高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法

專利名稱：高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學中分子克隆技術領域，特別涉及一種高通量克隆核酸 分子的方法，并將高通量克隆的分子分別固定在固相載體上，形成高通量的分子 克隆芯片。
二背景技術：
現有技術人類基因組(測序)計劃已經完成，后基因組計劃已步入實施。 研究基因在生命過程中的功能，也就是功能基因組學，成為全世界生命科學工作 者共同的課題。功能基因組研究的目的是要認識基因組中每個核酸的生物學含 義，發現疾病易感基因。功能基因組的研究途徑是比較基因組學，即通過比較和 分析不同表型個體之間基因組序列差異，解碼基因組中每個核酸的生物學意義， 發現功能基因，識別與疾病相關的分子遺傳信息。進一步地，根據個體基因組信 息，實現疾病的預測、預防和個體化治療。隨著功能基因組研究的發展以及人們 對提高醫療健康水平的不懈追求，"個體化醫療"已開始進入人們的生活。為了真 正實現"個體化醫療"這一目標，首先要對每個人的基因組進行再測序，找出不同 個體在DNA序列上的差異與不同疾病、發育等的相關性。采用目前的測序技術 進行大規模個體全基因組DNA的測序，即對大量的人類個體的基因組DNA (包 含有30億堿基)進行再測序，其成本仍太高。這嚴重地限制了功能基因組的研 究進展，影響到人類基因組計劃的研究成果的應用。而對于目前的基因組測序成 本而言，"個體化醫療，，仍然是人類的一個遙遠的夢想。因此，快速、經濟地對大 量個體全基因組進行測序成為當今挑戰科學家的一項重大課題，人們急需發展出 一些快速、廉價的個體化基因信息檢測技術來解決目前所存在的問題。這有利于 人們更加深入地從分子層次上認識生命過程的機理，從根本上認識疾病產生的根 源，在分子層次上進行疾病的預測、診斷和治療，將會使醫學臨床實踐產生革命 性的變化。
傳統的測序方法，如1998年推出的ABI Prism 3700 DNA自動化測序儀以 及ABI Prism 3730 DNA測序儀，測序時間長花費大。主要有兩個原因，首先是模板制備。傳統的模板制備方法是將待測基因組分成許多片斷，然后將每個片斷 插入克隆載體，轉化大腸桿菌后平板培養，挑取克隆，擴大培養后提取質粒，然 后送測序儀測序。因為在挑取大腸桿菌克隆的過程中，每次挑取的克隆都很有 限，而且操作煩瑣，需要投入大量的人力物力和財力。其次是測序過程。由于測 序樣本都是單個克隆，每臺機器一次只能測序96個樣本，因此要測序30億堿基 的人類基因組序列，需要耗費大量的時間及測序用藥品試劑，從而導致人類基因 組測序時間長、耗費大，無法實現個體化測序。有人統計，采用ABI Prism 3730 DNA測序儀測序，平均每個堿基的成本是0.008美元，完成一個30億堿基 的測序，需要150臺ABI Prism 3730 DNA測序儀運轉一年，測序成本達到二千 四百萬美元。
在對傳統基因測序方法進行改進的過程中，美國454公司首先推出了一種新 的測序方法。該方法將DNA測序成本降至目前成本的1/100倍。該技術目前已 成功進入市場化運作。該方法基于焦磷酸測序與高通量模板制備兩個重要技術， 其中高通量模板的制備對于成本的降低及測序速度的提高起了重要的決定性作 用。該公司將微球固定技術、linker-PCR與乳液P C R技術相結合，能夠通過一 次P C R擴增，同時將大量的待測序模板克隆出來并固定在不同的微球個體上， 然后再將單個微球固定在一個凹槽內，形成高密度的微球陣列，再進行高通量并 行測序。該方法雖然將測序技術往前推進了一步，但仍然存在著一些問題，如模 板制備較為煩瑣，條件較難控制，成本較高等。而且該技術離生物科學家們提出 的一千美元人類基因組測序的目標還有相當大的差距。在改進4 5 4測序技術的 過程中，Solexa公司采用橋式P C R擴增與生物芯片技術制備測序模板，雖然他 們這項技術也已成功上市，但成本仍然很高。Solexa公司制備的測序模板芯片通 量雖然很高，但他們的制備的模板量極少，只能通過他們的四色熒光測序法才能 實現高通量測序，但四色熒光測序成本極高，因此改進測序模板制備方法，既能 實現高通量測序，又能適用于價格低廉的測序方法，是本發明的目的所在。
