專利名稱：產紅霉素多孢放線菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種其發酵液中能夠分離得到新的化合
物的微生物菌株。
背景技術：
紅霉素的類衍生物有很多種，以紅霉素C進行分析，在其14元大環結構中14位上 沒有羥基，6和18位間沒有形成三元環。紅霉素類藥物的合成與開發主要集中于對14元環 上的3、5、6、11和12位等活潑羥基的取代上以及取代基的再取代反應，并獲得了很好的紅 霉素臨床藥物。但隨著臨床耐藥菌的不斷出現及這些菌的耐藥性的增強，臨床使用的紅霉 素藥物療效正逐步降低，需要進一步開發新的抗生素藥物。因此，新的結構及在此基礎上進 行的衍生化反應所得到的系列化合物將為新一代紅霉素藥物開發提供很好的基礎。這正是 該技術領域亟待解決的問題。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從新疆艾丁湖鹽湖土樣中分離得到的、其發酵液中能 夠分離得到新的化合物的微生物菌株——產紅霉素多孢放線菌。 本發明所述的產紅霉素多孢放線菌命名為產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 906001，現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC M 208243。 本發明所述的產紅霉素多孢放線菌系從中國新疆艾丁湖鹽湖土樣中分離獲得的。 現保藏在國家知識產權局專利局保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心， 保藏單位地址中國，武漢大學，郵政編碼430072。保藏日期為2007年10月9日，保藏編 號為CCTCC M 208243。 本發明所述的產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YM 90600Tj
類地位為細菌域、放線菌門、放線菌綱、多孢放線菌屬Actinopolyspora。 本發明所述的產紅霉素多孢放線菌是從新疆艾丁湖鹽湖土樣中，用纖維素酪素復
合鹽培養基Cellulose-casein multi-salts (復合鹽包括NaCl， KC1 and MgCl2)medium.，采用平板稀釋涂布法，分離到一株嗜鹽放線菌YM 90600T。 分離步驟為取鹽湖土樣2g、放入20ml已滅菌的含10 % NaCl溶液，37 °C振蕩
(lOOr. p. m) 30分鐘，取0. 2ml 10—2溶液、涂布于纖維素酪素復合鹽平板培養基，37。C培養3
周，挑單菌落于ISP 4培養基培養、純化2次，確認為純菌株后，用于科研和保藏。菌種采用
凍干物安瓿管保藏、甘油管保藏和液氮保藏等保藏方式。
培養條件 培養基ISP 4培養基
(1%可溶性淀粉，0. 4% (NH4)2S04，0. 2% K2HP04，0. 2% MgS04 7H20，0. 4% CaC03，
10 % NaCl ， 1 % MgCl2 6H20， 1 % KC1 ， 2 % Agar)。 NaCl生長耐受范圍2-25X，最適生長NaCl 5_10%。 最適生長pH :7-7. 5。 最適生長溫度37t:。 好氧。 繁殖 用接種針取少量菌絲于ISP 4瓊脂培養基，37t:培養7天后，基內菌絲開始生長、
為白色，氣生菌絲還未發育；培養12天后，氣生菌絲發育生長、為白色；培養20天到其生長
的對數期，基內菌絲白色、氣生菌絲為白色到黃白色，無可溶性色素產生。 本發明所述的產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T菌
種描述 好氧、革蘭氏陽性、中度嗜鹽放線菌。基內菌絲和氣生菌絲生長良好，基內菌絲會 發生斷裂、氣生菌絲成熟形成長孢子鏈、孢子橢圓形。最適生長在無機鹽淀粉瓊脂培養基， 中度生長在察氏瓊脂培養基、燕麥瓊脂培養基和馬鈴薯浸汁瓊脂培養基，較弱生長在酵母 膏/麥芽膏瓊脂培養基、甘油/天門冬酰胺瓊脂培養基和營養瓊脂培養基。基內菌絲顏色 為白色，氣生菌絲顏色為白色到黃白色，沒有可溶性色素產生。明膠液化陽性，降解淀粉、纖 維素和脲陰性。NaCl生長耐受范圍2-25% (w/v)，最適生長NaCl濃度、pH和溫度分別為 5-10^、7-7.5和37。C。全細胞水解產物含meso-二氨基庚二酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯 糖和核糖。優勢甲基奈醌為MK-9(H4)。主要脂肪酸含iso-C化。，iso-C則和anteiso-C^。。 DNA基因的G+C含量是67mol%。 本發明所述菌株的發酵液中能夠分離得到新的紅霉素類似物，具有抗菌、腫瘤細 胞活性(MTT法)。
具體實施方式
實施例 用本發明所述的產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T 制備新化合物6， 18-環氧-14羥基紅霉素內酯B。 —、產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T菌株的發酵處 理 a、斜面培養ISP 4+10% NaCl，37。C下培養15天至氣生孢子長出； b、種子培養ISP 4(無瓊脂)+10% NaCl，37t:下，250轉/分，培養IO天； c、發酵培養在發酵培養基中，37攝氏度下，250轉/分，培養30天，發酵培養基
的組成及比例大豆粉20g，蛋白胨2g，葡萄糖20g，淀粉5g，酵母膏2g， NaCl 74g， K2HP04
0. 5g， MgS04 7H20 0. 5g， Na2S04 10H20 25g， KC115g， MgCl2 6H20 10g， CaS04 2H20 5g，
