專利名稱：表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用。
背景技術：
凝乳酶是從未斷奶的小牛皺胃中提取的一種天冬氨酸蛋白酶，它可以切斷k _酪蛋白導致乳的凝固。凝乳酶主要的生物學功能是水解牛乳中k -酪蛋白的Phe皿-Met皿鍵，導致牛乳凝結，因此被廣泛用于干酪制造業，這個過程應用在干酪生產的第一階段。傳統的凝乳酶通過宰殺未斷奶小牛從皺胃中提取。目前世界年均約5000萬頭小牛被宰殺供提取凝乳酶，由于全球性的小牛短缺使其來源變得不穩定，這種傳統而昂貴的制法已不能滿足世界干酪需求量不斷增長的需要。利用微生物生物工程技術生產凝乳酶可以獲得高純度的凝乳酶，生產成本低，來源穩定。目前美國有70 % 、英國有90 %的干酪是用生物工程凝乳酶生產的。 我國自80年代就開展了凝乳酶的研究，1988年，譚思元等人研究了凝乳酶原mRNA的分離及其cDNA的克隆，成功分離了 poly (A) RNA中含有全鏈長的凝乳酶原mRNA，并通過拼接pCT5及pCT15獲得完整的凝乳酶原基因。中科院微生物所研究了凝乳酶原分子折疊和酶復性(唐兵，楊開宇1997 ;黎紅曄等1998 ;陳紅杰等2001)，并通過進一步對大腸桿菌中表達調控的研究，在大腸桿菌中表達了牛凝乳酶(王革等1994)。王志林等(2003)克隆了木瓜凝乳酶基因。 我國僅有一項關于牛凝乳酶基因工程的技術專利-大腸桿菌中表達外源基因的質粒和牛凝乳酶原的生產方法(ZL95105337X)。在凝乳酶的提取方面，有一項關于從犢牛皺胃中提取凝乳酶的技術專利，一項關于從木瓜中提取蛋白酶的技術專利(CN200410046107. 6)。 畢赤酵母表達系統具有表達量高、能進行蛋白質翻譯后修飾、容易大規模生產、生產成本低、外源蛋白基因遺傳穩定性較好等特點，目前國內外已有數百種外源蛋白基因在畢赤酵母中表達。Pichia. pastoris基因表達系統除了具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優點(l)具有醇氧化酶A0X1基因啟動子，這是目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一 ；(2)表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合；(3)菌株易于進行高密度發酵，外源蛋白表達量高； (4)畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細胞的毒害作用。目前，在我國尚未見到利用畢赤氏酵母表達牛凝乳酶的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用。 本發明所提供的表達凝乳酶的畢赤酵母，是將凝乳酶基因導入畢赤酵母中獲得表
達凝乳酶的重組菌。 其中，所述凝乳酶基因來源于從小牛鈹胃。
所述凝乳酶基因的核苷酸序列具體是序列表中的序列1。畢赤酵母表達系統具有 很高的生物安全性，獲得包括美國FDA在內的廣泛認可。它能夠對外源蛋白進行翻譯后加 工，使之更接近于天然蛋白的構象和活性，是一種廣泛應用的真核表達系統。所述畢赤酵母 具體可為畢赤酵母GS115。 本發明的另一個目的是提供一種構建所述重組畢赤酵母的方法，包括如下步驟
1)在酵母表達載體的多克隆位點插入凝乳酶基因構建重組酵母表達載體；
2)將所述重組酵母表達載體導入畢赤酵母中獲得表達凝乳酶的重組菌。
其中，所述酵母表達載體可為pPICZaA載體。所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115。
本發明構建的表達凝乳酶的畢赤酵母中的一株命名為畢赤酵母DS115/pPICZaA/ Chy，畢赤酵母DS115/pPICZa A/Chy(Pichia pastoris)已于2008年11月12日保藏于中 國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為中國武漢武漢大學)，保藏號為CCTCC NO.M 208217。 本發明所述的重組畢赤酵母可用來生產凝乳酶。 本發明首次在畢赤酵母表達系統中分泌表達了牛凝乳酶，分泌表達無需破碎細胞 且培養基中雜蛋白含量極低，純化步驟簡單，適宜工業化生產。畢赤酵母適合于工業規模的 高密度發酵，培養基廉價，操作簡單，產物具有很好的生物安全性，適用于食品和醫藥等領 域。