針對目前DNA測序模板制備的需要，本發明采用乳液核酸分子擴增法將待 克隆分子擴增，擴增后將乳液顆粒凝固，然后分離出克隆顆粒，并將顆粒均勻分 散在固相載體上，將每一個克隆產物固定在固相載體上。該發明改進了目前分子 克隆的制備技術，可用于高密度基因芯片制作及全基因組測序模板的制備，具有 十分重要的應用前景和使用價值。本發明不僅可用于高通量低成本測序模板的制 備，同時還可以用于SNP檢測以及DNA甲基化檢測技術的改進，從而使人們能 夠獲取大量的生物分子信息。
發明內容
技術問題本發明針對上述技術缺陷，提供一種高通量核酸分子克隆制備分 子克隆芯片的方法。改進了制備測序模板的，既能保證測序的高通量，又能降低 測序的成本。
技術方案 一種高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，制備步驟 為a.將待克隆核酸分子模板與核酸擴增反應體系試劑混合得擴增混合物溶液， 使得每微升擴增混合物溶液中含有的核酸模板分子數量為106~107,所述核酸擴 增反應體系試劑中的引物5'端修飾有生物素、醛基、丙烯酰胺基或氨基化學基 團；b.向上述擴增混合物溶液中加入高分子化合物，所述高分子化合物能夠在降 低溫度或加熱處理后使得溶液凝固成凝膠狀；c.向步驟b所得溶液中加入兩倍其 體積的油相進行乳化，得到油包水的乳濁液，乳液顆粒的粒徑為5pm士2.5^im,所 述油相的體積比組成為95%礦物油、4.5% Span 80、 0.4%Tween80、 0.1%Triton-X-100; d.將步驟c所得乳濁液置于PCR儀或恒溫器中，進行核酸擴增反應；e.核 酸擴增反應結束后，降低乳濁液溫度，直至上述乳濁液中的溶液凝固成顆粒，形 成核酸分子克隆顆粒；f.將步驟e所得乳濁液中的油相去除，分離出核酸分子克 隆顆粒；g.將步驟f所得核酸分子克隆顆粒隨機分散在固相載體上，然后升高固 相載體溫度，直至核酸分子克隆顆粒溶解，使溶液中的核酸擴增產物固定在固相 載體上，然后清洗去除高分子化合物，在固相載體表面上形成核酸分子克隆陣 列，由此得到克隆芯片。
上述被克隆模板是單雙鏈線形或單雙鏈環形的DNA、 RNA、 PNA或LNA。 上述核酸擴增反應是乳液PCR擴增、乳液RT-PCR擴增或乳液滾環擴增。 上述核酸擴增反應溶液中加入的高分子化合物是淀粉、瓊脂糖或丙烯酰胺。 上述固相載體是表面修飾了一層親合素、氨基、丙烯酰胺硅烷或醛基化學基 團的玻片或^s圭片。
上述乳化方法為震蕩器震蕩法、超聲乳化法或高速攪拌法。
有益效果本發明采用了微乳液核酸擴增反應，能夠將大量的模板同時平行 克隆擴增出來。本發明將核酸擴增溶液，如PCR擴增反應溶、滾環擴增溶液，與 一定比例的油相混合液(礦物油、Span 80、 Tween、 Triton-X-100)混合，在超聲 波破碎作用下反應溶液形成微液滴，微液滴外面包裹一層油。在Span 80、 Tween 和Triton-X-100這些乳化劑的作用下這種油包水的微乳濁液較為穩定。每個乳液 滴的直徑大小可以通過調整超聲波的強度改變，超聲波功率越大，液滴直徑越 小。該發明將核酸擴增模板無限稀釋，為了保一個微液滴內只有一個模板，許多微乳液滴內沒有模板。然后該微乳濁在一定的溫度變化循環或一定的溫度下，液 滴內的模板被大量擴增，但液滴之間的擴增產物彼此又沒有交叉污染，因此大量 的模板同時平行得到克隆擴增。
微乳液核酸擴增反應避免了某些基因擴增的偏向性和錯誤的基因重組。某些 擴增反應，如普通PCR擴增，擴增產物具有較大的偏向性，其中較短的片斷容易 擴增，GC含量低的片斷較容易被擴增，因此在大量片斷擴增過程中，最終的反 應液中小片斷和GC含量低的片斷較多，而大片斷與GC含量高的片斷較少。另 外，許多模板一起擴增的過程中容易出現重組的現象，從而出現一些錯誤片斷出 來。該發明每個液滴內不含有或只含有一個模板，在擴增過程中不會出現上述錯 誤現象。
