專利名稱:小麥條銹菌與葉銹菌的復合pcr檢測鑒定試劑盒的制作方法
技術領域:
本發明屬于生物技術、農作物病害防治和植物檢疫領域,具體涉及一種小麥條銹 菌與葉銹菌的復合PCR檢測鑒定試劑盒。
背景技術:
小麥銹病屬世界性禾谷類病害,發生范圍廣,流行成災率高,危害嚴重,是影響小 麥安全生產的重要生物災害,大流行年份可導致小麥減產30%左右,特大流行年份則可減 產50% 60%,甚至絕收。作為我國第二大糧食作物,小麥生產直接關系到我國的糧食安 全問題。但在我國不同小麥種植區內,銹菌菌源大規模交流擴散、銹病流行循環往復。
小麥條銹病和葉銹病在癥狀上的共同特點是發病初期麥葉上出現褪綠斑點,繼而 在發病部位產生鐵銹色的粉皰(夏孢子堆),后期再產生黑色皰斑(冬孢子堆)。小麥銹菌 寄生專化性強,無法人工培養,且尚未發現有性世代,長期以來,病菌常規的小種鑒定及監 測均基于鑒別寄主來進行,銹病發生種類與狀況的預測預報也主要基于定期、大規模的田 間病情調查和室內病原菌的活體分離、培養和鑒定。不僅耗時費工,而且其結果的準確性和 可信度也在很大程度上取決于調查測報人員的經驗技術,難以滿足快速、高通量診斷檢測 的實際需求。通常,小麥銹菌成功侵染寄主小麥后, 一般具有9-14天甚至更長時間的潛育 擴展階段。在此期間,寄主小麥的發病癥狀不易觀察,因此初侵染的時期和規模難以界定; 在苗期小麥上,條銹病和葉銹病的典型癥狀不明顯,一些基層植保人員常常將二者混淆,不 能準確區分,因此難以開展及時有效的化學防治工作。而銹病癥狀一旦顯現、病原菌即可在 小麥葉片上大量繁殖產生夏孢子。這些病原菌孢子可隨氣流進行大范圍的傳播擴散,導致 病害的流行爆發。 開展銹菌不同種的早期診斷與監測,可以解決常規病原菌檢測鑒定方法繁雜、費 工費時的實踐難題。同時,在病害侵染循環的早期階段,界定發病的初始時期與規模,有助 于提高病害中長期測報水平,正確評判病害的流行趨勢;也有助于制定合理的防治閾值,科 學決策防治時機,并確定殺菌劑的使用劑量與時期,在最大限度降低病害防治成本的基礎 上,規避病害流行風險。 在病害預測預報和病原菌鑒定檢疫方面,國際上多采用血清學檢測(如ELISA和 免疫熒光)和DNA雜交、PCR分析等技術。其中,PCR技術是利用特異引物,在DNA聚合酶的 催化下,對靶標DNA序列進行體外擴增,根據預期DNA條帶的有無來判斷檢測結果。與傳統 的病原菌檢測分析技術相比,PCR試劑盒分析技術具有靈敏度高,特異性強、使用簡單、操作 迅捷等特點。 目前國內外尚無小麥條銹菌和葉銹菌檢測區分的PCR專用試劑盒。
發明內容
本發明目的是提供用于檢測區分小麥銹菌不同種的PCR試劑盒。該試劑盒利用源 自真菌P-微管蛋白基因保守序列和小麥條銹菌、葉銹菌特異序列的三條引物,在同一PCR反應體系中同時檢測小麥條銹菌和葉銹菌。
本發明的技術方案如下 本發明為小麥條銹菌與葉銹菌的復合PCR檢測鑒定試劑盒,該試劑盒由以下幾種 試劑組成 (1) PCR-SMART反應液 其中含有10XPCR Buffer, dNTP Mixture以及小麥銹菌不同種的PCR檢測專用引 物Primer A、 Primer B禾口 Primer C。 Primer A序歹lj (5' -ACCCACAACCGCCAACATGCGTGA-3')源自小麥稈枯菌 (S印toria nodorum)的P _微管蛋白基因的保守序列(EMBLS56922) ;PrimerB序列 (5, -CTCATCAGGTAGCCCATCGT-3')源自小麥葉銹菌的SCAR標記(GenBank accession EU084038) ;Primer C序列(5' -TTAAGACTACCGGTGTGAAC-3')源自小麥條銹菌的SCAR標記 (GenBank accession EF666109)。Primer A/B可以專化性擴增出小麥葉銹菌226bp的特異性條帶,而PrimerA/C可