圖1為Xhol和Xbal酶切鑒定重組菌。
圖2為酵液上清的SDS-PAGE電泳檢測結果。
具體實施例方式
實施例1、表達牛凝乳酶的畢赤酵母
1)牛凝乳酶Chy的克隆 從剛出生的小牛皺胃中提取粘膜，加入液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液 氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/ml Trizol加入Trizol，轉入離心管。室溫放置 10min，使其充分裂解，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。 4°C 12，000g離心15min，吸取上層水相，至另一離心管中，按0.5ml異丙醇/ml Trizol加 入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。 4°C 12， OOOg離心10min，棄上清，按lml 75X乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4°C 8， 000g離心5min，棄上清，室溫晾 干5-10min，用70ul TE溶解總RNA，用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。
設計引物Pl和P2，擴增牛凝乳酶基因，引物Pl和P2的核苷酸序列如下
Pl :5' ATGAGGTGTCTCGTGGTGCTAC 3';
P2 :5' GGGACAGTGAGGTTCTTGGT 3，。
PCR反應體系如下 10X PCR Buffer Minus Mg 5 ii 1、50mM MgCl2 1. 5ii l、10mM dNTP Mix 1 ii l、20uM P10. 5ii l、20uM P20. 5ii 1、Plati咖tag DNA polymerase (5U/ii 1) 0. 4 ii 1、cDNA 2iU、DEPC 水39. lii l，總體積50iU。
反應條件94。C變性30s，52。C退火30s、72。C延伸90s、32次循環，72。C延伸 lOmin。 用Fermentas公司的DNA Extraction Kit試劑盒(#K0513)回收PCR產物，PCR
產物與pMD18-T載體16。C連接，構建重組載體pMD18-Chy，重組載體pMD18_Chy轉化大腸桿
菌JM109感受態細胞，獲得重組菌，挑取重組菌單克隆，提取質粒，進行測序，測序結果表明
擴增的牛凝乳酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。 2)表達牛凝乳酶(Chy)的畢赤酵母的構建 設計引物ZaAPreSl和ZaAPreS2，引物的核苷酸序列如下 ZaAPreS 1 :5' CGCTCGAGAAAAGAATGAGGTGTCTCGTGGT 3'(下劃線為Xho I酶切位 點)(AAAAGA為pPICZ a系列載體a分泌因子的Kex2切割位點) ZaAPreAS2 :5' TGCTCTAGAATGATGGCTTTGGCCAGCC 3'(下劃線為Xba I酶切位點)
以ZaAPreSl和ZaAPreS2為引物，重組載體pMD18_Chy作為模板，用TaKaRa公司 的Ex Taq酶進行PCR擴增。 反應條件94t:預變性5min ;然后進行94°C變性30s， 52°C退火30s、72°C延伸 90s， 32次循環；72。C延伸10min。 用Fermentas公司的DNA Extraction Kit試劑盒(#K0513)回收PCR產物，PCR產 物用Xhol和Xbal雙酶切與用同樣酶切的pPICZaA載體在T4DNA連接酶的作用下22。C連 接，構建重組表達載體pPICZaA-Chy，重組載體pPICZaA-Chy轉化大腸桿菌JM109感受態細 胞，獲得重組菌，挑取重組菌單克隆，提取質粒用Xhol和Xbal進行雙酶切，酶切產物進行瓊 脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖1所示。酶切產物中目的條帶在1. 7kb左右的克隆為陽性克 隆。圖1中，"l"為Marker, "2"為重組菌酶切產物。 重組載體pPICZaA-Chy和pPICZaA載體用Sacl酶切后，分別電轉化畢赤酵母 GS115感受態細胞，獲得重組菌，重組菌用匪H和MDH平板篩選，整合Chy基因的畢赤酵母 p-Chy和轉入pPICZaA載體的畢赤酵母pA。
