專利名稱：：一種蘋果腐爛病抗性的離體鑒定方法
技術領域：
：本發明涉及一種蘋果腐爛病抗性的離體鑒定方法。
背景技術：
：蘋果腐爛病俗稱爛皮病，是我國北方蘋果樹重要病害之一，病原ValsamaliMiyabeetYamada稱蘋果黑腐皮殼菌，屬子囊菌亞門真菌。無性世代為CytosporamandshuricaMiura稱蘋果干腐爛殼囊孢菌，屬半知菌亞門真菌。該病具有潛伏侵染和連續發作等特點，一旦發病，無藥可治，造成樹勢衰弱、枝干枯死、死樹，甚至毀園。因此，鑒定蘋果腐爛病抗性種質，培育抗性品種，是防治腐爛病的重要舉措。目前蘋果腐爛病抗性鑒定多用菌絲做侵染源。陳策(陳策.病原菌的分離、人工培養和接種[J].中國果樹1978，(5))提出，用菌絲塊接種經過燙傷的離體枝條，來鑒定蘋果腐爛病抗性，但這種方法未見應用于具體實踐。劉捍中等(劉捍中，任慶棉，劉立年.蘋果樹主要種質資源抗蘋果腐爛病性狀調查[J].山西果樹，1990，(02))用菌絲塊接種正在生長的蘋果樹野生樹種，鑒定出12份抗性資源。日本學者(Abe，K.;Kotoda，N.;Kato，H.;Soejima，(2007)ResistancesourcestoValsacanker(Valsaceratosperma)inagermplasmcollectionofdiverseMalusspeciesJPlantBreeding，126，p449_453)用收集制干的菌絲，配成菌絲懸浮液，接種離體枝條，鑒定蘋果樹野生樹種和富士、金冠、紅玉等栽培品種的抗病性，獲得了四個抗性相對較強的野生資源，而栽培品種之間抗性無明顯的差異。由于菌絲含有較多的毒素和降解樹皮細胞壁的酶類，這種接種方法致毒力大，發病迅速，難以鑒別蘋果品種的抗性。通過蘋果黑星病抗性育種和分子標記的實踐，大家認識到，鑒定栽培品種的抗性資源及抗性基因，通過育種使基因積聚，是今后抗性育種的重要方向。因此，發展一種合適的抗性鑒定方法，鑒定不同品種的抗性，培育抗性品種，是十分必要的。通過模式植物研究表明，抗病性機制是病原真菌和植物宿主相互作用的結果；分生孢子萌發、侵入所產生的一系列誘導因子是影響植物產生抗性的重要因素(JanA.L.vanKan，(2006)LicensedtokillthelifestyleofanecrotrophicplantpathogenTRENDSinPlantScience.11，247-253)。
發明內容本發明的目的是提供一種蘋果腐爛病抗性的離體鑒定方法。本發明所提供的蘋腐爛病抗性的離體鑒定方法，包括以下步驟(1)將蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)的分生孢子在20-30。C培養6_24小時，得到萌發的分生孢子；(2)用步驟(1)萌發的分生孢子接種離體的樹枝，在20-3(TC，相對濕度為60_100%的條件下進行培養，培養5-16天后取出枝條，進行抗性鑒定。所述樹枝在接種前還需進行如下處理將樹枝洗凈晾干，在晾干的樹枝上打孔，孔深至木質部，去除樹皮；所述孔的直徑為4-10mm。其中，步驟(1)中所述蘋果腐爛病菌分生孢子在PDA液體培養基中進行培養，所述蘋果腐爛病菌分生孢子在PDA液體培養基中的初始濃度可為1X104_1X108CFU/毫升。步驟(1)中所述培養為震蕩培養，震蕩的轉速可為100-300轉/分鐘。步驟(2)中所述萌發的分生孢子配制成懸浮液進行接種，所述懸浮液中萌發的分生孢子的濃度為1X104_1X108CFU/毫升。本發明所述蘋果腐爛病可發生于蘋果屬(Malus)果樹，如蘋果、沙果、海棠、香果等。所述樹枝具體可為蘋果樹枝；所述樹枝的直徑可為0.1-4.0厘米。目前蘋果腐爛病抗性鑒定多用菌絲做侵染源，但一方面由于菌絲生長狀態不一致，導致鑒定結果可靠性不高；另一方面是有的侵染方法致毒力大，發病迅速，難以鑒別蘋果品種的抗性。雖然用蘋果腐爛病分生孢子做侵染源是比較理想的接種方式，但由于分生孢子萌發需要營養，而單憑傷口提供的營養難于支持孢子侵染發病，成為使用分生孢子做侵染源的制約因素。本發明鑒定蘋果腐爛病抗性的方法是采用經過培養的處于萌發狀態的孢子，侵染樹枝，不僅符合腐爛病菌侵染的規律，而且致病力適中，發病均勻，可以較好的鑒定蘋果品種對腐爛病的抗性。本發明方法的優點在于根據植物抗病性研究進展和腐爛病發病特點，用經過處理的腐爛病菌分生孢子，接種經過處理的離體樹枝，進行蘋果腐爛病抗性鑒定，具有方便、快速、簡單易行、結果可靠等優點。