該發明在微乳反應液中加入了瓊脂等高分子化合物，在一定條件下該高分子 化合物溶液能夠凝固成顆粒；不加高分子化合物的溶液，進行低溫處理后也使擴 增反應液微液滴凝集成冰顆粒，這些顆粒可以通過萃取等方法將顆粒與油相分 開。這是該發明非常關鍵與重要的一點內容。由于乳液滴在去除油相后將互相融 合在一起，從而將每個克隆的產物混合在了一起無法分開。該發明在形成乳液之 前，溶液內加入一定量的高分子化合物，如瓊脂糖，形成高分子化合物溶液，在 擴增反應結束后，通過降低溫度等方法(見實施例2~4，其中每一個顆粒就是一 個分子的克隆。也可以在溶液中不加高分子化合物，而是通過低溫處理將水溶液 變成水顆粒(見實施例2 ~ 4),從而將每個克隆分開。
該發明在微乳反應液中加入的高分子化合物在一定條件下可以溶解成溶液， 從而使溶液中的擴增產物有機會固定在固相載體上。該發明在擴增反應液中加入 的高分子化合物在一定條件下溶解在水里，變成水溶液，通過改變溫度或其他條 件，該高分子化合物可以發生凝固，形成凝膠或其他顆粒。 一旦條件發生了改 變，該顆粒又重新發生溶解，重新形成溶液狀態，從而可以方便核酸的固定(如 低熔點瓊脂糖，見實施例2-4)。
該發明采用上述分子克隆顆粒能夠制備出高質量的分子克隆核酸芯片。在該 發明中，擴增反應所使用的一條引物或多條引物的5'端修飾了一個基團，如生物 素，而固相載體表面也修飾了 一個與引物修飾基團能夠通過穩定的化學鍵相結合 的基團。當分子克隆微粒與油相分開后，采用一定的方法(見實施例2-4)將微 粒分散鋪于固相載體上，然后改變溫度或其他條件，使微粒熔化成水溶液顆粒， 溶液中的核酸分子的5'端修飾的基團與固相載體上修飾的基團發生生物或化學反 應，使帶有修飾基團的核酸鏈固定在固相截體上，從而形成高通量的分子克隆芯 片，以進行下一步的測序或雜交檢測。由于。由于擴增反應是在每個樣i乳液滴中獨立進行的，擴增產物之間沒有交換過程；形成顆粒后，每個顆粒之間沒有液體
流動，也不會出現克隆之間的產物交換；在固相載體上固定過程中，每個點之間
彼此都有一段距離，因此也行不成分子克隆之間的污染。在普通的微陣列芯片中 由于在一個陣列點上要固定大量的同一核酸序列的片段作為檢測探針，這些核酸 片段的純度，以及在制備過程中的污染將會直接影響的該陣列點的檢測質量。在 美國埃菲公司用微電子光刻工藝制備的高密度的核酸微陣列芯片，由于核酸原位 化學合成的產率較低，在芯片的每個陣列點上將會有較多的合成錯誤的核酸探 針，這將在很大的程度上影響該芯片雜交的檢測準確性。
該發明采用上述分子克隆顆粒能夠制備出高密度而且模板量較大的分子克隆 核酸芯片，而且成本較低。采用微乳液擴增方法可以將微乳液顆粒制備成直徑為 幾微米和納米基的微粒，然后將微粒固定在固相載體上形成直徑為幾微米和幾百 納米的點陣。該發明是采用液態分子擴增的方法來克隆核酸分子的，液態擴增效 率比固相擴增效率高，能夠使模板量極大的得以增加，而且擴增成本較低。這對 于低成本但需要較大量測序模板的測序方法具有重要應用價值。
該發明內容包括乳液滾環擴增反應，滾環擴增具有恒溫、高效、保真性能 高、擴增無偏向性報導等特點。乳液滾環擴增反應是指將滾環擴增反應溶液與一 定比例的油相混合乳化，形成乳濁液，每個待擴增的模板分別在不同的乳液顆粒 中發生滾環反應，同時擴增出大量的分子克隆。該項技術是基于超支滾環擴增發 展起來的一項高通量克隆制備技術。超支滾環擴增是在恒溫條件下進行的，而且
擴增效率極高，在相同時間內擴增產物量是PCR擴增產物的十幾倍甚至幾十倍， 而PCR的擴增反應需要一個溫度循環過程，所以需要一個PCR儀這種特殊的裝 置，而超支滾環擴增是在恒溫條件下進行，只要有一個恒溫的條件即可。超支滾 環擴增采用Bst酶或phi29兩種酶擴增，這兩種酶由于它們的擴增方式與PCR擴 增不同，因此具有較高的保真性。PCR擴增技術對于不同序列的核酸模板其擴增 效率有很大的偏差，這極大地影響被測序基因組的測序覆蓋率。而本發明采用的 超支滾環擴增方法，對于不同的才莫板序列該方法已裙:證明沒有擴增的偏向性。