CaC03 2g，去離子水1000ml ， pH 7. 8 ; 操作過程取一接種環長好的菌株孢子，接入溫熱滅菌過的種子培養基中 (50ml/250ml三角燒瓶)，置于搖床上37。C下，250轉/分，培養10天，制備種子培養液；再 將種子培養液以10%的接種量接種于發酵培養基中(500ml/2000ml三角燒瓶)，發酵搖瓶于37。C下，250轉/分，培養30天；
二、制備提取物及化合物分離 發酵終止后，fC下4000轉/分離心將菌絲體與發酵液分開，向發酵液中加入甲乙 酮萃取三次，每次用量為1/3體積，減壓除去甲乙酮，得發酵粗提取物，菌絲體用丙酮浸泡3 次，每次用量約2000ml ;減壓除去丙酮，將丙酮浸出物與甲乙酮提取物合并，得菌株粗提取 物；粗提取物經硅膠柱層析、S印hadex LH-20柱層析、ODS柱層析及HPLC制備得6， 18_環氧 紅霉素內酯B。 6，18-環氧紅霉素內酯8外觀呈白色粉末，分子式為(:21113608，結構式如下
<formula>formula see original document page 5</formula> 上述化合物為紅霉素母核的一個新的衍生物，具有兩個不同于已知紅霉素結構的 特點，一是獨特的含氧三元環狀穩定結構，二是14位上的羥基取代。這兩個特點在研究開 發新一代的紅霉素藥物中有很重要的意義，14位上活潑的羥基為發生新的取代反應提供了 更多的反應位點，在此基礎上可以在3位、5位和14位的羥基可以進行各種取代反應，產生 出不同于已知和臨床上使用的新的紅霉素藥物。本化合物具有抗腫瘤、抗菌的作用，臨床可 用于敏感菌所致的各種感染。上述化合物可用于合成新一代紅霉素類藥物的前體物質，為 合成新的紅霉素提供了一種新的骨架。 以上述化合物5個濃度對H1299、 A549、 MCF10A、 DU145、 SK0V-3、 NCI-H460、 HT29、 HCT-15、MCF7等多種腫瘤細胞株進行了抗腫活性的篩選，表明該物質在0. lmg/mL對腫瘤細 胞株具有一定的抑制活性。同時，抑菌實驗證實，在目標菌株中，對枯草芽孢桿菌(細菌，抑 菌圈直徑3mm)、肺炎鏈球菌(細菌，抑菌圈直徑5mm)、棒束孢菌(真菌，抑菌圈直徑lmm)等 具有抑制作用，但對真菌的抑制作用較弱。 本發明所述的產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 906001的 16S rRNA部分基因由679個堿基組成，其序列如下 1 ggcgcgcttc acacatgcaa gtcgagcgat ggcgccggtt ttcggatcgg tgtgcagagc
61 ggcggacggg tgagtaacac gtgagtaacc tgccctgggc gtggggataa ccctgggaaa121ctggggcteataccggatggccctgcctattcgcatggatgggtgggg朋aggttcatct181tcgtaagggggtgttccggcttggg鄉ggctcgcggcccatcagcttgttggtgcggtg241agggcgtacc朋ggcgatg3cgggtagccggcctg卿gggtgatcggcc3C3Ctggg3C301tgagacacggcccagactcctacgggaggc3gC3gtggggaattttgcgcElEltgggCggEl361agcctgacgcagcgacgccgtgtggggg3ggacggccttcgggttgte朋cctctttcgg421ccctgacgaatgtgacggtaggggcte朋gaagcgccggctaactacgtgccagcagccg481cggt朋tecgtagggcgcgagcgttgtccggatttactgggcgte朋gggctcgtaggcg541gtttgtcgcgtcggtcgtgga朋tgtctggcttaactgggcacgtgcggctgatacgggc601agactcgagggcggteggggc朋gcgg朋ttcctggtgtagCggtg朋Eltgcgcagatet
661 caggaggaac accgatggcc
權利要求
一種產紅霉素多孢放線菌，其特征在于命名為產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T，現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC M 208243。
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種其發酵液中能夠分離得到新的化合物的微生物菌株。本發明所述的產紅霉素多孢放線菌命名為產紅霉素多孢放線菌Actinopolyspora erythraea YIM 90600T，現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC M208243。本發明所述的產紅霉素多孢放線菌系從中國新疆艾丁湖鹽湖土樣中分離獲得的。現保藏在國家知識產權局專利局保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址中國，武漢大學，郵政編碼430072。保藏日期為2007年10月9日。本發明所述菌株的發酵液中能夠分離得到新的紅霉素類似物，具有抗菌、腫瘤細胞活性(MTT法)。
文檔編號C12R1/01GK101748081SQ200810233710
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月15日 優先權日2008年12月15日
發明者唐蜀昆, 姜成林, 徐麗華, 李文均, 趙立興 申請人:云南大學