專利名稱：一種開放式蛋白差異顯示方法
技術領域：
本發明涉及一種生物蛋白質分析方法，特別涉及一種直接在蛋白質水平上分 析蛋白表達差異的方法。
背景技術：
在本發明之前，目前進行蛋白表達差異分析方法有二大類， 一類是在RNA 水平上的差異分析方法，另一類是在蛋白質水平上的差異分析方法。前者又主要 有二種， 一種是差異顯示PCR方法(簡稱DD-PCR),另一種是消減雜交方法及抑
制性消減雜交方法(簡稱SSH)。
DD-PCR方法主要步驟是首先提取組織標本的mRNA,然后以3'端的12對錨 定引物進行逆轉錄反應；以錨定引物和5'端的20種隨機引物進行PCR擴增，并 在反應體系中加入同位素標記的d-ATP探針；PCR擴增產物電泳分析后回收差異 條帶，再以之為模板進行第二輪擴增；對第二輪擴增產物進行雜交鑒定、測序， 獲得差異顯示表達序列標簽(expression sequence tag, EST) DD-PCR方法 可快速地對多個樣本進行比較，同其他差異顯示技術方法相比，非常適合用于對 處于疾病不同發展階段或處于不同發育階段的生物樣本進行比較研究。但該方法 存在的主要問題是假陽性率高，且對高拷貝數的mRM傾向性較強；另一方面， 用該技術獲得的片段多為非翻譯區的序列，而這部分序列往往不包括在基因庫已 知序列里面，由此出發尋找全基因序列往往效果不佳。消減雜交方法 (subtractive hybridization)和抑制性消減雜交方法 (suppression subtractive hybridization, SSH)最早用于尋找由于缺失而導致遺傳性疾病的 相關基因。其后應用于將兩者變性后復性再進行雜交；然后，采用親和素-生物 素結合或羥基磷灰石層析技術分離未雜交的部分，由此獲得呈差異表達的基因片 段。該技術的主要缺陷在于無法對低豐度表達的基因進行克隆， 一些改良后的消 減雜交技術如代表性差異分析法(representiational difference analysis, ■)、酶降解消減技術(enzymatic degrading subtraction, EDS)等依然存在 上述問題。抑制性消減雜交方法則是一種簡便有效、以抑制PCR和消減雜交為基 礎的分離差異表達基因的新技術。該方法的操作流程包括兩輪雜交和兩輪PCR 擴增，可以有效擴增目的cDM片段。抑制性雜交技術克服了消減雜交技術無法 克隆低豐度表達基因的缺陷，并且P爭低了假陽性率，相對于其它差異顯示技術具 有一定的優越性。但是，在蛋白水平上的差異顯示的研究，由于蛋白操作的困難， 現在多半是用抗體芯片的方法，只能尋找已知蛋白的表達差異變化，無法尋找到 新的蛋白，而且目前抗體芯片成本極高，其使用要求精密儀器，普通科研院所買 不起，并且抗體芯片所含抗體數量有限，遠遠不如基因芯片的數量，并不能真正 達到高通量篩選的目的
另一方面，現有技術中也提供了蛋白水平上開放式的差異顯示分析方法，如
3二維電泳加上質譜分析的大型儀器，但價格高昂，不適宜中小實驗室。
發明內容
本發明的目的就在于克服上述缺陷，研究一種直接在蛋白質水平上分析蛋白 表達差異的方法。
本發明的技術方案是
一種開放式蛋白差異顯示方法，包括如下步驟 (1)構建適體DNA或RM隨機序列庫將經過處理固定了的對照細胞和病理細 胞在一致條件下孵化，然后洗去未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機 序列庫；
(2 )抽提上述適體DNA或RM隨機序列庫中細胞的蛋白質，用苯酚氯仿分離沉 淀蛋白質，取含有DNA或RNA的上清液，用真空干燥機濃縮MA或RNA或酒精沉 淀DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫；
(3 )對上步中得到的可反應蛋白水平變化的DM或RNA隨機序列庫中的扭細胞 和對照細胞的進行消減雜交后；PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測序， 選取幾個到幾十個克隆，用標記引物擴增制備相應類型的DNA或RM aptamer;
(4)利用上步的DNA或MA aptamer篩選確定具有表達差異和功能差異的特異 性蛋白。
本發明的優點和效果在于把在蛋白水平上的表達差異，通過aptamer轉移至 DNA或RNA水平上的差異顯示，從而達到了簡捷快速地高通量篩選表達差異蛋白
的目的，為蛋白相互關系的系統研究和基因功能的系統#:索提供了一條捷徑，而
且該技術普遍適用于各大中小科研院所及公司。
除了在蛋白質和基因功能研究方面的顯著優勢外，本方法還可用于aptamer
靶藥物的高效篩選，有可能為生物制藥帶來一片全新的空間。
本發明的其他優點和效果將在下面繼續描述。
具體實施例方式