匪H平板由如下物質組成 1. 34g/100mlYNB，4X10—5g/100ml生物素，0. 5ml/100ml甲醇，0. 04g/100ml組氨
酸，1.5g/100ml瓊脂。 MDH平板由如下物質組成 1. 34g/100mlYNB，4X10—5g/100ml生物素，2g/100ml葡萄糖，O. 04g/100ml組氨酸， 1. 5g/100ml瓊脂。 挑選畢赤酵母p-Chy和畢赤酵母pA單菌落于BMGY培養基中，30°C /300rpm培養 至0D6。。 = 2-6 ;收集菌體，用B匪Y重懸菌體，使0D6。。 = 1. 0左右，向培養基中添加100%甲 醇至終濃度為0. 5% ;每24小時添加甲醇至終濃度0. 5%，96h后結束誘導，SDS-PAGE電泳 檢測誘導96h后發酵液上清。
BMGY培養基組成成分 lg/100ml酵母粉，2g/100ml蛋白胨，lOOmM p朋.0磷酸鉀，1. 34g/100mlYNB， 4X 10—5g/100ml生物素，lg/100ml甘油。
B匪Y培養基組成成分 lg/100ml酵母粉，2g/100ml蛋白胨，lOOmM p朋.0磷酸鉀，1. 34g/100mlYNB，4X10—5g/100ml生物素，O. 5ml/100ml甲醇。 SDS-PAGE電泳結果如圖2所示，在分子量42kDa處有明顯的條帶，略大于天然牛凝 乳酶，這是由于重組蛋白上帶有表達載體的部分片段，使目的蛋白的大小增加。使用Gelpro 軟件對蛋白條帶進行掃描分析，表達蛋白占上清總蛋白的28. 7 % 。 圖2中，"l"代表誘導96小時畢赤酵母pA的發酵液上清，"3"代表誘導96小時畢 赤酵母P-Chy的發酵液上清。 取畢赤酵母p-Chy誘導96小時的發酵液1L，使用Bradford法測菌液總蛋白含量 為0. 92g/L。 3000g離心5min，收集上清液，使用Bradford法測上清液蛋白含量為0. 18g/ L。經計算得到表達Chy蛋白約占細胞總蛋白的5.6X (計算方法為0.18X28. 7%/0. 92 =0. 056)。然后加入飽和過硫酸銨溶液至過硫酸銨終濃度為60%，41:放置過夜。12000g 離心10min，收集蛋白沉淀，真空冷凍干燥，得到Chy酶制劑4. 3g。
Bradford法測總蛋白含量的步驟如下 1、分別在各個玻璃試管中加入5， 10， 15， 20， 25， 30， 40， 60， 80， 100 ii 11mg/mL BSA，
以雙蒸水補足100iil，同時以100 iil的雙蒸水作空白對照。 2、每管加入lml考馬氏亮藍溶液，振蕩混勻，室溫放置2分鐘。 3、用lcm光徑的微量比色檢測A595，取A595吸光度值對標準蛋白濃度作圖，畫出
標準曲線，用Excel求出標準方程。 4、取100 iU稀釋后的待測樣品，加入同樣體積的考馬氏亮藍溶液lml，搖勻，室溫 靜置2分鐘，以空白管調零比色，將吸光度值代入標準方程，算出樣品的蛋白質濃度。
取畢赤酵母pA誘導96小時的發酵液1L， 3000g離心5min，收集上清液，然后加入 飽和過硫酸銨溶液至過硫酸銨終濃度為60%，41:放置過夜。12000g離心10min，收集蛋白 沉淀，真空冷凍干燥，得到pA酶制劑4. 86g。
3)凝乳酶酶活測定 采用Arima K的方法進行凝乳酶活的測定。用0. Olmol/L CaCl2溶液配制10%脫 脂乳。此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5ml 10%脫脂乳于35。C保溫10min，分 別加入適量稀釋的Chy酶制劑和pA酶制劑，震蕩均勻并開始計時，觀察管壁上開始出現凝 乳顆粒為終點，記錄凝乳時間。在上述條件下，40min凝結lml 10%脫脂乳的酶量定義為一
個Soxhlet單位(SU)，凝乳酶活力=:=，x ^ ;實驗重復3次，結果以三次重復的
