專利名稱：利用gfp蛋白創造家蠶新型綠繭實用品種的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術、生物工程領域，特別是涉及利用GFP倉ij造家蠶f 型鄉錄繭實 用品種的一種方法。
背景技術：
天然彩色繭不但色澤鮮艷，而且對皮膚有抗菌保健作用，是人類新型的一種抗菌纖維， 是一種原生態的絲織品，市場前景看好。天然彩色繭絲處理得當便不需要化學染色，可以 避免對環境的污染，是一種綠色環保原料。目前天然彩色繭蠶品種主要包括黃紅繭系和綠
繭系兩大類1、黃紅繭系黃紅繭品種的蠶在生長發育過程中受黃色繭基因的調控，食
下桑葉中類胡羅卜素(e —胡羅卜素、新生e _胡羅卜素)和葉黃素色素(葉黃素、蒲公
英黃素、紫黃素、次黃嘌呤黃素)等色素吸收后轉導入絲膠中，吐出的有色絲形成金黃、 淺黃、淡紅等不同顏色的黃紅繭；2、綠繭系綠繭品種的蠶在生長發育過程中受綠色繭 基因的調控，將食下桑葉中的黃酮類色素吸收轉入到絲膠和絲素中，吐出的絲呈現淡綠色 而形成綠色繭。不管是黃紅繭系還是綠繭系，其繭色的形成都由一個或多個復雜的基因控 制，涉及到一個紛繁復雜的通路并受到多種因素的影響。色素物質要從桑葉到達絲腺內與 絲物質結合，必須要經過家蠶的消化道、透過消化管壁、經過血液、透過絲腺壁而最終與 絲素或絲膠結合。在這個過程中，消化道中消化液的作用、中腸壁的透過能力與透過部位、 血液的氧化能力、色素物質的移動速度、絲腺壁的透過性、絲腺的吸收部位以及色素物質 與絲蛋白的結合能力等均會直接影響到繭色的形成。此外，避開家蠶繭色形成的復雜性不 談，即使桑葉中的色素全部都能夠順利地"過五關斬六將"，進入絲腺并最終形成有色蠶 繭，對于家蠶繭色來說，仍然存在著一個關鍵而難以克服的難題，即除了綠色繭的部分色 素存在于絲素中以外，天然彩色繭中的色素幾乎都存在于絲膠之中，而絲膠在蠶絲中只起 到保護和粘著的作用，在繅絲過程中隨著脫膠作用而部分流失，其內的色素對絲織品的顏 色非但沒有貢獻，反而成了一種污染，這也是人們在長期以來的品種選育中利用白繭而淘
汰有色繭的最主要原因。目前綠繭品系由于其色素物質大部分仍存在于絲膠中，故其在實 際運用中也存在以上同樣的問題，且由于在繅絲過程中大部分色素的流失使獲得的生絲顏色極淺而無法形成像天蠶絲那樣美麗的淡綠色生絲。
到目前為止，改變和創造有色蠶繭的思路包括以下幾種①通過分子遺傳工程改造繭 色基因；②添食色素；③利用己有的彩色繭品種育成新的彩繭品種；④突變篩選。這些方 法都能在一定程度上改變或創造家蠶有色繭，但其產生的彩色繭都無法擺脫顏色種類受 限、色素結合不穩定等天然彩繭所具有的缺陷。
家蠶基因組框架圖和精細圖的先后公布，為家蠶基因和分子水平的研究提供了一個更 為廣闊的平臺，也為現代蠶業的發展注入了新的生機和活力。尤其是家蠶轉基因等技術的 日趨成熟，使得利用現代生物技術創造新型生物素材成為家蠶后基因組時代和現代農業技 術體系中的重要課題。但是生物技術所研究的對象和靶標是基因和蛋白質，對于一般的非 蛋白且沒有固定結合蛋白的色素物質卻是束手無策。自然界中的天然色素，尤其是生物體 中的色素，絕大多數是烯類等非蛋白的物質，它們分散或集中的固定于某一組織或器官上， 在相應輔基存在的條件下使生物體著色。但是，也有少部分色素物質例外，例如綠色熒光 蛋白(GFP)家族的成員，它們在本質上是純的蛋白質，由單個基因表達，而且不需要任 何的輔基，僅僅依靠分子內源性的發色基團而呈現出不同的顏色。這類蛋白存在于珊瑚礁 相關的海洋生物之中，鮮艷的色彩是珊瑚礁等相關的海洋生物包括從海綿到魚類等的最引 人注目的特性，而這些鮮艷的色彩均是取決于一種或幾種色素蛋白在其體內的表達情況。
