專利名稱：：重組梭菌及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及重組梭菌及其構建方法與應用。
背景技術：
：化石能源的不可再生性以及儲存的有限性是現代社會面臨的一個重大問題。這導致原油價格一直呈上升趨勢，給國家的經濟發展帶來了沉重的負擔。化石燃料大量使用的同時也帶來了嚴重的環境問題。化石燃料的燃燒急劇增加大氣中二氧化碳的含量，造成溫室效應，使全球氣候變暖。另外化石燃料在燃燒過程中排放的硫化物，氮化物導致大面積范圍的酸雨，破壞了環境。因此，亟需尋求可以替代的并且具有環境友好的可再生燃料。生物質是大自然中取之不盡的資源，具有可再生性，并且被利用后不會向環境中排放更多的二氧化碳。因此利用生物質作為原料生產生物能源具有廣闊的前景。目前利用生物質生產的并且已經廣泛使用的生物燃料包括生物乙醇和生物柴油。丁醇是一種重要的化工原料，可以用來合成丙烯酸脂、丙烯酸甲酯、乙二醇醚、乙酸丁酯、正丁胺、氨基樹脂的前體的大宗化學產品。丁醇也可以可用于生產粘合劑、生物堿、抗生素、樟腦、防凍液、人造牙齒、洗滌劑、人造橡膠、電子產品、乳化劑、化妝品、纖維制品、凝聚劑、浮選酸(如丁基黃藥)、硬表面清洗劑、激素、維生素、剎車和制動液、工業覆膜、唇膏、指甲保護產品、油漆、油漆稀釋劑、香料、殺蟲劑、塑料、油墨、樹脂、防彈玻璃、剃須膏及個人護理產品、表面覆膜、超級吸附劑、人造水果調料、人造絲、在紙層析和薄層色譜中作為流動相、作為油料添加劑，用于造紙和皮革業中的最后處理等。研究表明，丁醇也是一種優良的生物燃料。使用丁醇替代乙醇作為生物燃料有很多優點。第一，丁醇能單獨或者以任意比例混合汽油使用，而乙醇最大混合比例只能達到85%。第二，丁醇單獨使用或添加到燃料中去使用時，對目前的汽車發動機不需要任何改造。第三，丁醇蒸氣壓較低，易于安全運輸。第四，丁醇不易吸水，可以在汽油儲藏和分裝之前與之混合，而乙醇混合汽油之后必須馬上使用，這個特點使丁醇萬一泄露也不會污染地下水。第五，丁醇腐蝕性低，這意味著現有的基礎設施(油罐、輸送管道、泵等)仍然可以使用。第六，丁醇的熱容量更高，這提高了公里/汽油混合率。2007年BP和DuPont公司宣布在英國重新啟動ABE發酵工程以作為生物燃料供應英國市場，所以生物丁醇生產的研究有著光明的前景。然而，發酵法生產丁醇目前仍存在溶劑濃度低，底物成本高等技術障礙。造成了生物發酵法生產丁醇與化學合成法相比目前仍然不具有價格競爭優勢。因此，需要對現有的菌株進行遺傳改造，獲得性狀優良的新型菌株應用于生產。目前，在這一方已進行了大量研究工作，開發出了應用于丙酮丁醇梭菌的穿梭質粒載體，以及新興的用于插入突變獲得表型突變株的二型內含子。已經通過過量表達與溶劑合成途徑相關的基因以及提高耐受性的熱激蛋白基因構建了基因工程菌株，另外也利用同源重組獲得的一些代謝途徑基因突變菌株。但是目前產量的水平仍不具有與化學合成競爭的能力，因此仍需進行深入的研究。通過對丙酮丁醇梭菌的代謝途徑進行分析后發現，在丁醇產生過程中需要消耗大量的還原力NADH，在此過程中還要產生乙醇、氫氣等消耗還原力的物質。但是在代謝過程中僅能產生有限的NADH，因此考慮通過提高NADH供給的辦法來提高丁醇的甲酸脫氫酶(FDH)屬于D-2-羥基酸脫氫酶類，根據4級結構、輔基的構象和類型以及底物特異性的區別，分為幾種不同的類型，其中很重要的一類就是NAD+依賴型的甲酸脫氫酶(EC1.2.1.2)，它可以將甲酸氧化為C02，同時將NAD+還原為NADH，該類型的甲酸脫氫酶由2個相同的亞基組成，不包含金屬離子和輔基，并且對甲酸和NAD+具有高度的專一性。NAD依賴型FDH催化過程的一個顯著特征是來自底物的氫離子直接轉移到NAD+的煙堿C4原子上，無需酸堿催化步驟。
發明內容本發明的目的是提供一種重組梭菌及其構建方法與應用。本發明所提供的構建重組梭菌的方法，是將編碼甲酸脫氫酶的基因導入梭菌中構建重組菌。其中，所述甲酸脫氫酶可是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸由a)衍生的蛋白質。為了使a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標簽。表l.標簽的序列表l.標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。所述編碼甲酸脫氫酶的基因具體可是如下l)或2)或3)的基因-1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼甲酸脫氫酶的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼甲酸脫氫酶的認A分子。所述步驟3)中的基因，與l)的基因最好有95%以上的同源性。