稱重的50mL離心管中，稱量lg菌粉，將由8.1816gNaCl、2g十二垸基磺酸鈉、lOmL500mmoL/LEDTA、5mLlmol/LTris-HCl緩沖液加水定容到lOOmL組成的抽提緩沖液在65"C水浴中預熱，按3mL/g菌粉加入抽提緩沖液，用封口膜封住，65"放置lh，得菌液；吸取1.5mL菌液于滅菌的1.5mL離心管中，平行2管，10000r/min離心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL離心管中，加入0.75mL由50mL10%CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mLlmol/LTris-HCl定容到lOOmL的5xCTAB溶液，然后再每管分成兩管，每管取0.6mL，分別加入0.6mL的酚/氯仿/異戊醇體積比25:24:1混合溶液，混勻，10000r/min離心10min;上清液吸入另一批新的離心管中，棄下層油相及中層蛋白；在這批離心管中分別加入等體積，0.4mL氯仿/異戊醇體積比24:l混合溶液，顛倒混勻，10000r/min離心10min，吸取上清，重復以上步驟，直至無蛋白；加入等體積0.3mL異丙醇至上清液中，充分混勻，-20"C過夜，第二天，10000r/min，棄上清；用現配的70%的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用無水乙醇洗沉淀l次，倒掉乙醇，室溫干燥20-30min;加50pL無菌水溶解沉淀，-20°<3凍存；(2)a-葡萄糖苷酶編碼基因的克隆以黑曲霉WX-07總DNA為模版，由于ag/w基因是有四個外顯子和三個內含子，所以通過PCR和over-lapPCR擴增出ag/w基因，以下列八個核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點Mn:弓I物1:5，-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3'引物2:5，-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3'弓(物3:5，-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA畫3'引物4:5，-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC畫3'引物5:5，-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3'引物6:5，-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC畫3'弓I物7:5，-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3'引物8:5，-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3，第一輪PCR:以黑曲霉WX-07總DNA為模板，分別以P1、P2;P3、P4;P5、P6;P7、P8為上下游引物，擴增出exonl，exon2，exon3，exon4;PCR反應在50|aL體系中進行5xPCR緩沖液10|iL，2.5mmol/LdNTPs4^iL，10pmol/L上下游引物各1pL，模板DNAliaL，Taq酶0.5^L，加雙蒸水至總體系50|iL;PCR反應條件為在94。C變性4min后開始循環，然后94'C變性lmin，55。C退火lmin，72。C分別延伸1min、1min、1min禾n3min，共35個循環后，再于72'C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109,轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37。C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第二輪PCR:以exon2和exon3為模板，以P3、P6為上下游引物，擴增得到exon2-3;PCR反應在50|iL體系中進行5xPCR緩沖液10(iL，2.5mmol/LdNTPs4^L,10,ol/L上下游引物各1(iL，exon2和exon3各1pL，Taq酶0.5nL，加雙蒸水至總體系50^L;PCR反應條件為在94。C變性4min后開始循環，然后94。C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸1min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37'C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第三輪PCR:以exon2-3和exon4為模板，以P3、P8為上下游引物，擴增得到exon2-3-4;PCR反應在50jiL體系中進行5xPCR緩沖液10^L，2.5mmol/LdNTPs4^L，10pmol/L上下游引物各1pL，exon2-3和exon4各1|止，Taq酶0.5|止，加雙蒸水至總體系50(lL;PCR反應條件為在94"變性4min后開始循環，然后94。C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸3min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37。