本發明中制備的分子克隆，能夠方便地制備出相應的單鏈分子克隆，可用于 雜交、測序等應用。因為擴增產物的一條鏈的5'端修^飾有一個基團，該基團能與 固相載體上的另 一個基團發生反應而將該條鏈固定在固相載體上，另 一條鏈則可 以通過變性的方法將其去除。剩下的一條單鏈，更加容易雜交與延伸檢測。目 前，有些公司，如美國454公司，采用微球與乳液PCR相結合的方法進行克隆制 備，由于這項技術需要把兩條引物都要進行固定，所以通過PCR反應后，微球上 兩條鏈都被固定下來，這樣在延伸或雜交過程中難免會產生干擾。四

圖1為工作原理圖其中a:擴增反應液與油相乳化后的乳濁液；b:擴增溶 液凝固顆粒；c:修飾了一層活性基團的固相載體；d:顆粒溶解成溶液液滴或 DNA分聚集到固相載體表面；e:固定在固相載體上的單鏈核酸克隆分子。1:擴 增反應液與油相乳化成乳濁液后，在一定條件下進行相應的乳液擴增反應；2: 去除油相物質，將溶液顆粒洗脫出來；3:將溶液顆粒隨機的均勻分散在固相載 體上；4:在一定條件下，將反應液顆粒溶解成溶液液滴，或者將DNA聚集在固 相載體表面，然后克隆核酸分子與固相載體上的活性基團發生反應，將核酸分子 牢固地固定在固相載體上；5:除去反應溶液及另一條沒有固定的核酸分子。
圖2為大量分子克隆固定在固相載體上雜交;^測結果圖，每個點的大小直徑 在1陽10微米。
五具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡迷本發明。應理解，這些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之 后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本 申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例1
一種高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，制備步驟為a.將待 克隆核酸分子模板與核酸擴增反應體系試劑混合得擴增混合物溶液，使得每 微升擴增混合物溶液中含有的核酸^t板分子數量為106~107,所述核酸擴增 反應體系試劑中的引物5'端修飾有生物素、醛基、丙烯酰胺基或氨基化學基 團；b.向上述擴增混合物溶液中加入高分子化合物，所述高分子化合物能夠在 降低溫度或加熱處理后使得溶液凝固成凝膠狀；c.向步驟b所得溶液中加入兩 倍其體積的油相進行乳化，得到油包水的乳濁液，乳液顆粒的粒徑為 5nm士2.5nm,所述油相的體積比組成為95%礦物油、4.5% Span 80、 0.4% Tween80、 0.1% Triton-X-100; d.將步驟c所得乳濁液置于PCR儀或恒溫器 中，進行核酸擴增反應；e.核酸擴增反應結束后，降低乳濁液溫度，直至上述 乳濁液中的溶液凝固成顆粒，形成核酸分子克隆顆粒；f.將步驟e所得乳濁液 中的油相去除，分離出核酸分子克隆顆粒；g.將步驟f所得核酸分子克隆顆粒隨機分散在固相載體上，然后升高固相載體溫度，直至核酸分子克隆顆粒溶 解，使溶液中的核酸擴增產物固定在固相載體上，然后清洗去除高分子化合 物，在固相載體表面上形成核酸分子克隆陣列，由此得到克隆芯片。被克隆 模板是單雙鏈線形或單雙鏈環形的DNA、 RNA、 PNA或LNA。核酸擴增反 應是乳液PCR擴增、乳液RT-PCR擴增或乳液滾環擴增。核酸擴增反應溶液 中加入的高分子化合物是淀粉、瓊脂糖或丙烯酰胺。固相載體是表面修飾了 一層親合素、氨基、丙烯酰胺硅烷或醛基化學基團的玻片或硅片。乳化方法 為震蕩器震蕩法、超聲乳化法或高速攪拌法。
實施例2采用乳液PCR擴增與瓊脂糖凝膠顆粒固定制備核酸分子克隆陣列 具體的實施方案如下
兩邊接有連接子的基因組擴增模板的制備