以專化性擴增出小麥條銹菌171bp的特異性條帶。 (2)Taq酶; (3)條銹菌陽性對照; (4)葉銹菌陽性對照; (5)分子量標記; (6)超純水; (7)凝膠上樣緩沖液。 試劑盒具體組成可以為(100次) (1) PCR-SMART反應液1. Oml l支 內含10XPCR Buffer(tris-cl 100mmol/L, Kcl 500,1/L, Mgcl2 25mmol/ L)0.33ml, dNTP Mixture (lOmmol/L) 0. 27ml , Primer A (10 ii mol/L) 0. 20ml , Primer B(10iimol/L)0. 10ml , Primer C (10 ii mol/L) 0. 10ml 。(2) Taq酶 5U/ ii 150 ii 1l支(3)條銹菌陽性對照1mll支(4)葉銹菌陽性對照1mll支(5)分子量標記1mll支(6) ddH205mll支 (7)6X凝膠上樣緩沖液1ml 1支試劑盒的儲存及有效期儲存于_20°C ;避免反
復凍融;有效期為12個月。 適用儀器PCR檢測儀。 本發明試劑盒的使用方法如下 ①PCR反應體系的建立 取出PCR-SMART反應液,室溫融化、顛倒混勻后,向每個PCR薄壁反應管內加入 7. 5 ill ;再分別加入0. 5 ill Taq酶、16 ddH20、 1 ii 1被測樣品的DNA模板(20ng/ ii 1), 蓋好PCR薄壁反應管蓋。
②PCR擴增
將PCR薄壁反應管置于PCR儀中,設定PCR反應程序94。C預變性5min, 1個循環; 94。C變性30S, 55。C退火30S, 72。C延伸40S, 35個循環;72。C延伸5min 1個循環。
③PCR產物鑒定 取3 5 ill PCR擴增產物,用質量分數2. 0的瓊脂糖凝膠、0. 5 X T BE電泳緩沖液 電泳分離;同時上樣5iU/孔的分子量標記與條銹菌、葉銹菌的陽性對照;電泳結束、經溴 化乙錠染色后,以紫外凝膠成像系統分析判斷擴增產物的有無與大小。
有益效果本發明是用于檢測小麥銹菌不同種的復合PCR試劑盒,可用于檢測和 區分小麥條銹菌與葉銹菌的夏孢子,也可用于檢測和確定無明顯發病癥狀的小麥材料是否 被不同種的小麥銹菌所侵染。與國內外現有方法相比,本發明具有以下的技術優勢
(1)檢測準確性高。本試劑盒可專化性擴增小麥條銹菌(GenBank accessionEF666109)和葉銹菌(GenBank accession EU084038)不同SCAR標記的相應序 列。 (2)操作簡便快捷。本發明采用復合PCR技術,三條引物在同一反應體系中同時擴 增,擴增模板可以為源于銹菌孢子或感病小麥葉片的總DNA。實驗操作簡單、快速、高效,一 般整個檢測過程可在4個小時內完成。 (3)特異性強。本試劑盒可特異性檢測小麥條銹菌和葉銹菌,而在其它麥類病原真 菌中無擴增產物。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作詳細說明,但并不以任何方式限制本發明。 實施例1感病小麥葉片與銹菌夏孢子的復合PCR檢測及其特異性分析。 ①在人工氣候室內分別以小麥葉銹菌07-24-17、條銹菌S23單獨或混合接種銘
賢169小麥幼苗,7天后采集病葉提取基因組DNA;培養并采集小麥葉銹菌(07-24-17、
07-18-7、07-24-3)、條銹菌(S23、07-6-3-11)、稈銹菌的夏孢子,以及赤霉、白粉、紋枯、葉
枯、根腐、光腥、矮腥病菌的菌絲體,提取基因組DNA,并制備為20ng/iU的擴增反應模板。 ②建立PCR反應體系 取出PCR-SMART反應液,室溫融化、混合均勻,分別向每個PCR薄壁反應管內加入 7. 5 iil ;再依次加入0. 5 iil Taq酶、16 iU ddH20、 1 y 1模板DNA (20ng/ y 1),蓋好PCR薄壁
反應管蓋。 ③PCR擴增 將PCR薄壁反應管置于PCR儀中,設定PCR反應程序94。C預變性5min, 1個循環; 94。C變性30S, 55。C退火30S, 72。C延伸40S, 35個循環;72。C延伸5min 1個循環。