C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第四輪PCR:以exon1和exon2-3-4為模板，以P1、P8為上下游引物，擴增得到exon1-2-3-4;PCR反應在50|aL體系中進行5xPCR緩沖液10jxL，2.5mmol/LdNTPs4^L，10pmol/L上下游引物各1pL，exon1和exon2-3-4各1(iL，Taq酶0.5(iL，加雙蒸水至總體系50^L;PCR反應條件為在94"C變性4min后開始循環，然后94'C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸4min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到全基因exon1-2-3-4片段2880bp，割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37。C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，命名為ag/w/pMD18-Tsimple,將此質粒進行序列測定；(3)ag/w基因在表達載體上的構建用于構建表達載體的質粒是pPIC9K，帶有ff-F"ctor信號肽，將pPIC9K質粒和擴增的ag^基因進行iVofl酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶16匸連接過夜，連接產物轉化Eco//JM109感受態細胞，經37。C培養過夜，挑選轉化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板進行液體培養，然后抽提質粒，得到富集的ag/w/pPIC9K質粒；(4)畢赤酵母菌KM71轉化和篩選重組菌將表達載體ag/w/pPIC9K17|aL，10xHbuffer2，BglIIl(iL，37。C酶切1.5h后回收含有目的基因的條帶，溶于20無菌水中，得到線性化的DNA;在80iiL畢赤酵母KM71感受態細胞中加入2pL線性化的DNA，混勻，轉入1mm預冷的電轉杯中，將電轉化儀調至畢赤酵母檔，電激，轉化物中加入1mLlmol/L的山梨醇，30°C溫育lh，取200pL的山梨醇重懸液涂布MD平板，30。C培養72小時；挑取回復突變菌株接種于YPD/G418平板上，3(TC培養48h至長出單菌落，為獲得多拷貝的ag/"基因的菌株，G418濃度篩選梯度依次為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL;pPIC9K空質粒同上處理，所得轉化菌作為陰性對照；(5)重組畢赤酵母KM71/pPIC9K-aglu的PCR鑒定選取含4mg/mLG418的YPD/G418上單菌落，以引物1，引物8作為引物，用前述的PCR方法，檢驗是否能夠擴增得到全長exon1-2-3-4片段；重組畢赤酵母KM71/pPIC9K的PCR鑒定作為對照；鑒定后獲得正確的重組畢赤酵母KM71/g/w/pPIC9K用于后續實驗；(6)重組畢赤酵母的培養將鑒定正確的單菌落KM9K接種至10mLYPD培養基，30°C培養24h，lmL培養液接入50mLBMGY，30。C培養24h，至OD為4.0，離心收集菌體，用25mLBMMY培養基重懸培養，甲醇誘導表達，分別于24h、48h、72h禾n96h取樣，每次取樣200pL，離心收集上清，并補加250nL甲醇至終濃度1%;陰性對照重組畢赤酵母KM71/pPIC9K培養方法同上；(7)重組cx-葡萄糖苷酶的檢測SDS-PAGE檢測表達產物在98和33kDa有條帶，收集畢赤酵母發酵培養的上清液，硫酸銨沉淀，透析，制成粗酶液，測定酶活方法如下用pH5的醋酸鈉緩沖液配制10。/。的麥芽糖溶液10mL，50jiL粗制的濃縮酶液，60"C反應24h，然后煮沸2min，微孔過濾，HPLC檢測產物，與市售的低聚異麥芽糖產品IMO-900比較各成分組成；液相檢測顯示有轉糖苷產物異麥芽糖、潘糖生成。本發明的有益效果本發明提供了ag/w基因的高效表達方法。提取A"/gwWX-07總DNA，設計引物PCR和overlapPCR得到編碼AGLU酶的基因，它具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，全長2S80bp個核苷酸，編碼960個氨基酸。以質粒pPIC9K為表達載體整合到表達宿主畢赤酵母KM71，可實現ag/w基因的胞外表達，重組酶具有轉糖苷活性。圖1PCR和overlap-PCR的過程。圖2重組AGLU酶SDS-PAGE圖譜。具體實施例方式實施例1本實施例說明黑曲霉(A/e^〃wsWX-07總DNA的提取黑曲霉WX-07菌株在YPD液體培養基中培養2天，菌絲體過濾，再用無菌水沖洗三次，用無菌濾紙吸干水分，將菌絲體轉入研缽內，加液氮研磨得菌粉，將菌粉放入事先稱重的50mL離心管中，稱量lg菌粉，將由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸鈉、10mL500mmoL/LEDTA、5mLlmol/LTris-HCl緩沖液加水定容到lOOmL組成的抽提緩沖液在65'C水浴中預熱，按3mL/g菌粉加入抽提緩沖液，用封口膜封住，65'C放置lh，得菌液；吸取1.5mL菌液于滅菌的1.5mL離心管中，平行2管，10000r/min離心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL離心管中，加入0.75mL由50mL10%CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mLlmol/LTris-HCl定容到100mL的5xCTAB溶液，然后再每管分成兩管，每管取0.6mL，分別加入0.6mL的酚/氯仿/異戊醇體積比25:24:1混合溶液，混勻，10000r/min離心10min;上清液吸入另一批新的離心管中，棄下層油相及中層蛋白；在這批離心管中分別加入等體積，0.4mL氯仿/異戊醇體積比24:1混合溶液，顛倒混勻，10000r/min離心10min，吸取上清，重復以上步驟，直至無蛋白；加入等體積0.3mL異丙醇至上清液中，充分混勻，-2(TC過夜，第二天，10000r/min，棄上清；用現配的70%的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用無水乙醇洗沉淀l次，倒掉乙醇，室溫干燥20-30min;加50pL無菌水溶解沉淀，-20"凍存；實施例2本實施例說明AGLU酶編碼基因的克隆程序。