基因組DNA的超聲波處理選取功率1200w超聲波儀，將基因組DNA隨 機打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段兩端與通用連接子連接將超聲波獲取的隨機片斷純化處 理，去除一些小的和破碎的片斷，然后分別采用T4多聚核苦酸激酶、T4 DNA 聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一 個 TA 粘性末端，然后與 一 個通用連接子 (linkerl: 5，-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3， linker2: 5'-CGCCTTGGCCTCCGACT-3')連 接，使基因組片斷兩端連接上兩個通用的連接子。
兩邊接有連接子的基因組在加有瓊脂糖的乳液PCR中擴增與瓊脂糖顆粒的純
化
加有瓊脂的乳液PCR擴增反應在PCR反應體系30 jJ中，其中5，-生物素-ACGGCCGCCTTGGCCTCCGAC -3，作為引物加入20 pmol, 10x的緩沖液3 Mg2+1.8 mmol/L， dNTPs200 nmol/L,有效DNA模板量約為107 - 108拷見，T叫 DNA聚合酶1U，在該溶液中加入一定量的瓊脂，達到1.5%的濃度(W/V)。同 時制備一定量的油相物質，其中按體積分數計含有礦物油95%, Triton-X-100 0.1%， Tween 80 0.4%, SP 80 4.5%，然后液體溶液與油相按照1: 2混合，混合 后將溶液在65。C條件下振蕩與超聲波乳化，乳化后的乳濁液(a)中的液滴大小 平均約為5微米左右。將上述乳濁液分成兩管，每管內含乳濁液45微升，置于 Gene Amp 2400 PCR System上進行如下PCR擴增95。C預變性5分鐘，然后95。C變性l分鐘，62。C復性1分鐘，72。C延伸30秒，共35個循環，最后，72。C 再延伸7分鐘。
瓊脂糖顆粒的純化將上述PCR擴增反應乳濁液置于4。C半小時，然后取出 后在乳濁液(a)中加入2.5倍體積的乙醚，然后5000轉離心10分鐘，棄去上面的 溶液，回收到的就是瓊脂糖顆粒(b)，大部分瓊脂糖顆粒中每個瓊脂顆粒都含 有一個才莫板分子的PCR克隆產物。
基片的表面親合素修飾
基片清洗選擇大小合適的低熒光背景的全反射玻片作為固相載體(c)， 用洗衣粉清洗玻片的表面，然后用去離子水沖洗表面。將沖洗過的玻片置于盛有 去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌后的玻片放置在含有10% NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最后用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘 干備用；
玻片的醛基化處理將上述洗滌干凈的載玻片用95%(V/V)乙醇與硅烷按 49: 1 (體積比)配成的硅烷化試劑浸泡玻片30分鐘，再用95% (V/V)乙醇清 洗，雙蒸水洗凈，然后氮氣吹干玻片，然后置于110 °C烘干30分鐘。將已氨基 化處理的玻片用95% (V/V)乙醇浸泡搖洗5分鐘后，雙蒸水沖洗，吹干，用5% (V/V)的戊二醛浸泡2小時，然后用PB溶液清洗玻片，除去殘余的戊二醛， 95%(V/V)乙醇清洗，吹干備用。將適量的lmg/ml濃度的親合素涂于上述戊二 醛處理的玻片，置潮濕的培養皿中，4°C過夜處理。最后雙蒸水沖洗，吹干，備 用。這時候獲得的玻片上修飾了一層親合素(c)。
瓊脂糖顆粒鋪片與PCR產物固定
瓊脂糖顆粒鋪片與PCR產物固定將瓊脂糖顆粒內加入水，其中瓊脂糖質 量與水體積之比為25: 3,然后均勻分散于親合素處理的玻片上，65-80。C條件下 將瓊脂糖凝膠顆粒溶解成顆粒溶解成溶液液滴(d),然后在37°C條件下PCR產 物固定2小時，然后用65-80°C雙蒸水將瓊脂糖洗掉。玻片上固定了許多個PCR 產物點。