用萌發的分生孢子做侵染源，符合腐爛病菌侵染發病的規律；用離體枝條做試材，有效避免了用生長果樹做試材帶來的損失和不便；接種的分生孢子數量可控，更能顯示蘋果品種抗性的差異。圖1為蘋果腐爛病菌分生孢子器的圖片。圖2為蘋果腐爛病菌萌發的分生孢子的圖片。圖3為實施例1中未發病與發病枝條的圖片，圖左為高抗個體26-88的圖片，圖中為抗性個體22-98的圖片，圖右為高感個體22-117的圖片。具體實施例方式實施例1、金冠和紅玉雜交后代的腐爛病抗性鑒定及篩選1、培養基的配置(l)PDA培養基的配制配方去皮馬鈴薯200g蔗糖(C^H220n，CHG/T3462-1999，北京化工廠)20g瓊脂(DH0110-1.l，北京鼎國生物技術有限責任公司)15-20g蒸餾水(GB50172-92):1000ml操作步驟1)將去皮馬鈴薯秤取200g，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘渣，收集濾液；2)向濾液中分別加入瓊脂和蔗糖加熱融化，用蒸餾水定容至1000ml;3)將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；4)將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋中，12rC高壓蒸汽滅菌20min;5)在無菌條件下，將25ml融化的培養基倒入培養皿中，冷卻凝固，編號待用。(2)液體PDA培養基的配制配方去皮馬鈴薯200g葡萄糖(HG/T3475-1999，北京化學試劑公司)20g蒸餾水(GB50172-92):1000ml操作步驟1)將去皮馬鈴薯秤取200g，切成小塊，放入燒杯中，加水800ml，煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯及其殘渣，收集濾液；2)向濾液中加入葡萄糖，加熱融化，用蒸餾水定容至1000ml;3)將溶液分裝到三角燒瓶中，密封，編號；4)將分裝好的溶液放到高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-18SI0，北京東南儀誠實驗室設備有限公司)中，12rC高壓蒸汽滅菌20min，待用。2、蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)ACCC30052分生孢子的培養萌發1)將蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)ACCC30052接種于PDA培養基上，置恒溫光照培養箱(HPG-280BX，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)中，26t:光照恒溫培養30天；2)將變黑的分生孢子器(見圖1)取下，在無菌的條件下，置滅菌的研缽中研碎，加入液體PDA培養基；3)將液體PDA培養基轉入45ml離心管中，以1500-3000轉/分鐘的轉速離心5分鐘；4)取上清，轉入滅菌的三角燒瓶中，取少量懸浮液，用血球計數板(36XL上海宙山精密光學儀器有限公司)在400倍下計數分生孢子濃度，然后用液體PDA培養基將懸浮液中分生孢子的濃度調節至1X106CFU/毫升；5)將懸浮液置26t:恒溫振蕩培養箱(BS-1EA金壇市杰瑞爾電器有限公司)中，以100-300轉/分鐘震蕩的轉速培養12小時，使分生孢子萌發(見圖2);6)將經過培養的懸浮液以1500-3000轉/分鐘離心10分鐘，去上清，用蒸餾水重懸分生孢子，將孢子濃度調節至1X106CFU/毫升。3、接種、培養及抗性鑒定1)金冠(統一編號PGB0196)與紅玉(統一編號PGB0057)于2003年雜交，獲取的種子萌發后定植于育種圃。2008年冬天，選取金冠與紅玉雜交的68株實生樹，每株樹取直徑約l厘米的休眠蘋果枝條三根，截成20厘米的長度，用水洗凈晾干，用打孔器(江都市三聯玻璃儀器廠)間隔相等的距離打三個孔，孔的直徑為10mm，孔深至木質部，去除樹皮，試驗設三次重復；2)將40iU濃度為1X106CFU/毫升的孢子懸浮液用移液器加入每個樹孔中，待溶液吸收完全后，將枝條用濕毛巾包裹保濕(相對濕度大于60%)，放入瓷盤，在培養箱(HPG-280BX哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)中26t:恒溫培養；3)培養七天后取出枝條，測量病斑擴展長度，劃分抗性等級；5按接種點病斑擴展情況進行劃分高抗未發病；抗發病，但未擴展；中抗擴展系數小于0.25;中感擴展系數小于0.5;感擴展系數小于0.75;高感擴展系數大于或等于0.75或等于1;擴展系數=平均擴展長度/最感個體平均擴展長度；抗性分級結果根據抗病性分級，試驗所選用的68株實生樹中獲得高抗個體4株，抗個體6株，中抗個體18株，感病個體12株，中感個體17株，高感個體11株(見表1)。