本發明通過構建DNA或RM隨機序列庫〔aptamer庫〕，使之進入細胞體內 結合相應特異性抗原蛋白分子。如果某蛋白分子有表達數量差異，那么其結合的 特異性DNA、 RNA序列或aptamer也會表現出相應的數量變化來，從而把在蛋白 水平上的差異顯示轉移到對DM序列的差異顯示上來。也就是直接用DNA、 RM (APTAMER)的差異顯示來反映蛋白水平的變化。
其具體實施過程 1 、構建適體DNA或RNA隨機序列庫
將經過處理固定了 (常規病理免疫組化方法之固定條件)的對照細胞和病理 細胞〔活體〕在一致條件下孵化(常規病理免疫組化方法之孵化條件)，然后洗 去未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列庫。 2、抽提上述適體DNA或RNA隨機序列庫中的細胞的蛋白質
用苯酚氯仿分離沉淀蛋白質，取上清〔含DNA或RM序列〕，用真空干燥機 濃縮DNA或RNA或酒精沉淀DNA或RNA,從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或 RM隨機序列庫。
4PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測序，選取幾個到幾十個克隆，用標記 引物擴增制備相應類型的DM或RM aptamer。
上述步驟中，進行循環擴增后，如果aptamer為單鏈DNA或RNA,則需再做 一個單引物PCR 〔94C 15s, 55C 15s, 72C 15s〕或RNA的體外轉錄以獲得單鏈 aptamer。
4、利用該aptamer來篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白。如果把 蛋白是膜蛋白，先用紫外照射交聯aptamer分子和抗原分子，較嚴格條件裂解細 胞從而分離膜蛋白，跑PAGE膠分離純化已標記DM-蛋白復合物，切下條帶， 純化測序或質普分析獲得靶蛋白序列。靶蛋白如果是非膜蛋白，先用紫外照射交 聯aptamer分子和抗原分子，可溫和裂解，跑PAGE膠分離純化aptamer -蛋白 復合物，送測序或質普分析獲得靶蛋白序列。
權利要求
1.一種開放式蛋白差異顯示方法，包括如下步驟(1)通過DNA合成或RNA合成的方法構建適體DNA或RNA隨機序列庫，將經過處理固定了的對照細胞和病理細胞在一致條件下孵化，然后洗去未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列庫；(2)抽提上述適體DNA或RNA隨機序列庫中細胞的蛋白質，用苯酚氯仿分離沉淀蛋白質，取含有DNA或RNA的上清液，用真空干燥機濃縮DNA或RNA或酒精沉淀DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫；(3)對上步中得到的可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫中的靶細胞和對照細胞進行消減雜交后；PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測序，選取幾個到幾十個克隆，用標記引物擴增制備相應類型的DNA或RNA aptamer；(4)利用上步的DNA或RNA aptamer篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種直接在蛋白質水平上分析蛋白表達差異的方法。本發明技術方案是構建適體DNA或RNA隨機序列庫，抽提適體DNA或RNA隨機序列庫中細胞的蛋白質，得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫，對可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫中的靶細胞和對照細胞的進行消減雜交后，PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測序，用標記引物擴增制備相應類型的DNA或RNA aptamer，DNA或RNA aptamer篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白。本發明解決了現有技術DD-PCR方法、差異分析法、酶降解消減方法等存在的各自缺陷。本發明具有將蛋白水平上的表達差異通過aptamer轉移至DNA或RNA水平上的差異顯示，從而達到了簡捷快速地高通量篩選表達差異蛋白的目的。
文檔編號C12Q1/68GK101492736SQ20081024307
公開日2009年7月29日 申請日期2008年12月8日 優先權日2008年12月8日
發明者劍 文, 偉 趙 申請人:南京市第二醫院