專利名稱：輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法
技術領域：
本發明涉及基因組的檢測方法技術領域，特別是涉及輻射誘發基因組不穩定性的
檢測方法。
背景技術：
基因組不穩定性是指基因組處于一種損傷易感態，它可以放大與累積其它損傷的
發生，最終的遺傳改變體現在細胞照射后許多代仍然持續存在的基因組損傷，而受照細胞
本身并不是以某種特定的畸變形式出現。因此利用一些常規實驗手段(如克隆存活率、單
細胞凝膠電泳SCGE以及微核發生率等)很難直接來驗證基因組不穩定性，因為只有當損傷
累計到足夠多的情況下才能利用一些常規實驗手段檢測到基因組不穩定性的發生。 基因組不穩定性是目前研究的熱門課題，特別是人們認識到基因組不穩定性可能
是多級致癌理論中至關重要的一步，因此對基因組不穩定性的檢測成為重要的研究方法，
但現有技術存在上述的缺點，因此特別需要借助其他方法來放大基因組不穩定性的效應，
以便于我們在常規實驗條件下對其進行檢測。
發明內容
本發明的目的在于提供一種輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法，通過該檢測方法能夠在常規的實驗條件下檢測到基因組不穩定性，并且周期短，操作簡便，可以更方便快捷地進行基因組不穩定性的檢測。 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案 輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法，包括以下步驟 (1)取對數生長期的CHL細胞消化后，在冰浴條件下進行6°Co Y射線照射，照射時分別采用不同的照射劑量，然后對照射后各個劑量點的CHL細胞立即進行克隆形成率、單細胞凝膠電泳、微核形成率的測定； (2)對受照后存活的各劑量點的細胞傳25代后，進行單細胞凝膠電泳、微核發生率和染色體畸變率的檢測； (3)對受照后存活的各劑量點的第26代或者以后的傳代細胞，在與步驟(1)中相同的條件下再次用6°Co Y射線照射，照射劑量均為^ 2Gy，照射后立即進行克隆形成率、單細胞凝膠電泳、微核形成率的測定。 進一步，為使本發明獲得更好的發明效果，步驟(1)中，照射時采用3-6個劑量點進行照射，每個劑量點的照射劑量分別為《10Gy ; 進一步，為使本發明獲得更好的發明效果，步驟(3)中，對受照后存活的各劑量點的第26代或者以后的傳代細胞進行照射時，照射劑量為2Gy ; 進一步，為使本發明獲得更好的發明效果，步驟(3)中，對受照后存活的各劑量點的第33代或者以后的傳代細胞進行照射。 本發明的效果在于，采用本發明所述的方法，具有如下優點利用二次照射手段模擬體內可能出現的二次事件，并且擴大了細胞的損傷終點效應，從而可以對多次傳代后較難以測定的延遲損傷與延遲突變進行檢測，這樣不僅克服了傳統的直接檢測所需觀察時間長的缺點，而且也克服了由于發生率太低難以在常規實驗條件觀察到基因組不穩定性的缺點，實現了在常規實驗條件下對輻射誘發基因組不穩定性的檢測。
圖1是6°Co- Y射線照射后CHL細胞的克隆存活率示意圖； 圖2是6°Co- Y射線照射后CHL細胞的SCGE檢測結果示意圖； 圖3是6°Co- Y射線照射后CHL細胞的微核發生率示意圖； 圖4是一次照射的CHL細胞經傳25代后的SCGE檢測結果示意圖； 圖5是一次照射的CHL細胞傳25代后的微核發生率示意圖； 圖6是培養33代的細胞子代經2Gy 二次照射后的SCGE檢測結果示意圖； 圖7是培養33代的細胞子代經2Gy 二次照射后的微核發生率示意圖。
具體實施例方式
(1)取對數生長期的CHL細胞消化后，在冰浴條件下進行6°Co Y射線照射，具體到本實施例中，將對數生長期的CHL細胞消化后按IX 105的細胞濃度分別接種于6個25ml培養瓶中，放至于冰上，然后進行照射，照射劑量分別為0、2、4、6、8、10Gy，然后對照射后各個劑量點的CHL細胞立即進行克隆形成率、SCGE、微核形成率的測定，測定結果見圖l-圖3，該結果表明從細胞存活率曲線可以看出隨著照射劑量的增大，細胞存活率明顯降低；隨著照射劑量的增大，細胞SCGE尾長增長，且二者存在明顯的劑量_效應關系，其劑量_效應關系符合方程Y = 2. 081+0. 297X，相關系數r = 0. 992， P < 0. 0001。微核的發生率同受照劑量之間存在一定的劑量_效應關系，其劑量_效應關系符合方程Y =1. 986+1. 071X+0. 180X2，相關系數r = 0. 983， P < 0. 0001 。 事實上，通過該步驟的處理，實現了^Go Y射線照射CHL細胞后直接損傷效應的檢測，通過實驗數據即可以觀察到照射后CHL細胞的直接損傷效應； (2)受照后存活的各劑量點的細胞傳25代后，進行單細胞凝膠電泳(SCGE)、微核發生率和染色體畸變率的檢測，測定結果見圖4-圖5，該結果表明一次照射的CHL細胞經傳25代后各劑量點細胞的SCGE彗星尾長已無明顯差異；各劑量組的微核發生率相差也很小，基本恢復正常。從該實驗結果可以看出，受照后存活細胞對誘發的DNA損傷具有良好的修復作用，在細胞傳代至25代后，各劑量點的細胞間無明顯差異，成活率趨于一致；