表l的數據表明，在接種一定量的經過處理的分生孢子后，經7天，金冠和紅玉雜交后代腐爛病抗性差別明顯，能夠較好的區分抗、感個體，為抗性個體篩選、分子標記奠定了基礎。本實驗重復三次，結果重現性好。圖3為實施例中未發病與發病枝條的圖片，其中，高抗個體26-88枝條如圖3左所示，由圖可知高抗個體接種孔周圍未出現壞死現象，并長出愈傷組織；抗性個體22-98的枝條如圖3中所示，由圖可知抗性個體病斑擴展速度較慢，在接種孔周圍出現壞死組織，樹皮腐爛，壞死組織和未發病部分區別明顯；高感個體22-117枝條如圖3右所示，由圖可知高感個體發病迅速，7天壞死組織即擴展至全枝條，樹皮腐爛。且高感個體22-117枝條有明顯的酒糟味。表1病斑擴展長度及抗性分級個體號總擴展長度(cm)平均擴展長度(cm)擴展系數抗性分級26—88000高抗25—15000高抗37—56000高抗22—98000高抗42—1140.50.170.01抗45—1090.60.20.01抗40—1230.80.270.02抗6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求蘋果腐爛病抗性的離體鑒定方法，包括以下步驟(1)將蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)的分生孢子在20-30℃培養6-24小時，得到萌發的分生孢子；(2)用步驟(1)萌發的分生孢子接種離體的樹枝，在20-30℃、相對濕度為60-100％的條件下進行培養，培養5-16天后取出枝條，進行抗性鑒定。2.根據權利要求l所述的方法，其特征在于所述樹枝在接種前進行如下處理將樹枝洗凈晾干，在晾干的樹枝上打孔，孔深至木質部，去除樹皮；所述孔的直徑為4-10mm。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述蘋果腐爛病菌的分生孢子在液體PDA培養基中進行培養，所述蘋果腐爛病菌的分生孢子在液體PDA培養基中的初始濃度為1X104-1X108CFU/毫升。4根據權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述培養為震蕩培養，震蕩的轉速為100-300轉/分鐘。5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述萌發的分生孢子配制成懸浮液進行接種，所述懸浮液中萌發的分生孢子的濃度為1X104-1X108CFU/毫升。6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述萌發的分生孢子配制成懸浮液進行接種，所述懸浮液中萌發的分生孢子的濃度為1X104-1X108CFU/毫升。7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述樹枝為蘋果樹枝。8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述樹枝的直徑為0.1-4.0厘米。全文摘要本發明公開了一種蘋果腐爛病抗性的離體鑒定方法。該方法包括以下步驟(1)將蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamada)的分生孢子在20-30℃培養6-24小時，得到萌發的分生孢子；(2)用步驟(1)萌發的分生孢子接種離體的樹枝，在20-30℃，相對濕度為60-100％的條件下進行培養；培養5-16天后取出枝條，進行抗性鑒定。本發明鑒定蘋果腐爛病抗性的方法是根據植物抗病性研究進展和腐爛病發病特點，采用經過培養的處于萌發狀態的孢子，侵染樹枝，不僅符合腐爛病菌侵染的規律，而且致病力適中，發病均勻，可以較好的鑒定蘋果品種對腐爛病的抗性，具有方便、快速、簡單易行、結果可靠等優點。文檔編號C12Q1/02GK101750478SQ200810227888公開日2010年6月23日申請日期2008年12月2日優先權日2008年12月2日發明者劉廣華,張新忠,韓振海申請人:中國農業大學