平均值表示。 凝乳酶活的測定結果表明，Chy酶制劑的活力為1000SU/g(4300SU/L發酵液)，pA 酶制劑未檢測出凝乳活力。 Chy酶制劑的活力為1000SU/g的畢赤酵母p-Chy命名為畢赤酵母DS115/ pPICZa A/Chy，畢赤酵母DS115/pPICZa A/Chy已于2008年11月12日保藏于中國典型培 養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為武漢大學)，保藏號為CCTCC NO. M 208217。
序列表 〈110〉吉林省農業科學院 〈120〉表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用
〈130〉CGGNARW81997
6
〈160>1〈210>1〈211>1279〈212>DNA〈213〉牛屬牛〈400>1ggggc腿cgtcagcgtcagcttgcatgccttggtcagcg3tgtg3tC3gatggctttggagacgctgteatectctcggatg朋朋catcactctggaagccactggtecagaagccctgtgggt織ttttgccattg3tctC3朋g3agtcgatgtcaaactcaccgtectggttctggatgtcgctgctgggcccgaccagcttggC3CCCtC3C3ggccacaaccacaccgctgaactgctgcactgtcacgggcacccagtgcacccccagcgtgagcatgctctcctggccatgggccaccaggtgcctgttcatcatgttgtgcg郷ggteggccatccccaggatcccgtgctcctgggtgctcaggcctactgtctgcttgtcategcccaggatgccctgcatgctgcccaggttctgg朋ggtgg3Cgactttctcgtgctcttgcagt卿t卿gggtecccagatgaactcctggggcggggtcccgaggtagatggtc郷ggcacgctggccacctccccgagctgtttctgcagg朋gtcctccagaagcctgcctttgtecagagggatcctggtgatctgtagcaccacgagacacctcateatctcteaatgcatgtc atgttcctt
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gaggatccccgggtaccgag ctcgactcgt1260
1279
權利要求
一種重組畢赤酵母，是將凝乳酶基因導入畢赤酵母中獲得表達凝乳酶的重組菌。
2. 根據權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于所述凝乳酶基因的核苷酸序列 是序列表中的序列1。
3. 根據權利要求1或2所述的重組畢赤酵母，其特征在于所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115。
4. 根據權利要求3所述的重組畢赤酵母，其特征在于所述重組畢赤酵母為畢赤酵母 GS115/pPICZ aA/Chy CCTCC M 208217。
5. —種構建權利要求1至4中任一所述重組畢赤酵母的方法，包括如下步驟1) 在酵母表達載體的多克隆位點插入凝乳酶基因構建重組酵母表達載體；2) 將所述重組酵母表達載體導入畢赤酵母中獲得表達凝乳酶的重組菌。
6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述酵母表達載體為pPICZaA載體。
7. 根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115。
8. 權利要求1至4中任一所述重組畢赤酵母在生產凝乳酶中的應用。
9. 權利要求5至6中任一所述方法在生產凝乳酶中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用。本發明的重組畢赤酵母，是將凝乳酶基因導入畢赤酵母中獲得表達凝乳酶的重組菌。所述凝乳酶基因的核苷酸序列是序列表中的序列1。本發明還公開了構建所述重組畢赤酵母的方法。本發明的重組畢赤酵母可用來生產牛凝乳酶。
文檔編號C12N9/64GK101748077SQ20081023947
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者姜媛媛, 張莉, 李玉秋, 楊貞耐, 王景會 申請人:吉林省農業科學院