專利名稱：：一種獲得丁醇產生菌突變株的方法
技術領域：
：本發明涉及一種獲得丁醇產生菌突變株的方法。
背景技術：
：丁醇是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，全球年需求量超過140萬噸。丁醇又是一種極具潛力的新型生物燃料，其熱值、辛烷值與汽油相當；丁醇的含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，且不會腐蝕管道，便于管道輸送；丁醇的蒸汽壓低，安全性高，能與汽油以任意比混合。丁醇可用化學合成法和發酵法生產。化學合成法的主要路線包括兩條，一是以丙烯為原料，經羰基合成法生成正、異丁醛，加氫后分餾得到正丁醇；二是以乙醛為原料，經醇醛縮合成丁醇醛，脫水生成丁烯醛，再經加氫后得到正丁醇。發酵法則是以糧食為原料，經發酵獲得丙酮、丁醇、乙醇(三者質量比為3:6:1)，再經精餾后分別制得丙酮、丁醇和乙醇。發酵法生產丙酮丁醇曾經是僅次于乙醇發酵的全球第二大發酵工業。隨著石油價格的不斷上漲，使得丙酮丁醇發酵重新獲得人們的重視，僅以丁醇為例，國內市場價格在2006年上半年內由1萬元/噸上漲到1.8萬元/噸，仍然供不應求，丁醇發酵工業已迎來復蘇產業的大好時機。在過去20年中，圍繞著丁醇產生菌的篩選、丁醇合成的分子遺傳機制和調控、高丁醇比菌種改造、發酵原料的替換、發酵和提取工藝等方面，國內外學者開展了廣泛、深入的研究，為大規模實現丁醇生物制備奠定了基礎。丁醇發酵中，溶劑毒性是影響溶劑產量的一個關鍵限制因素。在所產生的溶劑中，丁醇是毒性最大的，當其濃度達到13g/L時，發酵就基本停止。研究發現，丁醇毒性的機制與其疏水性有關，它會破壞細胞膜的磷脂成份，使膜的流動性提高，可能會導致膜的不穩定，破壞與膜相關的功能，如抑制與膜結合的ATP酶活性、降低胞內ATP水平、抑制細胞維持胞內pH的能力、破壞細胞膜的pH梯度等。丁醇毒性對細胞膜的進一步影響是抑制糖和氨基酸的吸收，從而使代謝完全停滯。由于丁醇毒性是丙酮丁醇發酵中影響溶劑產量最主要的限制性因素，目前普遍認為提高對丁醇的抗性，可能會提高溶劑的產量。目前，多以傳統誘變選育或擴增耐受丁醇相關的基因來提高產生菌對丁醇的耐受性。基因工程操作需要準確的基因信息，但與丁醇耐受相關的基因比較多，很可能是多種基因共同作用的結果，單個或少量基因的過量表達或缺失往往不能達到提高宿主菌丁醇耐受性的目的，因此突變篩選仍然是獲得高丁醇耐受突變株最為有效的途徑。但傳統的誘變正突變率很低，篩選工作量大，改良菌種所用周期較長，并且所用的菌種在經過多次誘變后，會產生對誘變劑的"鈍化"現象，導致誘變效率下降。
發明內容本發明的目的是提供一種獲得丁醇產生菌突變株的方法。本發明所提供的獲得丁醇產生菌突變株的方法，包括以下步驟1)將丁醇產生菌進行化學誘變；32)將上述步驟1)誘變后的丁醇產生菌之間進行原生質體融合，得到融合子；3)將上述步驟2)獲得的融合子進行化學誘變；4)將上述步驟3)誘變后的融合子之間再進行原生質體融合，得到丁醇產生菌突變株。上述方法還包括將所述步驟4)獲得的丁醇產生菌突變株再進行化學誘變，將經過誘變的丁醇產生菌之間進行原生質體融合，得到丁醇產生菌突變株的步驟。上述過程至少重復一次。當然，上述獲得丁醇產生菌突變株的方法也可以只包括步驟1)_4)的過程。上述方法中，所述化學誘變所使用的誘變劑為甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯和/或亞硝基胍。所述誘變劑為硫酸二乙酯和亞硝基胍，所述硫酸二乙酯的終濃度為0.21%，具體可為0.5%，所述誘變時間為1040min，具體可為15min;所述亞硝基胍的終濃度為0.1lg/L，具體可為0.2g/L，所述誘變時間為1050min，具體可為30min。上述方法中，所述原生質體融合中，培養突變株的培養基的組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對氨基苯甲酸lmg/L、生物素2yg/L、維生素BJmg/L，其余為水。上述方法中，所述丁醇產生菌可為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)及糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutyri固)等，具體可為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287。可將不同的丁醇產生菌之間進行原生質體融合，如將丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)禾口拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)之間進行原生質體融合；也可以將不同的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)進行原生質體融合。采用上述方法獲得的丁醇產生菌突變株也屬于本發明的保護范圍。上述丁醇產生菌突變株DGF4，經16srDNA基因序列分析及生理生化特征分析，鑒定為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4已于2008年12月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN22279。本發明的另一個目的是提供一種制備丁醇的方法。本發明所提供的制備丁醇的方法，是培養按照上述方法獲得的丁醇產生菌突變株，得到丁醇。