變性電泳法去除互補自由鏈將固定有PCR產物的玻片取出后，置于變性 電泳液(42% (W/V)的尿素溶液，其中溶劑為0.5xTBE)中電泳15分鐘，取出 后使用洗液(Tris'HCL 10 mM, pH7.5; KC1 50 mM, EDTA 2 mM, 0.01% Triton X-100 ( W/V ))沖洗2次，然后用去離子水沖洗2~4次，氮氣吹干后， 4。C保存待用。此時的玻片上固定了許多單鏈的PCR產物簇(e)。實施例3采用乳液滾環擴增與丙烯酰胺顆粒固定制備核酸分子克隆陣列 具體的實施方案如下
單鏈環形基因組擴增模板的制備
基因組DNA的超聲波處理選取功率為1200W超聲波儀，將基因組DNA 隨機打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機片斷純化處理， 去除一些小的和破碎的片斷，然后分別采用T4多聚核芬酸激酶、T4 DNA聚合 酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個 TA粘性末端，然后與 一 個通用連接子(linkerl: 5'-磷酸-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTT-3' , linker2: 5，-ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGT-3') 連 接，形成一個雙鏈的環，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成單鏈環。
單鏈環形基因組擴增模板在加有丙烯酰胺的乳液滾環反應液中擴增與丙烯酰 胺顆粒的純化
加有丙烯酰胺的乳液滾環擴增反應在滾環反應體系25 )iil中，其中5，-生物 素 -(T)1()ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA-3' ， 和 5'-
ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA-3'作為引物，每條引物的終濃度為0.8pM, 有效模板量約為107 - 108個單鏈環，Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/^L反應 液)，lxBst DNA大片l更聚合酶緩沖液、dNTP(80(VM)，并加入丙烯酰胺形成 5% ( W/V)的丙烯酰胺溶液。同時制備一定量的油相物質，其中按照體積比含 有礦物油95%, Triton-X-100 0.1%, Tween 80 0.4%, SP 80 4.5%,然后液體溶 液與油相按照1: 2混合，混合后將溶液在65。C條件下振蕩與超聲波乳化，乳化 后的乳濁液(a)中的液滴大小平均約為5微米左右。將上述乳濁液分成兩管， 每管內含乳濁液37.5微升，5(TC條件下滾環20-24小時。
丙烯酰胺顆粒的純化將上述滾環擴增反應乳濁液置于4。C半小時，然后取 出后在乳濁液(a)中加入2.5倍體積的乙醚，然后5000轉離心10分鐘，棄去上面 的溶液，回收到的就是丙烯酰胺顆粒(b),大部分丙烯酰胺顆粒中都含有一個 模板分子的滾環擴增克隆產物。
基片的表面親合素修飾基片清洗選擇大小合適的低熒光背景的全反射玻片作為固相載體(C)， 用洗衣粉清洗玻片的表面，然后用去離子水沖洗表面。將沖洗過的玻片置于盛有 去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌后的玻片放置在含有10% NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最后用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘 千備用；
玻片的醛基化處理將上述洗滌干凈的載玻片用95%(V/V)乙醇與硅烷按 49: 1 (V/V)配成的硅烷化試劑浸泡玻片30分鐘，再用95% (V/V)乙醇清 洗，雙蒸水洗凈，然后氮氣吹干玻片，然后置于110 。C烘干30分鐘。將已氨基 化處理的玻片用95% (V/V)乙醇浸泡搖洗5分鐘后，雙蒸水沖洗，吹干，用5% (V/V)的戊二醛水溶液浸泡2小時，然后用PB溶液清洗玻片，除去殘余的戊 二醛，95%(V/V)乙醇清洗，吹千備用。將適量的lmg/ml濃度的親合素涂于上 述戊二醛處理的玻片，置潮濕的培養亞中，4°C過夜處理。最后雙蒸水沖洗，吹 千，備用。這時候獲得的玻片上修飾了 一層親合素(c)。