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在68T下雜交,然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。所述編碼甲酸脫氫酶的基因還經過甲基化修飾。所述梭菌為丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。所述丙酮丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌(C7osth力'鵬sceto/w0^i'c咖)SMB-1CGMCC亂2287。由構建重組梭菌的方法制備的重組梭菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組梭菌具體可為丙酮丁醇梭菌(C7a^n'o7哪sce&Zwz^^'c咖)SMB-l(pITF)CGMCCNo.2798。本發明的另一個目的是提供一種生產丁醇的方法。本發明所提供的生產丁醇的方法，是發酵培養所述重組梭菌生產丁醇。其中，每升發酵培養的培養基含KH2P040.5-1.0g;K2HP04.3H200.5-1.0g;MgS04-7H200.2-0.8g;MnS(VH200.01-0.05g;FeS04.7H200.01-0.05g;NaCl0.1-2.0g;酵母粉2.0-5.0g;(NH4)2S040,5-2.0g;葡萄糖60-80g。所述發酵培養基中還含有25-100mg/L的紅霉素，所述發酵培養基還包含lmM丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的代謝途徑中都具有產生甲酸的步驟。本發明構建重組丙酮丁醇梭菌的方法將甲酸脫氫酶導入丙酮丁醇梭菌中，并在丙酮丁醇梭菌內表達，甲酸脫氫酶以NAD+為底物，能夠產生NADH，來增加胞內NADH的供給，從而提高了丁醇的產量。該方法構建重組拜氏梭菌也能獲得相同的效果。本發明構建的重組丙酮丁醇梭菌發酵生產丁酮的產量最高可達到14.1g/L。圖1為重組表達載體plTF的結構示意圖。圖2為PCR鑒定含有重組表達載體plTF的丙酮丁醇梭菌。具體實施例方式下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑獲得。下述實施例的實驗結果均為三次重復實驗的平均值。下述實施例以丙酮丁醇梭菌為例闡明本發明的構建重組梭菌的方法。實施例l、構建表達甲酸脫氫酶的丙酮丁醇梭菌從博伊丁假絲酵母(C朋o^/sZwi必;w7)2.2160(中國普通微生物菌種保藏管理中心中心)(http:〃www.cgmcc.net/index.php/Contents/search)基因組中擴增甲酸脫氫酶(/必J，擴增/必基因的引物如下fdh-A:AGTGTCGACAGGTGCTGTCAATGTGGT;fdh-B:AGTGGATCCGTGCTCCCGTCATTATCT。PCR擴增產物連至表達載體pIMPl(Mermelstein，L,D.，N.E.Welker，G.N.Bennett,andE.T.Papoutsakis.(1992).ExpressionofclonedhomologousfermentativegenesinClostridiumacetobutylicumATCC824.Bio/Technology.10:190-195)(中國科學院微生物研究所)上，獲得重組表達載體pITF(圖l)，連接轉化后測序驗證，測序結果表明擴增/必基因的PCR產物的核苷酸序列為序列表中的序列l，編碼序列表中序列2所示的蛋白。由于已經證明丙酮丁醇梭菌(67osz^'力'娜aceto/wz^7/c咖)ATCC824中含有限制性內切酶Cac8241，可以切割未甲基化的外源DNA，因此在對丙酮丁醇梭菌(67osmW咖ace"力〃z^h'c咖)SMB-1CGMCCNs.2287(專利號200810102673.2)進行轉化前對重組表達載體pITF進行甲基化修飾。具體操作步驟為從￡coh'JM109中提取的plTF轉入AER2275(￡.coh'ER2275含質粒pANl，pANl含來自枯草芽孢桿菌的①3T甲基化酶基因)(Mermelstein,L.D.andE.T.P即outsakis(1993).〃InvivomethylationinEscherichiacolibytheBacillussubtilisphagephi3TImethyltransferasetoprotectplasmidsfromrestrictionupontransformationofClostridiumacetobutylic咖ATCC824.〃Appl.Environ,Microbiol.59(4):1077-1081.)(中國科學院微生物研究所)中進行甲基化，獲得甲基化的重組表達載體pITF。