PCR產物的電泳分析 取5 ill PCR擴增產物,用質量分數2. 0的瓊脂糖凝膠、0. 5 X T BE電泳緩沖液電泳 分離;同時上樣5iU/孔的分子量標記;電泳結束、經溴化乙錠染色后,以紫外凝膠成像系 統照相分析。結果表明本發明試劑盒可以從小麥葉銹菌、條銹菌的夏孢子以及小麥葉銹菌、 條銹菌單獨或雙重侵染的小麥葉片中檢測到相應的DNA分子標記,而在其它小麥病原真菌 中則沒有擴增產物。 實施例2小麥銹菌復合PCR檢測靈敏度的測定
①分別梯度稀釋葉銹菌07-24-3、條銹菌S23的夏孢子DNA,至其終濃度為1. OOpg/ uL、5. 00pg/uL、50. 00pg/uL、l. 00ng/uL、20. OOng/uL禾P 50. OOng/uL ;等量混合葉銹菌 07-24-3和條銹菌S23的夏孢子DNA,并梯度稀釋至終濃度為5. 00pg/uL、50. 00pg/uL、 1. 00ng/uL、10. 00ng/uL、20. OOng/uL禾口 50. 00ng/uL。
②建立PCR反應體系 取出PCR-SMART反應液,室溫融化、混合均勻,分別向每個PCR薄壁反應管內加入 7. 5 ill ;再依次加入0. 5 ill Taq酶、16 ddH20、 1 ii 1模板DNA,蓋好PCR薄壁反應管蓋。
③PCR擴增將PCR薄壁反應管置于PCR儀中,設定PCR反應程序94。C預變性5min, 1個循環; 94。C變性30S, 55。C退火30S, 72。C延伸40S, 35個循環;72。C延伸5min 1個循環。
PCR產物的電泳分析 取5 ill PCR擴增產物,用質量分數2. 0的瓊脂糖凝膠、0. 5 X T BE電泳緩沖液電泳 分離;同時上樣5iU/孔的分子量標記;電泳結束、經溴化乙錠染色后,以紫外凝膠成像系 統照相分析。結果表明本試劑盒的檢測靈敏度可以達到50. 00pg/uL。
權利要求
一種小麥條銹菌與葉銹菌的復合PCR檢測鑒定試劑盒,其特征在于該試劑盒由以下幾種試劑組成(1)PCR-SMART反應液其中含有三條小麥銹菌不同種的PCR專用引物,其序列為引物A5’-ACCCACAACCGCCAACATGCGTGA-3’引物B5’-CTCATCAGGTAGCCCATCGT-3’引物C5’-TTAAGACTACCGGTGTGAAC-3’,(2)Tap酶;(3)條銹菌陽性對照;(4)葉銹菌陽性對照;(5)分子量標記;(6)超純水;(7)凝膠上樣緩沖液。
2. 根據權利要求1所述的小麥條銹菌與葉銹菌的復合PCR檢測鑒定試劑盒,其特征在 于試劑盒內含有lml PCR-SMART反應液,其組分為33. 33mmol/L tris-cl, 166. 67mmol/ L Kcl,8.33,l/L Mgcl2, 2. 67,1/L d證Mixture, 2. 00 ii mol/L Primer A, 1. 00 ii mol/L
全文摘要
小麥條銹菌與葉銹菌的復合PCR檢測鑒定試劑盒,屬于生物技術、農作物病害防治和植物檢疫技術領域。該試劑盒利用源自真菌β-微管蛋白基因保守序列和小麥條銹菌、葉銹菌特異序列的三條引物,在一次PCR反應中,同時檢測小麥條銹菌171bp、葉銹菌226bp的特異性基因組DNA序列。是對小麥條銹菌和葉銹菌特異性引物檢測方法的補充和改進,也適用于病害癥狀顯現之前、受侵染小麥葉片內條銹菌與葉銹菌的診斷檢測。本試劑盒采用復合PCR技術,在PCR-SMART反應液中,三條引物同時擴增,提高了檢測的準確性,節約了檢測時間,且操作簡便,可供我國植保、植檢部門推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK101748206SQ20081023111
公開日2010年6月23日 申請日期2008年11月28日 優先權日2008年11月28日
發明者劉太國, 孟顥光, 徐世昌, 曹麗華, 王振躍, 藺瑞明, 陳萬權 申請人:河南農業大學