以黑曲霉WX-07總DNA為模版，由于基因是有四個外顯子和三個內含子，所以通過PCR和over-lapPCR擴增出ag/w基因，以下列八個核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點A^I:引物1:5，-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3'引物2:5，-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3'引物3:5，-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA-3，引物4:5,-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3'引物5:5，-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3'引物6:5，-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC畫3'弓I物7:5，-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3'引物8:5，-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3'第一輪PCR:以黑曲霉WX-07總DNA為模板，分別以P1、P2;P3、P4;P5、P6;P7、P8為上下游引物，擴增出exonl，exon2，exon3，exon4;PCR反應在50pL體系中進行5xPCR緩沖液10|iL，2.5mmol/LdNTPs4^L，10|iimol/L上下游引物各1iliL，模板DNAljiL，Taq酶0.5jiL，加雙蒸水至總體系50pL;PCR反應條件為在94i:變性4min后開始循環，然后94。C變性lmin，55。C退火lmin，72。C分別延伸1min、1min、1min和3min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-T5simple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37"C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第二輪PCR:以exon2和exon3為模板，以P3、P6為上下游引物，擴增得到exon2-3;PCR反應在50jaL體系中進行5xPCR緩沖液102.5mmol/LdNTPs4l止，10jimol/L上下游引物各1^L，exon2和exon3各1pL，Taq酶0.5)iL，加雙蒸水至總體系50|lL;PCR反應條件為在94"C變性4min后開始循環，然后94'C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸1min，共35個循環后，再于72'C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37'C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第三輪PCR:以exon2-3和exon4為模板，以P3、P8為上下游引物，擴增得到exon2-3-4;PCR反應在50|iL體系中進行5xPCR緩沖液10(iL，2.5mmol/LdNTPs4(iL，10pmol/L上下游引物各1(iL，exon2-3禾卩exon4各1(_iL，Taq酶0.5(iL，加雙蒸水至總體系50^L;PCR反應條件為在94'C變性4min后開始循環，然后94。C變性lmin，55。C退火lmin，72"C延伸3min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37'C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第四輪PCR:以exonl和exon2-3-4為模板，以Pl、P8為上下游引物，擴增得到exon1-2-3-4;PCR反應在50(iL體系中進行5xPCR緩沖液10(xL，2.5mmol/LdNTPs4^L，10pmol/L上下游引物各1jiL，exon1和exon2-3-4各1pL，Taq酶0.5|uL，加雙蒸水至總體系50^L;PCR反應條件為在94"C變性4min后開始循環，然后94'C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸4min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到全基因exon1-2-3-4片段2880bp，割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37。C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，命名為ag/w/pMD18-Tsimple,將此質粒進行序列測定；將此質粒進行序列測定，結果表明插入片段含有一個長2880bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個由960個氨基酸編碼的蛋白質。實施例3本實施例說明ag/"基因在表達載體上的構建程序。