專利名稱：：擬除蟲菊酯類殺蟲劑水解酶基因的制作方法
技術領域：
：本發明涉及擬除蟲菊酯類殺蟲劑水解酶基因(亦稱降解基因)，屬于應用環境微生物領域，用于農作物及土壤中菊酯類殺蟲劑殘留的去除，生產無公害綠色農產品；同時可用于修復菊酯污染的水體等環境。
背景技術：
：農藥的使用雖然提高了農業的生產效率及作物產量，但同時帶來嚴重的環境問題，造成生態失衡農產品品質下降，并直接影響人民的身體健康。擬除蟲菊酯殺蟲劑是1974年M.Eliiott等人發現的一種高效廣譜殺蟲劑，目前，擬除蟲菊酯類殺蟲劑的年銷售額為13-14億美元，占世界農藥銷售額的20%，隨著世界各國對高毒的有機磷、有機氯殺蟲劑的限制使用，擬除蟲菊酯的使用量將進一步增加。雖然菊酯類殺蟲劑屬于低毒類殺蟲劑，但是它能損害人和動物中樞神經系統、具有致癌作用，尤其對蜜蜂、魚類等具有強烈的毒害作用。隨著近些年來環境保護的呼聲越來越高，農藥使用帶來的環境問題日益引起人們的重視。有機農業、綠色農業的興起就是在這種背景下發生的。但就目前的形勢而言，人類仍面臨饑餓、貧窮的困擾，全面實行有機農業、綠色農業生產，禁止農藥的使用是不現實的。為了達到高產高效的目標，農藥的地位在短期內是無法取代的。為了既能充分發揮農藥高效保護效果，又能夠解決農藥殘留，國內外進行了多方面的研究，提出了化學方法、物理方法、生物學方法等多種解決途徑。在這些方法中生物學方法具有無毒、無殘留、無二次污染的優勢。微生物在農藥殘留的生物學解決途徑中有著獨特的作用。利用從微生物中提取的降解酶系來消除農藥殘留在國外已有成功的先例，降解酶的來源可以通過從降解菌中提取，也可以采用基因工程手段構建高效表達菌株來獲得。將農藥殘留降解基因通過基因工程技術轉移到作物中構建轉基因作物，可以從根本上防止農藥在作物體內積累，消除農藥殘留的危害。國外已有轉抗除草劑基因水稻的報道，菊酯降解基因在該領域有巨大的應用潛力。
發明內容技術問題本發明的目的是提供擬除蟲菊酯類殺蟲劑水解酶基因(亦稱降解基因)，用于農作物及土壤中菊酯類殺蟲劑殘留的去除，生產無公害綠色農產品；同時可用于修復菊酯污染的水體等環境。技術方案菊酯類殺蟲劑水解酶基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.l。該基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為843bp，G+C含量為66.55%,編碼280個氨基酸，其氨基酸序列為SEQIDN0.2。菊酯類殺蟲劑水解酶基因片段與酶切好的PET-29a(+)進行酶連獲得含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重組質粒。酶連好的含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重組質粒轉化到表達宿主菌BL21(DE3)獲得重組微生物BL21(DE3)。上述菊酯類殺蟲劑水解酶基因可以在農作物、農產品、土壤、水體的菊酯殘留去除方面得到應用。其所涉及的菊酯水解酶可以在農作物、農產品、土壤、水體的菊酯殘留去除方面應用。有益效果1.用鳥槍法成功的從JQ1-11(5^/"gomo"ossp.JQl-ll，其GenBank注冊號為DQ132883)中克隆出菊酯降解酶基因。2.該基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為843bp，G+C含量為66.55%，編碼280個氨基酸。3.通過PCR技術擴增末端含和J力ot酶切位點的完整的菊酯水解酶基因片段，將它連接到大腸桿菌高表達載體PET-29a(+)(購自Novegen公司)的A^el和J力ol酶切位點上，轉化表達宿主菌BL21(DE3)(購自invitrogen公司)，進行IPTG誘導表達。4.本發明對菊酯水解酶基因表達的產物，做了酶活性測定，能高效的降解甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯。對100ppm上述的各類菊酯降解效果均大于93%。5.利用該基因構建的工程菌株能高效表達菊酯水解酶(活性水解酶蛋白的含量占細胞總蛋白含量的35%)，生產的酶制劑可用于土壤、蔬菜、茶葉、水果、中草藥、煙草等的農藥殘留去除，及農產品深加工中降解農藥殘留，提高產品品質及增加附加值，它比其它的降解方法更加高效、經濟、安全。并可進一步用于構建轉基因作物徹底解決植株中農藥殘留問題，生產無公害綠色農產品；同時可用于修復菊酯污染的水體等環境。圖1菊酯水解酶基因克隆的策略圖圖2菊酯水解酶基因的DNA序列圖3推測的菊酯水解酶氨基酸序列圖4菊酯水解酶基因在BL21(PET-29a(+))中高效表達實驗方案圖具體實施方式1.菊酯水解酶基因的克隆1.15^w'/^a!o朋ssp.JQ1-11(GenBank注冊號為DQ132883)總DNA的提取采用CTAB法提取高純度、大分子量的JQ1-11總DNA，溶于TE(PH8.0)中，置于_20。C保藏，具體方法參考F，奧斯伯等編的《精編分子生物學實驗指南》。1.2PUC118(SaMII)購買于寶生物工程(大連)有限公司。1.3總DNA的酶切5^i/^o膨朋ssp.JQ1-11總DNA采用Sa"3AI部分酶切。1.4DNA的回收酶切后的總DNA通過電泳(TAE緩沖液)進行純化，采用axygenbiosciences(China)回收試劑盒進行回收，回收的DNA溶于10mmol/L的TrisCI(PH8.0)中，置于-20。C保藏。