基于以上考慮，本發明申請人試圖利用家蠶滯育品種轉基因的方法，將來自海洋生物 的GFP基因轉入家蠶中，令其在絲腺中特異的與絲素蛋白融合表達，則可以巧妙地避開一 般色素物質進入絲蛋白的復雜通路而難以人為操控的難題來快速創造新型綠繭實用品種。 另外，本研究發明中的外源GFP蛋白是在絲素中融合表達，會穩定均勻地存在于絲素分子 中，GFP蛋白在繅絲過程中并不會因為脫膠而流失，從而保證繅出的生絲保留著深的迷人
的綠色。最后，本發明中直接利用目前我國大規模推廣的實用品種的母種或原種為材料進 行轉基因，獲得轉基因蠶能夠快速育成新型綠繭實用品種，可非常有效地加快轉基因蠶到 真正實用化品種的進程。迄今為止，還未見相關的研究報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用GFP蛋白快速創造家蠶新型綠繭實用品種的路線方 法。該路線方法利用家蠶轉基因技術，尤其是滯育品種的轉基因技術，在家蠶絲素中融合 大量表達決定珊瑚礁等相關海洋生物體顏色的色素蛋白之一 GFP蛋白，從而快速育成新型 綠色繭家蠶實用品種。本發明首次利用GFP蛋白創造家蠶綠色繭，并通過家蠶滯育種轉基因技術短期內獲得
顏色深淺不同的新型綠繭實用品種。本發明巧妙地突破了人為控制家蠶繭色的技術瓶頸，
建立了一種可靠而高效的創造新型彩色繭特別是綠色繭的技術路線方法，為利用現代生物
技術創造新的生物素材提供了一種新的方法。
本發明利用GFP蛋白創造家蠶新型綠繭實用品種的方法，依次通過以下步驟實現
① GFP蛋白基因的獲取選取珊瑚礁等相關海洋生物體的相應組織提取基因組或合成
相關的cDNA，擴增出表達GFP蛋白的基因片段，或者直接向有關生物公司購買含有GFP蛋 白基因的載體；
② 家蠶轉基因載體的構建依據家蠶公知公用轉基因技術的要求，構建piggyBac表 達載體，以眼和神經特異的啟動子3xp3啟動的紅色熒光蛋白DsRed作為篩選標記，與家 蠶絲素重鏈啟動子啟動獲得的色素蛋白基因實現融合表達；
③ 家蠶胚胎顯微注射用家蠶白色繭母種或原種通過家蠶胚胎顯微注射，在家蠶產卵 后3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度400ng/ul的重組轉座載體質粒和輔助載體質粒， 從蠶卵腹面中央注入已經解除滯育的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔；
④ 轉基因蠶的篩選將注射完成的蠶卵在35-37y。的甲醛蒸氣中消毒5min后，置于25 'C、相對濕度85%以上的條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代GO 的蠶蛾進行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體，即獲得相應 綠色蠶繭的轉基因個體；
⑤ 綠色蠶繭轉基因品系材料的獲得將篩選到的轉基因陽性個體飼養至上簇采繭并進 一步自交選純，即獲得不同的能穩定遺傳的綠色蠶繭轉基因品系材料；
(D家蠶新型綠繭轉基因實用品種的快速育成上述步驟獲得的能穩定遺傳的綠色蠶繭 轉基因品系材料相互雜交后，再自交選純即獲得顏色深淺不同的日系或華系綠繭實用品種 原種或母種。
相應的日系或華系綠繭實用品種原種雜交便為生產上大規模推廣應用綠繭雜交種。 上述步驟中，h表示小時，min表示分鐘。用家蠶絲素重鏈啟動子啟動外源蛋白基因 融合表達的方法，本發明專利申請人已于2006年7月14日申請專利(申請號 200610054442.x)，現已公開。兩種家蠶滯育品種轉基因的方法，本發明專利申請人已于 2007年12月21日申請專利(申請號分別為200710303903. 7和200710303904.1)，現已 公開。本發明的優點是