本發明的第三個目的是提供一種原生質體融合用培養基。本發明所提供的原生質體融合用培養基，其組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素BJmg/L，其余為水。本發明以丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)為出發菌株，用誘變劑進行處理，得到丁醇耐受性提高和產量提高的突變株，將獲的突變株制備成原生質體，進行原生質體融合，從融合子中篩選丁醇耐受性較高的菌株，經產物分析，得到高產融合子；再將所得的融合子進行誘變，將獲得的突變株進行原生質體融合，循環進行以上步驟，最終得到對產物有較高耐受性的丁醇產生菌突變菌。采用上述方法獲得的丁醇產生菌突變株DGF4對丁醇的耐受性可達19g/L，發酵液中丁醇的產量可達10.43g/L。本發明方法結合了傳統誘變育種和基因組重排技術的優點，無需了解微生物的代謝途徑、生物合成酶編碼基因或與菌株生理性狀相關的分子基礎，通過表型的變化就可對突變株進行多輪次遞進式突變篩選，保留了對產物產生有利的基因并使之得到提高，可以有效提高正向突變株的篩選效率，縮短突變和菌種篩選的時間和周期。具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。下述實施例中的化學誘變及原生質體融合的操作均在嚴格厭氧的條件下進行。實施例1、丁醇產生菌突變株的獲得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2287。(中國專利，申請號200810102673.2)。實驗中所涉及的培養基和試劑的組成如下RCM培養基的組成葡萄糖5.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、淀粉10.0g/L、氯化鈉5.Og/L、醋酸鈉3.Og/L，其余為水。pH6.8。115。C條件下滅菌20分鐘。7.5%質量百分含量玉米醪培養基的組成7.5g玉米粉加100mL水，加熱糊化，分裝。115。C條件下滅菌20分鐘。CBM培養基的組成葡萄糖10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素Bilmg/L，其余為水。pH6.9。115。C條件下滅菌20分鐘。改良的CBM培養基CBM培養基中，以淀粉代替葡萄糖。115。C條件下滅菌20分鐘。再生培養基在CBM培養基中添加蔗糖和瓊脂，使其在培養基中的終濃度分別為171g/L和2X。115。C條件下滅菌20分鐘。pH7.0的磷酸鹽緩沖液將5.29gKH2P04和13.94gK2HP04.3H20溶于1L水中，pH7.0。115。C條件下滅菌20分鐘。pH6.0的磷酸鹽緩沖液將8.OOgKH2P04和2.OOgK2HP04.3H20溶于1L水中，pH6.0。115。C條件下滅菌20分鐘。亞硝基胍溶液用甲酰胺溶解亞硝基胍，然后加入p朋.0的磷酸緩沖溶液使其完全溶解，得到終濃度為2g/L的亞硝基胍溶液。高滲緩沖溶液在CBM培養基中添加蔗糖和還原型谷胱甘肽(購自Sigma公司)，使蔗糖在培養基中的終濃度為171g/L，使還原型谷胱甘肽在培養基中的終濃度為5mmo1/L。過濾除菌獲得。PEG溶液將40g聚乙二醇(PEG-6000)溶于lOOmL上述高滲緩沖溶液中得到。5115t:條件下滅菌20分鐘。生理鹽水在300ml0.75%質量百分含量的氯化鈉溶液中加入0.46g還原型谷胱甘肽，使還原型谷胱甘肽在培養基中的終濃度為5mmol/L。過濾除菌獲得。具體方法如下1、化學誘變丙酮丁醇梭菌為嚴格厭氧菌，氧氣對其有毒害作用，所有的操作均在無氧條件下進行，并用含有還原型谷胱甘肽(終濃度為5mmol/L)的高滲緩沖溶液和生理鹽水來洗滌菌體，以提高菌體的存活率。將丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(對丁醇的耐受濃度為12g/L)接種于RCM培養基中，3638t:厭氧培養3648h，此時菌體生長至對數中后期；取培養液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液，再加入硫酸二乙酯(購于Sigma公司)，使其在混合液中的終濃度為0.5%，誘變15min;加入質量百分含量為25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應。將反應液離心，用生理鹽水洗滌兩次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養基中37t:培養2436h，然后將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養基上，3638。C厭氧培養4872h;挑選單菌落，接入到7.5%質量百分含量玉米醪培養基中，3638。C培養72h，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，選擇培養基中丁醇濃度和產物中丁醇產量都較高的突變株進行原生質體融合。2、原生質體融合實驗中發現，以淀粉為唯一碳源培養菌體時更有利于形成原生質體，因此選用改良的CBM進行菌體的培養，用于制備原生質體。