制備梭菌感受態的培養基為強化梭菌培養基(RCM)(每升RCM培養基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g，淀粉10.0g，乙酸鈉3.0g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，pH6.8)。丙酮丁醇梭菌(C7os^i^/腿ace^/w0^icw/T7)SMB-1CGMCCNe.2287(專利號200810102673.2)菌體生長至0D6。。=0.8時，收集菌體，用ETB溶液(270mM蔗糖，5mM磷酸二氫鈉，pH7.4)洗滌菌體兩次，最后用適量ETB溶液懸浮菌體，分裝成600y1/管待轉化。所有操作保持菌體在厭氧狀態及冰上(4。C離心)。將甲基化的重組表達載體pITF與菌體混合，置于冰上10min，然后將混合物轉移至4mm電擊杯內進行轉化，使用的電轉化參數為電壓2.0kV，電容25uF，電阻oo。典型電擊持續時間為12ras。電轉化完畢后，立即將菌液轉至10ralRCM培養基中，復壯6-8h，涂布于含25ug/ml紅霉素的RCM平板上，37。C培養36h。隨機挑取紅霉素抗性菌落接種于含50yg/ml紅霉素液體培養基中，培養24h后提取基因組DNA，用引物fdh-A和fdh-B進行PCR鑒定(圖2)，獲得含有重組表達載體pITF的丙酮丁醇梭菌，命名為丙酮丁醇梭菌(ao^r^7〃/H3c由紐Wc咖JSMB-1(pITF)。圖2中，"1"代表DNAMarker;"2"代表丙酮丁醇梭菌SMB-1(pITF);"3"代表丙酮丁醇梭菌(C7o"rio7咖ace"/w^^ic咖)SMB-1(pIMPl)。丙酮丁醇梭菌(67osz^z'力'鵬acefo/wO^'c鵬)SMB-1(pITF)在用RCM培養基中37i:靜置培養至對數期，作為發酵種子液。發酵種子液按照體積百分比為5%的量接種到裝有3L玉米粉培養基(每100mL水中加入8.0g玉米粉，加熱糊化)的7L發酵罐中，同時加100mg/L的紅霉素，37°C，靜止發酵。用液相色譜檢測發酵48小時后的發酵液。以丙酮丁醇梭菌(C7oWhA'娜3ce"Z^0^'cM^SMB-1(pIMPl)作為對照。液相色譜檢測條件如下樣品前處理12000rpm離心lmin，取上清液，用0.22um濾膜過濾；色譜條件Agilent1200液相色譜儀，示差檢測器;BioRadAminexHPX—87H有機酸柱(300*7.8腿)，柱溫15。C;上樣量10ul;流動相為0.05mMH2S04，流速O.5ml/min。丁醇標準品購自Sigma公司(目錄號4C006217);在如上色譜條件下標準品的保留時間為40.9分鐘。表2.液相色譜檢測48小時的發酵液的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>發酵種子液按照體積百分比為5%的量接種到裝有3L玉米醪培養基(每100mL水中加入8.0g玉米淀粉，加熱糊化)的7L發酵罐中進行發酵，添加不同濃度(0mM、lraM、2mM)的甲酸鈉，同時加100mg/L的紅霉素，37°C，靜止發酵。用液相色譜檢測發酵48小時后的發酵液。以丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMPl)作為對照。表3.液相色譜檢測添加不同濃度的甲酸鈉的48小時的發酵液的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>添加不同濃度的甲酸鈉時，對丙酮丁醇梭菌SMB-l(pIMPl)產丁醇的能力有了較大影響，添加lmM甲酸鈉時，丁醇產生量從ll.Og/L下降至1.2g/L。丙酮丁醇梭菌SMB-l(pITF)添加1iiiM甲酸鈉時，丁醇產量提高到12.9g/L。將丙酮丁醇梭菌SMB-l(pITF)用RCM培養基于37。C溫箱中靜置培養至對數期，作為發酵種子液。進行如下的發酵實驗(1)發酵種子液按照體積百分比為5X的量接種到裝有3LCGM培養基(每升CGM培養基含KH2P04，0.75g;K2HP04'3H20，0.75g;MgS04'7H20，0.4g;MnS04.H20，O.Olg;FeS04'7H20,0.01g;NaCl，1.0g;酵母提取物，5.0g;(NH4)2S04,2.0g;葡萄糖，80g)培養基的7L發酵罐中，同時加100mg/L的紅霉素和1mM甲酸鈉，控制發酵罐pH為5.0，37°C，200rpm發酵。以丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMPl)作為對照。(2)發酵種子液按照體積百分比為5X的量接種到裝有3LCGM培養基(每升CGM培養基含KH2P04，0.75g;K2HP04'3H20，0.75g;MgS04'7H20，0.4g;MnS04.H20，O.Olg;FeS04.7H20，0.01g;NaCl，1.0g;酵母提取物，5.0g;(NH4)2S04，2.0g;葡萄糖，80g)培養基的7L發酵罐中，同時加IOOmg/L的紅霉素，控制發酵罐pH為5.0，37°C，200rpm發酵。