本發明首次實現了利用色素蛋白之一 GFP蛋白創造綠色蠶繭，將素材創新的設想與家 蠶轉基因技術和用家蠶絲素重鏈啟動子在家蠶后部大量表達外源蛋白有機地結合，巧妙地 突破了人為控制家蠶繭色的技術瓶頸，并首次實現了快速培育顏色深淺不同的新型綠色繭
實用品種。本發明的優點是
① 本發明直接利用目前我國生產上大規模推廣的實用品種的母種或原種為轉基因家 蠶的材料，獲得的轉基因家蠶綠繭材料只需簡單的幾代自交選純，或者雜交再經幾代自交 選純就可以直接用于實際生產而不需要經過漫長的常規育種過程，大大加速了轉基因家蠶 實用化的進程。
② 本發明中使用的表達形式為家蠶絲素重鏈融合表達，令GFP色素蛋白與繭絲的主體 ——絲素——融合表達，在絲腺分泌絲素的時候GFP色素蛋白就能穩定均勻地分布在絲素 之中，再經過吐絲過程的壓榨結晶，使得GFP色素物質與絲素牢固的結合，即使在繅絲和 生絲精煉的過程中GFP色素蛋白也不會因為脫膠而流失。用這種蠶絲生產出的纖維織物， 勿需印染即可直接應用于織綢，將大大簡化紡服工藝，節約大量的生產成本。
③ 由于蠶絲結構致密，雖然在染色時比較容易著色，但染料與蠶絲的結合并不是很穩 定，容易造成絲織物的脫色和掉色現象。而本發明中的GFP色素蛋白乃是與絲素徹底的融 合，而且所使用的GFP色素蛋白對熱、去垢劑、還原劑、離液劑、極端PH值和蛋白酶等 都具有強的抵抗能力，能夠達到絲織物永不退色的效果。
④ 蠶絲染整工藝中所使用的試劑和染料多為酸或堿，這些化學物質不但會影響蠶絲的 品質，還會危害人類的健康。本發明所創造的新型綠色繭則可以越過染整這一個步驟，不 但保證了蠶絲的品質，而且為人類的健康提供了保障。
⑤ 本發明中使用的GFP色素蛋白吸收光譜以紫外光波等短波為主，故用這種材料做成 的織物可以吸收紫外線從而降低紫外線對人類的傷害。
◎GFP色素蛋白可高效地吸收紫外線并將其轉化為另一種長波段的光或者熱能，用這 種材料做成的織物可能具有獨特的光學特性和更廣泛的用途。
本發明有效地聯合使用了本發明人已經公開的用家蠶絲素重鏈啟動子啟動外源蛋白 基因融合表達和家蠶滯育品種轉基因的方法， 一次性解決了家蠶有色繭——特別是綠色繭 開發和實際運用中的色素結合不穩定等多個難題，可簡化絲織物的紡服工藝，消除染整工 藝對蠶絲品質和人類健康的危害，將為本來就享有"纖維皇后"的美譽的蠶絲增添新的優良特質。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步描述，以下實施例不構成對本發明 的任何限定。 實施例1:
第一步利用實用家蠶品種"碧波"(日系白色繭原種)作為原始材料，將初產下的
卵解除滯育后于產下后3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10_15nl、總濃度400ng/ul 的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的綠色熒 光蛋白(GFP蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入1500粒蠶卵中，用 無毒膠水封住注射口，經35y。的甲醛蒸氣中消毒5rain以后，置于25'C、相對濕度85%以上 的高濕度環境中催青孵化，將孵化的73頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的 40頭GO代蠶蛾，通過自交或回交共獲得27蛾圈Gl代蠶卵，用01ympus⑧電動宏觀熒光顯 微鏡觀察篩選27蛾圈G1代蠶卵并獲得3個陽性蛾圈，共18頭轉基因蠶。將獲得的18頭 轉基因蠶飼養至上簇采繭，共獲得18個呈現出不同程度的淡綠色的蠶繭，通過自交選純 后再通過雜交，并自交選純而篩選各種經濟性狀良好的顏色深淺不同的3個日系"碧波" 綠色繭原種。