將上述步驟1篩選到的突變株接種至改良的CBM培養基中，363『C厭氧培養1224h，此時菌體處于對數生長中期；取培養液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.0mg/mL;待95%以上的細胞形成原生質體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養基上，363『C厭氧培養3672h，挑取單菌落接入到7.5%質量百分含量玉米醪培養基中，同時分別點接到含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養基中，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，選擇培養基中丁醇濃度和產物中丁醇產量都較高的融合子繼續進行化學誘變。3、化學誘變將上述步驟2獲得的融合子接種于RCM培養基中，3638t:厭氧培養3648h，此時菌體生長至對數中后期；取培養液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH6.0的磷酸緩沖溶液，再加入亞硝基胍(購于Sigma公司)，使其在混合液中的終濃度為0.2g/L，誘變30min，將反應液離心用生理鹽水洗滌數次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養基中37t:培養2436h，將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養基上，3638。C厭氧培養4872h;挑選單菌落，接入到7.5%質量百分含量玉米醪培養基中，363『C培養72h，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，選擇培養基中丁醇濃度和產物中丁醇產量都較高的突變株進行原生質體融合。64、原生質體融合將上述步驟3篩選到的突變株接種至改良的CBM培養基中，3638。C厭氧培養1224h，此時菌體處于對數生長中期；取培養液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.0mg/mL;待95%以上的細胞形成原生質體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養基上，363『C厭氧培養3672h，挑取單菌落接入到7.5%質量百分含量玉米醪培養基中，同時分別點接到含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養基中，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，得到丁醇產生菌突變株。實施例2、丁醇產生菌突變株的獲得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2287。中國專利，申請號200810102673.2)。實驗中所涉及的培養基和試劑的組成同實施例1。1、化學誘變與實施例1步驟1不同的是，使用的硫酸二乙酯在混合液中的終濃度為0.2%，誘變時間為40min。2、原生質體融合同實施例1步驟2。3、化學誘變與實施例1步驟3不同的是，加入亞硝基胍，使其在混合液中的終濃度為0.lg/L，誘變時間為50min。4、原生質體融合同實施例1步驟4。實施例3、丁醇產生菌突變株的獲得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.2287。中國專利，申請號200810102673.2)。拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)購自英國食品工業與海洋細菌菌種保藏中心)，保藏號為NC濕8052。實驗中所涉及的培養基和試劑的組成同實施例1。具體方法如下1、化學誘變丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1的誘變方法同實施例1步驟1。拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)NCIMB8052為嚴格厭氧菌，氧氣對其有毒害作用，所有的操作均在無氧條件下進行，并用含有還原型谷胱甘肽(終濃度為5mmol/L)的高滲緩沖溶液和生理鹽水來洗滌菌體，以提高菌體的存活率。將拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)NCMB8052(對丁醇的耐受濃度為13g/L，接種于RCM培養基中，3638t:厭氧培養3648h，此時菌體生長至對數中后期；取培養液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入PH7.0的磷酸鹽緩沖液，再加入硫酸二乙酯，使其在混合液中的終濃度為1X，誘變20min;加入質量百分含量為25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應。將反應液離心，用生理鹽水洗滌兩次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養基中37t:培養2436h，將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養基上，3638。C厭氧培養4872h;挑選單菌落，接入到7.5X質量百分含量玉米醪培養基中，3638t:培養72h，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，選擇培養基中丁醇濃度和產物中丁醇產量都較高的突變株進行原生質體融合。