丙烯酰胺顆粒鋪片與滾環擴增產物固定
丙烯酰胺顆粒鋪片與滾環產物固定將丙烯酰胺顆粒內加入稍量的水，然后 均勻分散于親合素處理的玻片上，加電場的條件下將丙烯酰胺凝膠顆粒中的DNA 分子聚集到玻片表面(d),然后在37°C條件下PCR產物固定2小時，然后用 65-80°C雙蒸水將丙烯酰胺去除。玻片上固定了許多個滾環產物點。
變性電泳法去除互補自由鏈將固定有滾環產物的玻片取出后，置于變性電 泳液(42% (W/V)的尿素溶液，其中溶劑為0.5xTBE)中電泳15分鐘，取出后 使用洗液(Tris'HCl 10 mM, pH7.5; KC1 50 mM, EDTA 2 mM， 0.01% Triton X-100 (W/V))沖洗2次，然后用去離子水沖洗2-4次，氮氣吹干后，4°C保存待 用。此時的玻片上固定了許多單鏈的滾環擴增產物簇(e)。
實施例4采用乳液滾環擴增與低溫水顆粒固定制備核酸分子克隆陣列 具體的實施方案如下
單鏈環形基因組擴增模板的制備
基因組DNA的超聲波處理選取功率為1200W超聲波儀，將基因組DNA 隨機打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機片斷純化處理， 去除一些小的和破碎的片斷，然后分別采用T4多聚核苦酸激酶、T4 DNA聚合 酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然后與 一 個通用連接子(linkerl: 5'-磷酸-linker2: 5'隱
接，形成一個雙鏈的環，在外切酶i和外切酶m的作用下，形成單鏈環。
單鏈環形基因組擴增模板的乳液滾環擴增與低溫冰顆粒的純化 乳液滾環擴增反應在滾環反應體系25 pl中，其中5，-生物素-(丁)10 ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA-3',和5'-ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA隱 3'作為引物，每條引物的終濃度為0.8nM，有效環形DNA模板量約為107-108 個單鏈環，BstDNA大片段聚合酶(0.2單位/(aL反應液)，lx Bst DNA大片段 聚合酶緩沖液、dNTP(800^M),同時制備一定量的油相物質，其中按體積比礦物 油95%, Triton-X-lOO 0.1%, Tween 80 0.4%, SP 80 4.5%,然后液體溶液與油相 按照1: 2混合，混合后將溶液在65。C條件下振蕩與超聲波乳化，乳化后的乳濁 液(a)中的液滴大小平均約為5微米左右。將上述乳濁液分成兩管，每管內含 乳濁液37.5微升，50°C條件下滾環20-24小時。
低溫冰顆粒的純化將上述乳濁液置于-20 。C條件下1小時，然后取迅速地 在乳濁液(a)中加入2.5倍體積的-20 。C預冷的乙醚，然后低溫12000轉離心2分 鐘，棄去上面的溶液，回收到的就是反應液冰顆粒(b ),大部分水顆粒中每個 冰顆粒中都含有一個模板分子的滾環擴增克隆產物。
基片的表面親合素修飾
基片清洗選擇大小合適的低熒光背景的全反射玻片作為固相載體(c)， 用洗衣粉清洗玻片的表面，然后用去離子水沖洗表面。將沖洗過的玻片置于盛有 去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌后的玻片放置在含有10% NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最后用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘 干備用；