第二步利用實用家蠶品種"洞庭"(華系白色繭原種)作為原始材料，將初產下的 卵解除滯育后于產下后3-6h，用E卯endorf顯微注射儀，將10_15nl、總濃度400ng/ul 的帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的綠色熒 光蛋白(GFP蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入1100粒蠶卵中，用 無毒膠水封住注射口，經35y。的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度85%以上 的高濕度環境中催青孵化，將孵化的220頭GO代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得 的180頭G0代蠶蛾，通過自交或回交共獲得97蛾圈G1代蠶卵，用Olympus戀電動宏觀熒 光顯微鏡觀察篩選97蛾圈G1代蠶卵并獲得20個陽性蛾圈，共198頭轉基因蠶。將獲得 的198頭轉基因蠶飼養至上簇采繭，共獲得162個呈現出不同程度的綠色的蠶繭，通過自 交選純后再通過雜交，并自交選純而篩選各種經濟性狀良好的顏色深淺不同的3個華系"洞 庭"綠色繭原種。
第三步將第一步和第二步獲得的3個華系"洞庭"綠色繭原種和3個日系"碧波" 綠色繭原種分別雜交，獲得顏色深淺不同的新型家蠶綠繭實用品種的生產用雜交種。 實施例2:
8第一步利用實用家蠶品種"872"(日系白色繭原種)作為原始材料，將初產下的卵 解除滯育后于產下后3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10_15nl、總濃度400ng/ul的 帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的綠色熒光 蛋白(GFP蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入2500粒蠶卵中，用無 毒膠水封住注射口，經35。/。的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25'C、相對濕度85%以上的 高濕度環境中催青孵化，將孵化的163頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的 121頭G0代蠶蛾，通過自交或回交共獲得63蛾圈G1代蠶卵，用01ympu^電動宏觀熒光 顯微鏡觀察篩選63蛾圈Gl代蠶卵并獲得14個陽性蛾圈，共91頭轉基因蠶。將獲得的91 頭轉基因蠶詞養至上簇采繭，共獲得72個呈現出不同程度的綠色的蠶繭，通過自交選純 后再通過雜交，并自交選純而篩選各種經濟性狀良好的顏色深淺不同的3個日系"872" 綠色繭原種。
第二步利用實用家蠶品種"871"(華系白色繭原種)作為原始材料，將初產下的卵 解除滯育后于產下后3-6h，用Eppendorf顯微注射儀，將10_15nl、總濃度400ng/ul的 帶有神經和眼睛特異啟動子啟動的紅色熒光蛋白標記和絲素重鏈啟動子啟動的綠色熒光 蛋白(GFP蛋白)的重組piggyBac載體和輔助載體，共同注射進入2200粒蠶卵中，用無 毒膠水封住注射口，經35Q/。的甲醛蒸氣中消毒5min以后，置于25。C、相對濕度85%以上的 高濕度環境中催青孵化，將孵化的320頭G0代蟻蠶用人工飼料收集飼養至化蛾，獲得的 218頭GO代蠶蛾，通過自交或回交共獲得115蛾圈Gl代蠶卵，用01711^1^ 電動宏觀熒光 顯微鏡觀察篩選115蛾圈Gl代蠶卵并獲得9個陽性蛾圈，共86頭轉基因蠶。將獲得的86 頭轉基因蠶飼養至上簇采繭，共獲得134個呈現出不同程度的綠色的蠶繭，通過自交選純 后再通過雜交，并自交選純而篩選各種經濟性狀良好的顏色深淺不同的3個華系"871" 綠色繭原種。