以丙酮丁醇梭菌SMB-1(pIMPl)作為對照。用液相色譜檢測發酵60小時后的各個發酵液。表4.液相色譜檢測添加1mM甲酸鈉的60小時的發酵液的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>丙酮丁醇梭菌SMB-l(pITF)產丁醇能力有了較大提高，在不添加甲酸鈉時丁醇的產量提高了31.2%。當甲酸鈉存在情況下，對照菌株的產量大幅度下降，此時工程菌株的產量達到了14.lg/L。丙酮丁醇梭菌(C7oszm'o7咖3cez^Zwz^h'c鵬)SMB-1(pITF)中的一株菌在發酵60小時后，其發酵液中的丁醇產量為14.1g/L，將該菌株已于2008年12月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2798。序列表〈110〉中國科學院微生物硏究所〈120〉重組梭菌及其構建方法與應用〈130〉CGGNARW82068〈160〉2〈210〉1〈211〉1046〈212〉DNA〈213〉博伊丁假絲酵母(&77力Vsk^'^2';i力atgaagatcgttttagtct"tatacgatgctggtaaacacgctgccgatgaagaaaaatta60tacggttgt.actgaaaacaaattaggtattgccaMtggttga犯gatcaaggacatgaa120ttaatcaccacgtctgataaagaaggcggaaacagtgtgttggatcaacatataccagat180gccgatattatcattacaactcctttccatcctgcttatatcactaaggaaagaatcgac240aaggctaaaaaattga^attagttgttgtcgctggtgtcggttctgatcatattgatttg300gattatatcaaccaaaccggtaagaaaatctccgttttggaagttaccggttctaatgtt360gtctctgttgcagaacacgttgtcatgaccatgcttgtcttggttagaaattttgttcca420gctcacg3aca肌tc3tt^ccacgsttgggaggttgctgct3tcgctaaggatgcttac480gatatcgaaggtaaaactatcgccaxxattggtgccggtagaattggttacagagtcttg540gaa^gattagtcccatlxaatcctaaagaattattatactacgatta^tcaagctttacca^600aaagatgctgaagaaaaagttggtgctagaagggttgaaaatattgaagaattggttgcc660caagctgatatagttacagttaatgctccattacacgctggtacaaaaggtttaattaac720aaggaattattgtctaaattcaagaaaggtgcttggttagtcaatactgcaagaggtgcc780atttgtgttgccgaagatgttgctgcagctttagaatctggtcaattaagaggttatggt840ggtgatgtttggttcccacaaccagctccaaaagatcacccatggagagatatgagaaac900aaatatggtgctggtaacgccatgactcctcattactctggtactactttagatgctcaa960actagatacgctcaaggtactaaaaatatcttggagtxattctttactggtaagtttgat1020tacagaccacaagatatcatcttatt1046〈210〉2〈211〉348<212〉PRT〈213〉博伊丁假絲酵母(C朋G^/a6w'Gf7w'力〈400〉2MetLys1GluGluTrpLeuGlyGly50lieThr65LysAlaHislieLeuGluMetThr130lielie145AsplieTyrArgTyrTyrlieValLeuValLeuTyrAsp5GlyLysLys35AsnLeu20AspTyrGlyCysThrGinGlyHisSerValLeuThrProPheLysAspVal115MetLysLeu100ThrLeu85AspHis70LysAsp55ProGlu40GinGlu25LeuAla10AsnGlyLysHisAlaLysLeuGlylieThrThrHislieProAlaTyrlieLeuValValTyrlieAsnGlySerAsnLeuValLeuAsnHisAspGluGlyValAspLeu180TyrLys165GluTrp150ThrVal135GluVal120ArgGin105ValVal90ThrThr75AlaAsp60LysSer45AlaGluValGlyGlyLysLysSerValAlaAsnPheValValAlaAlalieAlaThrArgLeuGinAlaLeuValPro185ProLyslie170Phelie155GlyPro140AlaAlaAsnProGlu125AlaLysGlyLyslie30AspAspArgGlylie110HisAlaAsp15AlaAsnLysGlulielielieAsp80SerAsp95SerValValValHisGluGinAspArgAlaTyr160lieGly175LeuLeuGlu190AspAlaGluGluLysValGly195200205AlaArgArgValGluAsnlieGluGluLeuValAlaGinAlaAsplie210215220ValThrValAsnAlaProLeuHisAlaGlyThrLysGlyLeulieAsn225230235240LysGluLeuLeuSerLysPheLysLysGlyAlaTrpLeuValAsnThr245250255AlaArgGlyAlalieCysValAlaGluAspValAlaAlaAlaLeuGlu260265270SerGlyGinLeuArgGlyTyrGlyGlyAspValTrpPheProGinPro275280285AlaProLysAspHisProTrpArgAspMetArgAsnLysTyrGlyAla290295300GlyAsnAlaMetThrProHisTyrSerGlyThrThrLeuAspAlaGin305310315320ThrArgTyrAlaGinGlyThrLysAsnlieLeuGluSerPhePheThr325330335GlyLysPheAspTyrArgProGinAsplielieLeu34034權利要求1、構建重組梭菌的方法，是將編碼甲酸脫氫酶的基因導入梭菌中構建重組菌。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述甲酸脫氫酶是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列2所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸由a)衍生的蛋白質。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述編碼甲酸脫氫酶的基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼甲酸脫氫酶的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼甲酸脫氫酶的DNA分子。4、根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述編碼甲酸脫氫酶的基因還經過甲基化修飾。5、根據權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述梭菌為丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。6、由權利要求1至5中任一所述的方法制備的重組梭菌。7、根據權利要求6所述的重組梭菌，其特征在于所述重組梭菌為丙酮丁醇梭菌(67o^2^/i咖3ce"/wt;^ic咖)SMB-1(pITF)CGMCCNo.2798。8、一種生產丁醇的方法，是發酵培養權利要求6或7所述重組梭菌生產丁醇。9、根據權利要求8所述的方法，所述發酵培養的培養基包含如下物質KH2P040.5—1.0g;K2HP04.3H200.5—1.0g;MgS04'7H200.2—0.8g;MnS04'H200.01—0.05g;FeS04,7H200.01-0.05g;NaCl0.1-2.0g;酵母粉2.0-5.0g;(NH4)2S040.5-3.0g;葡萄糖60-80g。10、根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述發酵培養基中還含有25-100mg/L的紅霉素，所述發酵培養基還包含lmM甲酸鈉。全文摘要本發明公開了一種重組梭菌及其構建方法與應用。構建重組梭菌的方法，是將編碼甲酸脫氫酶的基因導入梭菌中構建重組菌。所述梭菌為丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。本發明還公開了一種生產丁醇的方法，是發酵培養由所述構建重組梭菌的方法構建的重組菌生產丁醇。本發明構建的重組丙酮丁醇梭菌發酵生產丁酮的產量最高可達到14.1g/L。文檔編號C12N9/04GK101423813SQ20081023955公開日2009年5月6日申請日期2008年12月12日優先權日2008年12月12日發明者張延平,寅李,王少華,董紅軍申請人:中國科學院微生物研究所