2、原生質體融合將上述步驟1篩選到的丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的突變株分別接種至改良的CBM培養基中，363『C厭氧培養1224h，此時菌體處于對數生長中期；分別取培養液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.Omg/mL;待95%以上的細胞形成原生質體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀等量混合加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養基上，363『C厭氧培養3672h，分別挑取丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌突變株的單菌落接入到7.5%質量百分含量玉米醪培養基中，同時分別點接到含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養基中，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，選擇培養基中丁醇濃度和產物中丁醇產量都較高的融合子繼續進行化學誘變。3、化學誘變將上述步驟2獲得的融合子接種于RCM培養基中，3638。C厭氧培養3648h，此時菌體生長至對數中后期；取培養液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH6.0的磷酸緩沖溶液，再加入亞硝基胍(購于Sigma公司)，使其在混合液中的終濃度為0.2g/L，誘變30min，將反應液離心用生理鹽水洗滌數次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養基中37t:培養2436h，將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養基上，3638。C厭氧培養4872h;挑選單菌落，接入到7.5%質量百分含量玉米醪培養基中，363『C培養72h，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，選擇培養基中丁醇濃度和產物中丁醇產量都較高的突變株進行原生質體融合。4、原生質體融合將上述步驟3篩選到的突變株接種至改良的CBM培養基中，363『C厭氧培養1224h，此時菌體處于對數生長中期；取培養液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.Omg/mL;待95%以上的細胞形成原生質體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養基上，363『C厭氧培養3672h，挑取單菌落接入到7.5%質量百分含量玉米醪培養基中，同時分別點接到含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養基中，待醪蓋形成后測定丁醇的產量，得到丁醇產生菌突變株。實施例4、丁醇產生菌突變株對丁醇的耐受程度及丁醇的產量采用上述方法共獲得15株丁醇產生菌突變株。將上述獲得的丁醇產生菌突變株中的8株接種于含有表1所示丁醇終濃度的RCM培養基中，3638t:培養48120h，檢測突變株對丁醇的耐受性，結果這8株菌在表1所示丁醇終濃度的RCM培養基中生長良好；然后將上述8株菌以5%的接種量接種于上述7.5%的玉米醪培養基中，3638t:培養7296h，測定丁醇的產量。丁醇產量用高效液相法測定，條件為HPX-87H，柱溫15t:，檢測器為示差檢測器，流動相為O.05mmol/L112504，流速為0.5ml/L。以上實驗設三次重復，采用上述方法獲得的丁醇產生菌突變株對丁醇的耐受情況及丁醇產量的平均結果如表1所示。表l部分突變株對丁醇的耐受情況及丁醇產量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表1中可以看出，菌株DGF4對丁醇的耐受程度和丁醇的產量最高，可耐受19g/L的丁醇，培養該丁醇產生菌突變株，丁醇的平均產量為10.43g/L。丁醇產生菌突變株DGF4，經16srRNA基因序列分析(丁醇產生菌突變株DGF4的16srDNA序列如序列表中序列1所示)及生理生化特征分析，鑒定為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4已于2008年12月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN22799。序列表〈160>1〈210>1〈211>952〈212>DNA〈213〉丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)〈400〉1ctgattcgcgattectegcaactccggcttcatgteggcgagtttcagccactgggatggggttttgagttttgctccaccttgcggtettgcatcttttattgtegcacgtgtgtegccctegacateaggggcatgatgatttgacgtttcctcccggtteacccgggcagtctcactagagtgctcaacteaatgttgateagggttgcgctcgttgcgggactteacccaacatctcacgacacgaaccatgcaccacctgtcatcctgtccccgaagggacttcatccattecgggagatgtcaagtcteggteaggttcttcgcgttgcttcgaatteaaccactecaatccga60tgtccccacc120catccccacc180agc朋cteat240gctgacgaca300acteattcag360atgctccgct4209gcttgtgcgggtccccgtcaattcctttgagtttteatcttgcgaccgtecttcccaggc■gg皿tecttettgtgtteactgcggcarag皿ggagtcgatecctcctecacctegtett540catcgtttecggcgtggactaccagggtetcteatcctgtttgctccccacgctttcatg600cctcagcgtcagttecagtcC3g皿ggCCgccttcgccactggtettcttccteatctct660acgcatttcaccgctecactagg皿ttctgccttcctctcctgcactccagacatccagt720gcccccaagtteagcccggggatttcacatctcactteaatetccgccte780cacatcctttacgcccagte皿tCCgg3C3acgcttgccacctecgtettaccgcggctg840ctggcacgtegttegccgtggcttcctcctatggteccgtcattetcgtcccate3g3C3■gagttttecgatccg^gaccttcatcactcacgcggcgttgctgcatca95210權利要求一種獲得丁醇產生菌突變株的方法，包括以下步驟1)將丁醇產生菌進行化學誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株之間進行原生質體融合，得到融合子；3)將上述步驟2)獲得的融合子進行化學誘變，得到突變株；4)將上述步驟3)獲得的突變株之間進行原生質體融合，得到丁醇產生菌突變株。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述步驟4)獲得的丁醇產生菌突變株進行化學誘變，將經過誘變的丁醇產生菌進行原生質體融合，得到丁醇產生菌突變株的步驟。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述權利要求2的過程至少重復一次。4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述化學誘變所使用的誘變劑為甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯和/或亞硝基胍。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述誘變劑為硫酸二乙酯和亞硝基胍，所述硫酸二乙酯的終濃度為0.2-1%，優選為0.5%，所述誘變時間為10-40min，優選為15min;所述亞硝基胍的終濃度為0.l-lg/L，優選為0.2g/L，所述誘變時間為10-50min，優選為30min。6.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述原生質體融合中，培養突變株的培養基的組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素BJmg/L，其余為水。7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述丁醇產生菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)及糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutyricum)，優選為丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287。8.—種制備丁醇的方法，是培養按照權利要求1-7中任一所述的方法得到的丁醇產生菌突變株，得到丁醇。9.丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4，其保藏號為CGMCCN22799。10.—種原生質體融合用培養基，其組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素BJmg/L，其余為水。全文摘要本發明公開了一種獲得丁醇產生菌突變株的方法。該方法包括以下步驟1)將丁醇產生菌進行化學誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株之間進行原生質體融合，得到融合子；3)將上述步驟2)獲得的融合子進行化學誘變，得到突變株；4)將上述步驟3)獲得的突變株之間進行原生質體融合，得到丁醇產生菌突變株。本發明以丙酮丁醇梭菌SMB1CGMCCNo.2287為出發菌株，采用化學誘變和原生質體融合交替進行的方法，最終得到對產物有較高耐受性的丁醇產生菌突變菌。采用本發明方法獲得的丁醇產生菌突變株DGF4對丁醇的耐受性可達19g/L，丁醇的產量為10.43g/L。文檔編號C12R1/145GK101748114SQ20081023955公開日2010年6月23日申請日期2008年12月12日優先權日2008年12月12日發明者張天瑞,張延平,李寅申請人:中國科學院微生物研究所