(3)對受照后存活的各劑量點的第33代傳代細胞，在與步驟(1)中相同的條件(即相同的細胞濃度和冰浴條件)下再次用6°CoY射線照射2Gy，該照射使細胞形成二次損傷，立即進行克隆形成率、微核形成率與SCGE的檢測，實際上也就是對CHL細胞滯后效應的間接測定，測定結果見圖6-圖7，該結果表明二次損傷后的效應與第一次照射劑量明顯相關，顯示各劑量點間克隆形成能力總體存在下降趨勢；而SCGE結果明確顯示照射后所存在的滯后效應隨著初始照射劑量的增大而增大。同時微核發生率顯著升高，與第一次受照劑量呈線性相關關系。 從該測定結果可以看出二次照射使得基因組不穩定性表現出了明顯的擴大效
4應，滯后損傷程度與初始受照劑量之間存在良好的劑量效應關系，從而證實了^Co Y射線在CHL細胞中能夠誘發基因組不穩定性。 上述的檢測結果表明細胞在接受射線照射后，細胞的生存率會隨所受劑量的大小、DNA損傷程度的不同表現出不同的生存能力，但傳代至25代后，各劑量組的細胞間無明顯差異，成活率趨于一致。此時，受照后各劑量點存活細胞的子代在統一給予二次照射后，SCGE結果與微核發生率結果均表明，滯后損傷程度與初始受照劑量之間存在良好的劑量效應關系，從而證實了 6°Co Y射線在CHL細胞中能夠誘發基因組不穩定性。
本發明所述檢測方法的意義在于利用二次照射方法為在常規實驗條件觀察基因組不穩定性提供了一個較好的研究手段。由于基因組不穩定性可能是多級致癌理論中至關重要的一步，因此，對它的不斷深入研究將為揭示細胞凋亡和癌癥形成起到重要的作用，進而更好地為健康風險評價及輻射防護工作服務。 顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。
權利要求
輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法，包括以下步驟(1)取對數生長期的CHL細胞消化后，在冰浴條件下進行60Coγ射線照射，照射時分別采用不同的照射劑量，然后對照射后各個劑量點的CHL細胞立即進行克隆形成率、單細胞凝膠電泳、微核形成率的測定；(2)對受照后存活的各劑量點的細胞傳25代后，進行單細胞凝膠電泳、微核發生率和染色體畸變率的檢測；(3)對受照后存活的各劑量點的第26代或者以后的傳代細胞，在與步驟(1)中相同的條件下再次用60Coγ射線照射，照射劑量均為≥2Gy，照射后立即進行克隆形成率、單細胞凝膠電泳、微核形成率的測定。
2. 根據權利要求l所述的輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法，其特征在于步驟(1)中，照射時采用3-6個劑量點進行照射，每個劑量點的照射劑量分別為《10Gy。
3. 根據權利要求l所述的輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法，其特征在于步驟(3)中，對受照后存活的各劑量點的第26代或者以后的傳代細胞進行照射時，照射劑量為2Gy。
4. 根據權利要求l所述的輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法，其特征在于步驟(3)中，對受照后存活的各劑量點的第33代或者以后的傳代細胞進行照射。
全文摘要
本發明涉及基因組的檢測方法，特別是涉及輻射誘發基因組不穩定性的檢測方法。本發明所述的檢測方法，先給予細胞首次照射，并測定其SCGE與微核發生率，然后對受照后存活的各劑量點的細胞傳25代后，測定SCGE與微核發生率，然后對受照后存活的各劑量點的第26或以后的傳代細胞進行二次照射，再次測定SCGE結果與微核發生率，通過比較SCGE與微核發生率，即可明顯看出二次照射可以誘發基因組不穩定性，細胞表現出明顯的擴大損傷效應。采用本發明所述的方法，可以直接檢測到基因組不穩定性，克服了傳統的直接檢測所需觀察時間長和發生率太低難以在常規實驗條件觀察到基因組不穩定性的缺點。
文檔編號C12Q1/02GK101748203SQ20081022799
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月4日 優先權日2008年12月4日
發明者左雅慧, 王仲文, 王小莉, 王放 申請人:中國輻射防護研究院