玻片的醛基化處理將上述洗滌千凈的栽玻片用95%(V/V)乙醇與硅烷按 49: 1 (V/V)配成的硅烷化試劑浸泡玻片30分鐘，再用95% (V/V)乙醇清 洗，雙蒸水洗凈，然后氮氣吹干玻片，然后置于110 。C烘干30分鐘。將已氨基 化處理的玻片用95%乙醇浸泡搖洗5分鐘后，雙蒸水沖洗，吹干，用5。/。(V/V) 的戊二醛水溶液浸泡2小時，然后用PB溶液清洗玻片，除去殘余的戊二醛， 95%(V/V)乙醇清洗，吹干備用。將適量的lmg/ml濃度的親合素涂于上述戊二趁處理的玻片，置潮濕的培養皿中，4°C過夜處理。最后雙蒸水沖洗，吹干，備 用。這時候獲得的玻片上修飾了一層親合素(C)。
低溫顆粒鋪片與滾環擴增產物固定
低溫冰顆粒鋪片與滾環產物固定將冰顆粒迅速均勻分散于親合素處理的玻 片上，37°C條件下冰顆粒溶解成反應溶液液滴(d),然后在37°C條件下PCR 產物固定2小時，然后用雙蒸水將反應液洗掉。這時玻片上固定了許多個滾環產 物點。
變性電泳法去除互補自由鏈將固定有滾環產物的玻片取出后，置于變性電 泳液(42% (W/V)的尿素溶液，其中溶劑為0.5xTBE)中電泳15分鐘，取出后 使用洗液(Tris'HCl 10 mM， pH7.5; KC1 50 mM, EDTA 2 mM， 0.01% Triton X-100(W/V))沖洗2次，然后用去離子水沖洗2-4次，氮氣吹干后，4。C保存 待用。此時的玻片上固定了許多單鏈的滾環擴增產物簇(e)。
權利要求
1. 一種高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，其特征在于制備步驟為a. 將待克隆核酸分子模板與核酸擴增反應體系試劑混合得擴增混合物溶液，使得每微升擴增混合物溶液中含有的核酸模板分子數量為106～107，所述核酸擴增反應體系試劑中的引物5’端修飾有生物素、醛基、丙烯酰胺基或氨基化學基團；
2. 根據權利要求1所述的高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，其 特征在于所述被克隆模板是單雙鏈線形或單雙鏈環形的DNA、 RNA、 PNA或LNA。
3. 根據權利要求1所述的高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，其 特征在于所述核酸擴增反應是乳液PCR擴增、乳液RT-PCR擴增或乳液 滾環擴增。
4. 根據權利要求1所述的高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，其 特征在于所述核酸擴增反應溶液中加入的高分子化合物是淀粉、瓊脂糖或 丙歸酰胺。
5. 根據權利要求1所述的高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，其 特征在于所述固相載體是表面修飾了一層親合素、氨基、丙烯酰胺硅烷或 醛基化學基團的玻片或硅片。
6. 根據權利要求1所述的高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，其 特征在于所述乳化方法為震蕩器震蕩法、超聲乳化法或高速攪拌法。
全文摘要
一種高通量核酸分子克隆制備分子克隆芯片的方法，制備步驟為a.將待克隆核酸分子模板與核酸擴增反應體系試劑混合得擴增混合物溶液；b.向上述擴增混合物溶液中加入高分子化合物；c.溶液中加入兩倍其體積的油相進行乳化，得到油包水的乳濁液；d.乳濁液置于PCR儀或恒溫器中，進行核酸擴增反應；e.核酸擴增反應結束后，降低乳濁液溫度，形成核酸分子克隆顆粒；f.分離出核酸分子克隆顆粒；g.核酸分子克隆顆粒隨機分散在固相載體上，使溶液中的核酸擴增產物固定在固相載體上，在固相載體表面上形成核酸分子克隆陣列，由此得到克隆芯片。本發明改進了制備測序模板的，既能保證測序的高通量，又能降低測序的成本。
文檔編號C12N15/10GK101413034SQ20081023558
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月21日 優先權日2008年11月21日
發明者周東蕊, 陸祖宏 申請人:東南大學