用于構建表達載體的質粒是pPIC9K，帶有dactor信號肽，將pPIC9K質粒和擴增的"g/w基因進行A^I酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶16。C連接過夜，連接產物轉化五.co//JM109感受態細胞，經37'C培養過夜，挑選轉化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板進行液體培養，然后抽提質粒，得到富集的ag/"/pPIC9K質粒；實施例4本實施例說明畢赤酵母宿主轉化和篩選重組菌的程序。將表達載體ag/w/pPIC9K17pL，10xHbuffer2(iL，BglII1(iL，37。C酶切1.5h后回收含有目的基因的條帶，溶于20pL無菌水中，得到線性化的DNA;在80pL畢赤酵母KM71感受態細胞中加入2|iL線性化的DNA，混勻，轉入1mm預冷的電轉杯中，將電轉化儀調至畢赤酵母檔，電激，轉化物中加入1mLlmol/L的山梨醇，30°C溫育lh，取200的山梨醇重懸液涂布MD平板，30。C培養72小時；挑取回復突變菌株接種于YPD/G418平板上，30。C培養48h至長出單菌落，為獲得多拷貝的ag/"基因的菌株，G418濃度篩選梯度依次為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL;pPIC9K空質粒同上處理，所得轉化菌作為陰性對照；實施例5本實施例說明AGLU酶的轉糖苷活性。將上述AGLU酶發酵液于4°C、10000rpm離心20min除菌體；上清液中加入70°/。固體硫酸銨鹽析過夜，4。C、10000rpm離心20min，取沉淀物用適量pH5的醋酸緩沖液溶解，并在緩沖液中透析過夜，制成粗酶液。SDS-PAGE檢驗表達產物，結果如圖2。用pH5的醋酸緩沖液配制10%的麥芽糖溶液，加入0.5%粗制的濃縮酶液，60。C下反應24h然后煮沸5min，微孔過濾，HPLC檢測產物。高效液相色譜分析的條件示差折光檢測器，色譜柱(I):鈣型強堿性離子交換樹脂SugarPakl1300mmX6.5mm;柱溫85。C;池溫(檢測器)30。C;流動相水；流速0.5mL/min;進樣量10(iL。色譜柱(II):HypersilNH2，250mmX4.6mm;柱溫30°C;池溫(檢測器)30°C;流動相乙腈/水(75/25V/V);流速lmL/min;進樣量10pL。表1重組AGLU酶的轉糖苷反應產物<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1、低聚異麥芽糖(IMO-900);2、重組酶的轉糖苷產物；G，M，12，P，I3，I4分別代表葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖和四糖以上低聚異麥芽糖。序列表<210〉SEQIDNO:1<211>2880<212〉DNA<213〉黑曲霉(JweA^'〃^WX-07<400>1tccaccactggctgattgccC33ggC11C￡LcetggccatgtggattcggatttggtactttatCCC￡Lg￡LgCccgaaaggcttcaattcatcgcatatcacgtggaacacctctcgcaagstgatactcctcctt.ctactcaattaxcggcccbsctggtegatatstctggtegettttecctatgtatccctacgctacgcctctatattggcggttgactgtgtggtaccctgactctg6Ltatg3ttacgggagcttccgcgg已c已acgtga^cca^gEL已tggtgttgagCC33ggtctgcttcgctggcgtccatgtaxtggtgcggscgcaactgtccggagecttatccccttcgtca^catcgatg認agtgcagcaacgtataxgcgactgaatacttteggaaaggcctttttgaxaggcgacggaatttgtgacaattccgccattgaccaaagataggcagatatatctccceggtctC3a3ggccccgcccatgcagcaatgatctggegg已ccg已tattgtacagtgaggattgttgatgggsgccgtttttctgggctagacatgtctgaacccggcacccagaggcttagtcaggctgcccacgcctgggecatgatcg已gt已tgatgcttgsggtcttactccatct3CCtgtgggtgcattcttcccggtgggcttcgcagtttacatcctcaggcacaattcacggcaxagatgtttcagattctacctggtccctgtcatggtccgcttttcagccgcgctccctccagagaaaacctctacggatgggtcttatctctcatgga.attgatctgeggecgatgt￡lc￡mcactctaegttgttgctacatgeagcgatgaattcggcgctctag3gcggcgg3ggecaggataacgagcttgtaagtttcatcacccatcgtttcaatatcaccagcaaccgcgtgtccgcaatcagtgtccatgcacggtctggtctcataagggcaggecacgcgagccctttMCggaMcattctaccgctgttattgeicattcctgctteegcagstgteggtgegeaGOtgccgacgcgcagtcggtttgtcegggcta120tgggttcactgccagtcttcagetcgeggg180tgagtccttgacactgtctgtggagtacca240ccccactcatgttgactccacaaacgcttc300cagaxecaaggcttccctcaatgcatctgt360aaatgagccgtegttcaatttcaaggtgat420tacagaaggcactgtgctcgtatatgagaa480tgaagaatataacttgtatggccttgggga540tgctaatctgaccatatatcetteggatga600ccaacatcccttctatctggatacaagata660tattcccgtcaaaagcagcgaggctgatgc720cgtgtttctgaggaaxtctcatggacttga780gcggaccctsggtggaggaatcgatctcac840taccaggcaatatcttaccagcactgtggg900tggattccaccaatgtcgttggggctacaa960gaattttgagaagtttgagatcccgttgga1020eggatategeaactttgacaacgatcaaca1080tctcagcaagctaxatgagagtggacgcta1140cattcctaatcccgaaaatgcctctgatgc1200egaegtcttcctcaagaatcccgatggtag1260tacagtcttccccgattggcatcatcccaa1320tatctggtcgaagaaagtggcgttcgatgg1380cttctgtgtcgggagctgtggcacaggtaa1440tcttctccccggtgagcctggtgatatcat1500caaegctatagaggeggegtcagcttcggc1560gaccaccacgtegactteggtatcatatct1620tgttgagcacccaccctatgtgatcaacca1680tgcggtgtcgccgaatgcaacgcatgttga1740ctacggacatcaaggattgaacgctaccta1800gcggcggccatttattattggccgctcaac1860ctggggcggcgacaactattccaaatggtg1920ctccttctcaetttteggeattccgatgtt1980ctccgatgaggagetctgeaaccgatggat2040aaaccacaatgagctctccacaatcccaca2100agcaaccaagtccgccatgagaattcggta2160cgccatccta3atgcgcgcs己ttcatggttc已agggcgtatgcagttgatagttt￡ltgt￡Lagcccggcaagcagctctgtacggcatcgccttgctaatgcaggccgtatgggctgc犯accttacttttctttcctggggggccggccattcccaggaggcgaagcccgcgaggtggaaaccccgtgggctcgatgatgggtcaagccttgacggtgctttcccgggtcacttgacgaaatacgttgtttcatggtggtttggacatgggggtcaacacaxatcttgccctttgctagcgagagagcatgcgctcgtcgcggagtgaactgtcacgtacgggcggcgcatgacctggcctg3cccaax3cccggtattgcgaagtgtggg3CC3tttegg￡LtgCa^g￡lgtgcactaggactactccsatgCtC3agggL3a^ggsgcectaattetaegttgggcgg3犯cEicaccacggttggctgc已ggagectctggtacgattggtgcaccattggceggcattgagccaccctccctgcggtgaccccaggttctactgggtattgctcc&ctgt2220ttgagactca2280teaataeggt2340acacccaggc2400gccacatccc2460ccactcgtga2520ccgcgtcggg2580atgtggactc2640gaggaacccg2700cctg已atgga2760ctttgttggg2820gga^tggt已g2880<210〉SEQIDNO:2<211>960<212>PRT<213>黑曲霉(y^;^^///^m;^r)WX-07<400>2SerThrThrAlaAlaAspValGlyAlaAlaAspAlaValGinHisAsnGlyArgProCysLeuSerValGluLeuProThrHisSerGluAsnLeuValSerGinSerPro5Ala20Gin35Ser50Asn65Tyr80Val95Val110Gly125SerGinProGinGinLeulieAlaSerValCysProArgGlyPheThrValTyrGlyThrGinAspSerAspAspSerThrAsnProArgProLysLeuPheValSerPheThrlieProAlaSer1015AsnlieAspAspProGin2530GlyTyrLysAlaSerLys4045AlaSerL>euGinLeuAla5560AspValGluSerLeuThr7075ArgLeuAsnlieGinlie8590AlaSerTrpTyrPheLeu100105AlaSer!