第三步將第一步和第二步獲得的3個華系"871"綠色繭原種和3個日系"872"綠 色繭原種分別雜交，獲得顏色深淺不同的新型家蠶綠繭實用品種的生產用雜交種。
權利要求
1、利用GFP蛋白創造家蠶新型綠繭實用品種的方法，其特征是將GFP家族色素蛋白基因整合到家蠶染色體上而獲得相應轉基因家蠶，獲得的這些轉基因家蠶在其后部絲腺大量融合表達GFP家族色素蛋白，并吐絲形成相應的有色繭。
2、 權利要求1所述的利用GFP蛋白創造家蠶新型綠繭實用品種的方法，其特征是依 次通過以下步驟實現① GFP蛋白基因的獲取選取珊瑚礁等相關海洋生物體的相應組織提取基因組或合成 相關的cDNA，擴增出表達GFP蛋白的基因片段，或者直接向有關生物公司購買含有GFP蛋 白基因的載體；② 家蠶轉基因載體的構建依據家蠶公知公用轉基因技術的要求，構建piggyBac表 達載體，以眼和神經特異的啟動子3xp3啟動的紅色熒光蛋白DsRed作為篩選標記，與家 蠶絲素重鏈啟動子啟動獲得的色素蛋白基因實現融合表達；③ 家蠶胚胎顯微注射用家蠶白色繭母種或原種通過家蠶胚胎顯微注射，在家蠶產卵 后3h-6h用顯微注射儀將10-15nl、總濃度400ng/ul的重組轉座載體質粒和輔助載體質粒， 從蠶卵腹面中央注入已經解除滯育的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔；④ 轉基因蠶的篩選將注射完成的蠶卵在35-37y。的甲醛蒸氣中消毒5min后，置于25 °C、相對濕度85%以上的條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代GO 的蠶蛾進行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體，即獲得相應 綠色蠶繭的轉基因個體；⑤ 綠色蠶繭轉基因品系材料的獲得將篩選到的轉基因陽性個體飼養至上簇采繭并進 一步自交選純，即獲得不同的能穩定遺傳的綠色蠶繭轉基因品系材料；(D家蠶新型綠繭轉基因實用品種的快速育成上述步驟獲得的能穩定遺傳的綠色蠶繭 轉基因品系材料相互雜交后，再自交選純即獲得顏色深淺不同的日系或華系綠繭實用品種 原種或母種。
3、 權利要求1或2所述的方法，其特征是禾U用來自鱗翅目的轉座子piggyBac和家 蠶胚胎顯微注射的方法將GFP家族色素蛋白和絲心蛋白重鏈基因融合基因整合到家蠶染 色體中。
4、 權利要求1或2所述的方法，其特征是利用家蠶滯育品種作為轉基因胚胎顯微注射的原始材料而獲得滯育品種轉基因后代。
5、權利要求4所述的方法，其特征是利用目前推廣的實用品種原種對或母種對作 為轉基因胚胎顯微注射的原始材料而獲得相應品種轉基因后代，并通過簡單的自交或者雜 交再自交選純的方法，獲得相應的轉基因后代的原種對或母種對。
全文摘要
利用GFP蛋白創造家蠶新型綠繭實用品種的方法，利用家蠶轉基因技術，尤其是滯育品種的轉基因技術，在家蠶絲素中融合大量表達決定珊瑚礁等相關海洋生物體顏色的色素蛋白之一GFP蛋白，從而快速育成新型綠色繭家蠶實用品種。該方法不僅大大加速了轉基因家蠶實用化的進程，而且用這種蠶絲生產出的纖維織物，勿需印染即可直接應用于織綢，將大大簡化紡服工藝，節約生產成本并有利于環保。
文檔編號C12N15/63GK101423841SQ20081023323
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月5日 優先權日2008年12月5日
發明者向仲懷, 周澤揚, 夏慶友, 徐漢福, 趙愛春, 成 魯 申請人:西南大學