專利名稱：一種生物類黃酮色素的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體涉及一種生物類黃酮在觀賞植
物中的表達。
背景技術：
類黃酮類色素是一類液泡包素，主要存在液泡中，類黃酮的不同色素在液泡中的積累產生了各種花色，同時色素的組成和濃度的不同也是出現各種花色的原因。其中花色素和花色素苷是重要的顏色決定物質，也是花色生理水平的重要檢測指標。而類黃酮一3' 5' —羥化酶(F3' 5' H)是合成3' —，5' —帶羥基的花色素的關鍵酶和限速酶，F3'， 5' H基因屬于細胞色素450單加氧酶(P450)超家族。細胞色素450單加氧酶(P450)是血紅素依賴的氧化酶，廣泛分布與各種生物中，具有非常復雜的功能，可以催化成千上萬的反應。在植物界分布也非常的廣泛，可以催化的反應超過50種，也涉及到類黃酮的合成。它在二氫黃酮醇的3'和5'位置選擇性的加入羥基，產生不同的花色素苷從而使得植物顯現出不同的顏色。這類色素呈現藍紫色，是藍花和紫花形成的原因。因此關于它的研究就成為花色研究領域中重要的一個組成部分。
發明內容
本發明的目的在于提出一種從觀賞植物中克隆出的生物類黃酮。 為達到上述目的，本發明采用如下技術方案，本發明的生物克隆具體操作步驟
為 1、蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海農業科學院蔬菜園藝研究所，品種為Formosa rosa，花色為紫色，白色，黃色；植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h ;25 — 28°C )。 2、RNA提取取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加lmLTriBlue試劑，用力搖15s，室溫放置5min。加0. 2mL氯仿，去蛋白，上清轉移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。用DEPC配制的75%乙醇lmL洗滌沉淀，重復一次。室溫干燥5 — 10min，溶于20 ii L DEPC水中，測0D值，電泳檢測。 3、基因的克隆通過對已發表的F3'5'H基因序列進行同源性比較，根據保守區設計兼并引物F和R，進行RT — PCR。 4、巢式PCR擴增由于基因片段過大，上述步驟無法獲得完全基因序列，以3'RACE獲得F3' 5' H基因的3'端；提取總RNA，逆轉錄為cDNA ;依次使用多輪引物包括AP， AUAP，3GSPI， 3GSP2， 3GSP3， 3GSP4進行巢式PCR擴增。 5、5'端及其上游序列以IPCR方法獲得將基因組DNA以市售的Xbal、Xho1和Sphl三種酶進行酶切；再酶切產物自連，以反式PCR擴增；進行三輪擴增反應，每一輪均使用前一輪的產物作為模版；最后得到的特異PCR特異產物連接到pGEM — T載體，克隆、測序。使用的引物包括5 — r，5 — 2，5 — 3，5 — 4，5 — 5，5 — 6，5 — 7，5 — 8，3 — lb，3 — 2，3 —
33。 本發明的有益效果 F3'，5'H基因屬于細胞色素450單加氧酶(P450)超家族。細胞色素450單加氧酶(P450)是血紅素依賴的氧化酶，廣泛分布與各種生物中，具有非常復雜的功能，可以催化成千上萬的反應。在植物界分布也非常的廣泛，可以催化反應超過50種，也涉及到類黃酮的合成。它在二氫黃酮醇的3'和5'位置選擇性的加入輕基，產生不同的花色素營從而使得植物顯現出不同的顏色。
具體實施例方式
下面結合具體實施實例進一步闡釋本發明。應理解，這些實例僅以用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規方法進行。如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York :ColdSpring Harbor Labortary PreSS，1989)中所述條件，或按照制造生產廠商的使用說明。
實施例1 本發明的生物克隆具體操作步驟為 1、蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海農業科學院蔬菜園藝研究所，品種為Formosa rosa，花色為紫色，白色，黃色。植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h ;25 — 28°C )。 2、 RNA提取。取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加lmLTriBlue試劑，用力搖15s，室溫放置5min。加0. 2mL氯仿，去蛋白，上清轉移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。用DEPC配制的75%乙醇lmL洗滌沉淀，重復一次。室溫干燥5 — 10min，溶于20 y L DEPC水中，測0D值，電泳檢測。 3、基因的克隆。通過對已發表的F3' 5' H基因序列進行同源性比較，根據保守區設計兼并引物F和R，進行RT — PCR。 4、由于基因片段過大，前述步驟無法獲得完全基因序列，以3' RACE獲得F3' 5' H基因的3'端。提取總RNA，逆轉錄為cDNA。依次使用多輪引物包括AP， AUAP， 3GSPI， 3GSP2，3GSP3， 3GSP4進行巢式PCR擴增。 5、5'端及其上游序列以IPCR方法獲得。將基因組DNA以市售的Xbal、 Xhol和Sphl三種酶進行酶切。再酶切產物自連，以反式PCR擴增。進行三輪擴增反應，每一輪均使用前一輪的產物作為模版。最后得到的特異PCR特異產物連接到pGEM — T載體，克隆、測序。使用的引物包括5 — r，5 — 2，5 — 3，5 — 4，5 — 5，5 — 6，5 — 7，5 — 8，3 — P，3 —2，3 — 3。
權利要求
一種生物類黃酮色素，其特征在于，本發明的生物克隆具體操作步驟為(1)蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海農業科學院蔬菜園藝研究所，品種為Formosa rosa，花色為紫色，白色，黃色；植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h；25一28℃)。(2)RNA提取取100毫克左右新鮮的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue試劑，用力搖15s，室溫放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清轉移至新的離心管，加等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗滌沉淀，重復一次。室溫干燥5一10min，溶于20μL DEPC水中，測0D值，電泳檢測。(3)基因的克隆通過對已發表的F3′5′H基因序列進行同源性比較，根據保守區設計兼并引物F和R，進行RT一PCR。(4)巢式PCR擴增由于基因片段過大，上述步驟無法獲得完全基因序列，以3′RACE獲得F3′5′H基因的3’端；提取總RNA，逆轉錄為cDNA；依次使用多輪引物包括AP，AUAP，3GSPI，3GSP2，3GSP3，3GSP4進行巢式PCR擴增。(5)5’端及其上游序列以IPCR方法獲得將基因組DNA以市售的XbaI、XhoI和SphI三種酶進行酶切；再酶切產物自連，以反式PCR擴增；進行三輪擴增反應，每一輪均使用前一輪的產物作為模版；最后得到的特異PCR特異產物連接到pGEM一T載體，克隆、測序。
全文摘要
一種生物類黃酮色素屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體涉及一種生物類黃酮在觀賞植物中的表達。本發明在于提出一種從觀賞植物中克隆出的生物類黃酮。本發明的生物克隆具體操作步驟為1、觀賞植物的生長培養。2、RNA提取；3、基因的克隆；4、巢式PCR擴增；5、5’端及其上游序列以IPCR方法獲得。
文檔編號C12N15/53GK101748142SQ20081022959
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者肖懿 申請人:肖懿