>euAsnAlaSer115120TrpSerAsnGluProSer130135PheAsnPheLysVal140SerThrGluGlyThr155PheValThrAlaLeu170GluHislieThrGin185lieTyrProSerAsp200GlyGinHisProPhe215ArgGinAsnGlySer230AlaSerGinAspTyr245AsnSerHisGlyLeu260TrpArgThrLeuGly275ProAlaProAlaAsp290GlyLeuProAlaMet305CysArgTrpGlyTyr320AlaAsnPheGluLys335AsplieAspTyrMet350HisArgPheSerTyr365HisGluSerGlyArg380lieArgLysAlaThr145ValLeuValTyrGlu160ProGluGluTyrAsn175PheArgLeuGinArg190AspGlyThrProlie205TyrLeuAspThrArg220TyrlieProValLys235lieSerLeuSerHis250GlulieLeuLeuArg265GlyGlylieAspLeu280ValThrArgGinTyr295GinGinTyrAsnThr310AsnAsnTrpSerAsp325PheGlulieProLeu340HisGlyTyrArgAsn355SerGluGlyAspGlu370TyrTyrValSerlie385GlyAspAlaLeuPhe150AsnGinPhelieGlu165LeuTyrGlyLeuGly180AsnAlaAsnLeuThr195AspGinAsnLeuTyr210TyrTyrLysGlyAsp225SerSerGluAlaAsp240GlyValPheLeuArg255SerGinLysLeulie270ThrPheTyrSerGly285LeuThrSerThrVal300LeuGlyPheHisGin315LeuAlaAspValVal330GluTyrlieTrpThr345PheAspAsnAspGin360PheLeuSerLysLeu375ValAspAlaAlaLeu390TyrlieProAsnPro395AspArgGlyAlaAla410SerLeuTyrlieGly425AspTrpHisHisPro440VallieTrpSerLys455MetSerGluValSer470AsnLeuThrLeuAsn485GluProGlyAsplie500ThrAsnAlalieGlu515GinAlaAlaAlaThr530LeuArgThrThrPro545ProTyrVallieAsn560HisAlaValSerPro575TyrAspValHisGly590TyrGinGlyLeuLeu605lielieGlyArgSer620HisTrpGlyGlyAsp,635GluAsnAlaSerAsp400AspAspValPheLeu415AlaValTrpProGly430LysAlaValAspPhe445LysValAlaPheAsp460SerPheCysValGly475ProAlaHisProSer490lieTyrAspTyrPro505AlaAlaSerAlaSer520AlaThrThrThrSer535ThrProGlyValArg550HisAspGinGluGly565AsnAlaThrHisVal580LeuTyrGlyHisGin595GluValTrpSerHis610ThrPheAlaGlySer625AsnTyrSerLysTrp640AlaTyrAlaThrTyr405LysAsnProAspGly420TyrThrVslPhePro435TrpAlaAsnGluLeu450GlyValTrpTyrAsp465SerCysGlyThrGly480PheLeuLeuProGly495GluAlaPheAsnlie510AlaGlyAlaSerSer525ThrSerValSerTyr540AsnValGluHisPro555HisAspLeuSerVal570AspGlyValGluGlu585GlyLeuAsnAlaThr600LysArgArgProPhe615GlyLysTrpAlaGly630TrpSerMetTyrTyr645SerlieSerArgAla650PheGlyAlaAspThr665LeuCysAsnArgTrp680ArgAsnHisAsnGlu695TrpAlaSerVallie710TyrAlalieLeuPro725ThrThrGlySerThr740AsnAspProThrLeu755ProAlalieMetVal770ValLysGlyValPhe785AspTrpTyrThrGin■ThrThrlieSerAla815GlyGlyAsnlieLeu830GluAlaArgGinThr845AsnGlyThrAlaSer860lieTyrSerAsnAla875SerSerLeuArgSer890LeuSerPheSerLeu655CysGlyPheAsnGly670MetGinLeuSerAla685LeuSerThrliePro700GluAlaThrLysSer715TyrPheTyrThrLeu730ValMetArgAlaLeu745AlaAlaValGluThr760ValProValLeuGlu775ProGlyValGlyHis790AlaAlaValAspAla805ProLeuGlyHislie820ProMetGinGluPro835ProTrpAlsLeuLeu850GlyGinLeuCysLeu865ThrLeuHisValAsp880SerAlaGinGlyArg895PheGlylieProMet660AsnSerAspGluGlu675PhePheProPheTyr690GinGluProTyrArg705AlaMetArglieArg720PheAspLeuAlaHis735SerTrpGluPhePro750GinPheMetValGly765ProLeuValAsnThr780GlyGluValTrpTyr795LysProGlyValAsn810ProValTyrVaJArg825AlaLeuThrThrArg840AlaAlaLeuGlySer855AspAspGlyGluSer870PheThrAlaSerArg885TrpLysGluArgAsn900ProLeuAlaAsnValThrValLeuGlyValAsnLysGluProSer905910915AlaValThrLeuAsnGlyGinAlaValPheProGlySerValThr920925930TyrAsnSerThrSerGinValLeuPheValGlyGlyLeuGinAsn935940945LeuThrLysGlyGlyAlaTrpAlaGluAsnTrpValLeuGluTrp950955960權利要求1、一種α-葡萄糖苷酶，縮寫為AGLU酶，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2、一種編碼權利要求1所述的ct-葡萄糖苷酶的基因，縮寫為ag/"基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。