1.5酶連建立如下反應體系0.ltxg0.l^g0.PUC1180MI)總DNA片段IOX連接酶緩沖液T4DNA連接酶加蒸水至16"C溫育12小時1.6制備大腸桿菌DH5a高效感受態細胞，具體方法參照J.薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。1.7轉化取10W酶連產物轉化200W感受態細胞，具體方法參照J.薩姆布魯克等編的《分子克隆實驗指南》。涂含有甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯)，農藥為甲醇或者丙酮溶解成的10，000mg/L的母液)200mg/L,Amp100mg/L的LB平板，培養24小時候挑取有透明水解圈的轉化子，即是含菊酯水解酶基因的陽性轉化子。1.8基因核苷酸序列測定寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定，菊酯類殺蟲劑水解酶基因的核苷酸序列為SEQIDNO.l，根據菊酯類殺蟲劑水解酶基因核苷酸序列所推到的280個氨基酸序列為SEQIDN0.2。2.菊酯水解酶基因在BL21(PET-29a(+))中的高效表達以左端5'-AGTCATCTCGAGCGGTAGATCAGCTCGGTCGGCT-3，和右端5，-AGTCCATATGACCGTCACCGATATCATCCTG-3，為引物，用PCR從5^M/3卵/朋assp.JQ1-11中擴增菊酯水解酶基因片段.擴增體系~(5U/u1)0.5u110XLAPCRBufferII(Mg2+Plus)5uldNTPMixture(各2.5mM)8u1模板DNA10ng引物l(20uM)lul引物2(20uM)lul滅菌蒸餾水upto50y1PCR擴增程序a.95°C變性3minb.95°C變性1.5min，58。C退火0.5min，72。C延伸1.Omin，進行30個循環c.72。C延伸10min，冷卻到室溫PCR產物用7VWel和雙酶切酶切體系A^eIIn1勘I1u1■《lug滅菌的蒸餾水upto20ul在37。C水浴中，反應3小時以上酶切產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。PET-29a(+)用7VWel和i^ol雙酶切(參考2.2)。2.3中的回收片段和2.4中酶切好的PET-29a(+)進行酶連(參考1.5)。酶連好的含菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重組質粒轉化到表達宿主菌BL21(DE3)獲得重組微生物BL21(DE3)。涂含有甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、功夫菊酯)200mg/L，Kan50mg/L，IPTG24mg/L的平板。挑取有透明水解圈的陽性轉化子。驗證陽性轉化子表達的酶對菊酯類農藥的降解功能陽性轉化子在LB培養基中培養至0D6。。0.6到0.8之間，加IPTG至濃度lmM，30°C培養4個小時。100ml菌液離心，用10ml(50mM，pH7.0)PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎(AutoScience,UH—650Bultrasonicprocessor,30%intensity)5分鐘。取200m!粗酶液加到3ml含100ppm甲氰菊酯(或氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯)的(50mM，pH7.0)PBS緩沖液中，在37°C的水浴5個小時。用6ml二氯甲烷分兩次充分提取3ml的反應液，用氣相色譜檢測降解效果，檢測條件如下ECD檢測器，SPB-5(30mX250umX0.25um);進樣口溫度，260°C;柱溫，240°C;檢測器溫度，300°C;氣體流速，N240mL/min。甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、功夫菊酯降解效果均在93%以上(如下表)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>序列表<110>南京農業大學<120>擬除蟲菊酯類殺蟲劑水解酶基因<130>說明書<160>4<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>843<212>DNA<213>JQ1-11菌株(融i聊ffl顯ssp.)<220><221>菊酯水解酶基因<222>(1)..(843)<223><400>1atgaccgtcaccgatatcatcctgatccacggcgccttgaaccgcggcgcctgctatgac60gcggtcgtcccgcttctcgaagcgcgcggctaccgcgtccatgcgcccgacctgaccggc120catacgcccggcgatggcggccatttgtcggtcgtcgacatggagcattatacccgccca180gtcgctgacatcctggcacgggccgaggggcagtcgatccttctggggcacagcttgggc240ggtgcatccatctcgtggctggcgcagcaccatcccgacaaggtggccgggctgatctac300ctgaccgcggtcctcaccgcgcccggtgtaacgccggaaaccttcgtcctgcccggcgag360cccaaccggggcacgcegcacgcgctggacctgatccagccggtcgacgagggacgtggg420ctacaggcggatttctcgcgactggaacggctccgcgaag加catgggcgattatccc480ggcgagggaatgccgcctgccgaacatttcatccagacccagtcgaccgtgccctttggc540acgcccaatccgatggaggggcgcgcgctggaaatcccacgcctctatatcgaggcgctg600gacgatgtcgtgcttccgatcgccgtgcagcgtcagatgcagaaggagttccccggtccg660gtcgcggtcgtgtcgctgccggccagccatgcgccctattactcgatgcccgaacggctg720gccgaggcgatcgccgatttcgccgatgccccggccgagtatcgccagacggcgacgaag780gctgggcctgatcgaccagctggagcggacgggggtcgagccgaccgagctgatctaccg840tga843<210>2<211>280<212>PRT<213>JQ1-11菌株(5aW聊啦朋ssp.)<220><221>菊酯類殺蟲劑水解酶基因所推導的蛋白質<222>(1)..(280)<223><400>2MetThrValThrAspHelieLeulieHisGlyAlaLeuAsnArgGly151015AlaCysTyrAspAlaValValProLeuLeuGluAlaArgGlyTyrArg202530ValHisAlaProAspLeuThrGlyHisThrProGlyAspGlyGlyHis354045LeuSerValValAspMetGluHisTyrThrArgProValAlaAspHe505560LeuAlaArgAlaGluGlyGinSerlieLeuLeuGlyHisSerLeuGly65707580GlyAlaSerlieSerTrpLeuAlaGinHisHisProAspLysValAla859095GlyLeulieTyrLeuThrAlaValLeuThrAlaProGlyValThrPro100105110GluThrPheValLeuProGlyGluProAsnArgGlyThrProHisAla115120125LeuAspLeulieGinProValAspGluGlyArgGlyLeuGinAlaAsp130135140PheSerArgLeuGluArgLeuArgGluValPheMetGlyAspTyrPro145150155160GlyGluGlyMetProProAlaGluHisPhelieGinThrGinSerThr165170175ValProPheGlyThrProAsnProMetGluGlyArgAlaLeuGluHe180185190ProArgLeuTyrlieGluAlaLeuAspAspValValLeuProlieAla195200205ValGinArgGinMetGinLysGluPheProGlyProValAlaValVal210215220SerLeuProAlaSerHisAlaProTyrTyrSerMetProGluArgLeu225230235240AlaGluAlalieAlaAspPheAlaAspAlaProAlaGluTyrArgGin245250255ThrAlaThrLysAlaGlyProAspArgProAlaGlyAlaAspGlyGly260265270ArgAlaAspArgAlaAspLeuPro275280<210>3<211>34<212>DNA<213>人工合成<220><221>從JQl-ll擴增菊酯水解酶基因引物左端<222>(1)..(34)<223><400>3agtcatctcgagcggtagatcagctcggtcggct34<210>431DNA人工合成<211><212><213><220><221><222><223><400>從JQl-ll擴增菊酯水解酶基因引物右端(1)..(31)4agtccatatgaccgtcaccgatatcatcctg3權利要求1.菊酯類殺蟲劑水解酶基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。2.權利要求1所述的菊酯類殺蟲劑水解酶基因核苷酸序列所推導的菊酯水解酶蛋白質，其氨基酸序列為SEQIDNO.2。3.含權利要求1所述菊酯水解酶基因的PET-29a(+)重組質粒。4.含權利要求3所述的重組質粒的重組微生物BL21(DE3)。5.權利要求1所述菊酯類殺蟲劑水解酶基因在農作物、農產品、土壤、水體的菊酯殘留去除方面的基因工程應用。6.權利要求2所述菊酯水解酶蛋白質在農作物、農產品、土壤、水體的菊酯殘留去除方面的應用。全文摘要本發明擬除蟲菊酯類殺蟲劑水解酶基因，屬于應用環境微生物領域。本發明提供了菊酯類殺蟲劑水解酶基因及其所推導的菊酯水解酶蛋白質。該基因全長為843bp，G+C含量為66.55％，編碼280個氨基酸。利用該基因構建的工程菌株能高效表達菊酯水解酶，生產的酶制劑可用于土壤、蔬菜、茶葉、水果、中草藥、煙草等的菊酯殘留去除，及農產品深加工中降解菊酯農藥殘留，提高產品品質及增加附加值。并可進一步用于構建轉基因作物徹底解決植株中農藥殘留問題，生產無公害綠色農產品；同時可用于修復菊酯污染的水體等環境。文檔編號C12N15/55GK101429515SQ200810243899公開日2009年5月13日申請日期2008年12月17日優先權日2008年12月17日發明者健何,戀李,李順鵬,杭寶劍,王保戰,鵬郭申請人:南京農業大學