3、一種如權利要求2所述的a-葡萄糖苷酶基因的表達方法，其特征是由黑曲霉WX-07總DNA獲得ag/w的cDNASEQIDNO:1，ag/w基因以質粒pPIC9K為表達載體，以畢赤酵母KM71為表達宿主，實現"g/w基因的可溶性表達；(1)黑曲霉WX-07總DNA的提取黑曲霉WX-07菌株在YPD液體培養基中培養2天，菌絲體過濾，再用無菌水沖洗三次，用無菌濾紙吸干水分，將菌絲體轉入研缽內，加液氮研磨得菌粉，將菌粉放入事先稱重的50mL離心管中，稱量lg菌粉，將由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸鈉、10mL500mmoL/LEDTA、5mLlmol/LTris-HCl緩沖液加水定容到100mL組成的抽提緩沖液在65'C水浴中預熱，按3mL/g菌粉加入抽提緩沖液，用封口膜封住，65r放置lh，得菌液；吸取1.5mL菌液于滅菌的1.5mL離心管中，平行2管，10000r/min離心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL離心管中，加入0.75mL由50mL10%CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mLlmol/LTris-HCl定容到100mL的5xCTAB溶液，然后再每管分成兩管，每管取0.6mL，分別加入0.6mL的酚/氯仿/異戊醇體積比25:24:1混合溶液，混勻，10000r/min離心10min;上清液吸入另一批新的離心管中，棄下層油相及中層蛋白；在這批離心管中分別加入等體積、0.4mL氯仿/異戊醇體積比24:l混合溶液，顛倒混勻，10000r/min離心10min，吸取上清，重復以上步驟，直至無蛋白；加入等體積0.3mL異丙醇至上清液中，充分混勻，-20。C過夜，第二天，10000r/min，棄上清；用現配的70%的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用無水乙醇洗沉淀l次，倒掉乙醇，室溫干燥20-30min;加50^L無菌水溶解沉淀，-20"凍存；(2)a-葡萄糖苷酶編碼基因的克隆以黑曲霉WX-07總DNA為模版，由于"g/w基因是有四個外顯子和三個內含子，所以通過PCR和over-lapPCR擴增出ag/w基因，以下列八個核苷酸序列作為引物，下劃線為酶切位點A^I:引物1:5，-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3'引物2:5，-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3'弓I物3:5,-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA隱3'引物4:5，-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3，引物5:5，誦GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3'引物6:5，-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC-3'弓I物75，-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3'引物8:5，-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTT丁CC-3'第一輪PCR:以黑曲霉WX-07總DNA為模板，分另I似P1、P2;P3、P4;P5、P6;P7、P8為上下游引物，擴增出exonl，exon2，exon3，exon4;PCR反應在50pL體系中進行5xPCR緩沖液10(iL，2.5mmol/LdNTPs4^L，lO^mol/L上下游引物各1iiL，模板DNAlpL，Taq酶0.5^tL，加雙蒸水至總體系50iiL;PCR反應條件為在94。C變性4min后開始循環，然后94。C變性lmin，55°。退火lmin，72。C分別延伸1min、1min、1min和3min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37。C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第二輪PCR:以exon2和exon3為模板，以P3、P6為上下游引物，擴增得到exon2-3;PCR反應在50[iL體系中進行5xPCR緩沖液10[iL,2.5mmol/LdNTPs4)iL，10jdmol/L上下游引物各1jiL，exon2禾卩exon3各1|iL，Taq酶0.5(iL，加雙蒸水至總體系50JlL;PCR反應條件為在94"C變性4min后開始循環，然后94。C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸1min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109,轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37"C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第三輪PCR:以exon2-3和exon4為模板，以P3、P8為上下游引物，擴增得到exon2-3-4;PCR反應在50jiL體系中進行5xPCR緩沖液10(xL，2.5mmol/LdNTPs4|iL，10|imol/L上下游引物各1nL，exon2-3和exon4各1joL，Taq酶0.5)iL，加雙蒸水至總體系50^L;PCR反應條件為在94。C變性4min后開始循環，然后94。C變性lmin，55"C退火lmin，72。C延伸3min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到PCR片段，分別割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37。C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，將此質粒進行序列測定；第四輪PCR:以exon1和exon2-3-4為模板，以Pl、P8為上下游引物，擴增得到exon1-2-3-4;PCR反應在50fiL體系中進行5xPCR緩沖液10pL，2.5mmol/LdNTPs4|iL，10pmol/L上下游引物各1|iL，exon1和exon2-3-4各1jiL，Taq酶0.5|iL，加雙蒸水至總體系50^L;PCR反應條件為在94"變性4min后開始循環，然后94"C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸4min，共35個循環后，再于72。C延伸10min，擴增得到全基因exon1-2-3-4片段2880bp，割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37r培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，810h后提取質粒，命名為ag/w/pMD18-Tsimple,將此質粒進行序列測定；(3)ag/w基因在表達載體上的構建用于構建表達載體的質粒是pPIC9K，帶有"-i^"w信號肽，將pPIC9K質粒和擴增的ag/"基因進行M^I酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶16"連接過夜，連接產物轉化Eco//JM109感受態細胞，經37。C培養過夜，挑選轉化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板進行液體培養，然后抽提質粒，得到富集的ag/w/pPIC9K質粒；(4)畢赤酵母菌KM71轉化和篩選重組菌將表達載體ag/w/pPIC9K17fiL，10xHbuffer2^L，BglII1(iL，37。C酶切1.5h后回收含有目的基因的條帶，溶于20pL無菌水中，得到線性化的DNA;在80pL畢赤酵母KM71感受態細胞中加入2線性化的DNA，混勻，轉入lmm預冷的電轉杯中，將電轉化儀調至畢赤酵母檔，電激，轉化物中加入lmLlmol/L的山梨醇，30°C溫育lh，取200pL的山梨醇重懸液涂布MD平板，30。C培養72小時；挑取回復突變菌株接種于YPD/G418平板上，30。C培養48h至長出單菌落，為獲得多拷貝的"g/"基因的菌株，G418濃度篩選梯度依次為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL;pPIC9K空質粒同上處理，所得轉化菌作為陰性對照；(5)重組畢赤酵母KM71/ag/w/pPIC9K的PCR鑒定選取含4mg/mLG418的YPD/G418上單菌落，以引物1，引物8作為引物，用前述的PCR方法，檢驗是否能夠擴增得到全長exon1-2-3-4片段；重組畢赤酵母KM71/pPIC9K的PCR鑒定作為對照；鑒定后獲得正確的重組畢赤酵母KM71/ag/w/pPIC9K用于后續實驗；(6)重組畢赤酵母的培養將鑒定正確的單菌落KM71/ag/w/pPIC9K接種至10mLYPD培養基，30。C培養24h，lmL培養液接入50mLBMGY，30T培養24h，至OD為4.0，離心收集菌體，用25mLBMMY培養基重懸培養，甲醇誘導表達，分別于24h、48h、72h和96h取樣，每次取樣200iaL，離心收集上清，并補加250甲醇至終濃度1%;陰性對照重組畢赤酵母KM71/pPIC9K培養方法同上；(7)重組(x-葡萄糖苷酶的檢測SDS-PAGE檢測表達產物在98kDa和33kDa有條帶，收集畢赤酵母發酵培養的上清液，硫酸銨沉淀，透析，制成粗酶液，測定酶活方法如下用pH5的醋酸鈉緩沖液配制10%的麥芽糖溶液10mL，加50)iL粗制的濃縮酶液，60°C反應24h，然后煮沸2min，微孔過濾，HPLC檢測產物，與市售的低聚異麥芽糖產品IMO-900比較各成分組成；液相檢測顯示有轉糖苷產物異麥芽糖、潘糖生成。全文摘要α-葡萄糖苷酶(簡稱AGLU酶)基因的克隆與表達，屬于酶基因工程和酶工程領域。本發明由黑曲霉(A.niger)WX-07總DNA獲得aglu基因SEQIDNO1，aglu的cDNA以質粒pPIC9K為表達載體，以畢赤酵母(P.pastoris)為表達宿主，實現aglu基因在胞外的可溶性表達；該aglu的cDNA全長2880個核苷酸，編碼960個氨基酸，構建了真核表達質粒，轉化PichiapastorisKM71表達AGLU酶。重組酶具有轉苷活性，能將麥芽糖轉糖苷生成低聚異麥芽糖。此酶適合食品、飼料、醫藥等工業應用的需要，能用于低聚異麥芽糖的工業生產。文檔編號C12N1/19GK101434943SQ20081024446公開日2009年5月20日申請日期2008年12月5日優先權日2008年12月5日發明者敬吳,星童,堅陳申請人:江南大學