專利名稱：一種玉米Zmptil基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，特別涉及一種玉米Zw;^7基因啟動子及其應用。
背景技術：
植物基因啟動子是重要的順式作用元件，是一段提供RNA聚合酶識別和結合的DNA序列，它通常位于基因的上游，能指導酶與模板的正確結合，活化RNA聚合酶，使之具有起始特異性轉錄的形式，并決定轉錄的方向和效率，是植物基因轉錄調控的中心。
在生物的生長、發育、生殖過程中，生物能夠根據自身的需要及環境的改變，定時、定位及定量地表達所需的基因產物，生物的這種能力是通過其核苷酸上的特定序列和細胞內的蛋白信號或環境中的熱、光等理化因素的相互作用來實現的。在這個過程中涉及到啟動子、終止子等序列調控元件，在這些調控元件中，啟動子的作用尤為重要。因此，啟動子的克隆及功能分析，成為我們了解生物的生長發育過程、探討生物對其生長環境的適應機制以及更好控制外源基因在轉基因植物中的表達等具有重要意義。對于一些己知序列的啟動子和那些己經全基因組測序的生物，可以設計序列特異性引物，通過PCR擴增的方法克隆基因的啟動子序列。在只知道基因的cDNA序列的情況下，可以利用PCR技術設計很多方法克隆其上游的啟動子區序列，如環狀PCR、利用載體的PCR、利用接頭的PCR、 YADE法、TAIL-PCR等等。
蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質可逆磷酸化是生物體內普遍存在的一種調節機制，它在細胞的信號識別與轉導中起著重要作用。目前，許多編碼植物蛋白激酶的基因已經分離出來,然而人們對大多數植物蛋白激酶的功能還不甚了解，它們對基因表達和代謝過程的調節機制、偶聯胞外刺激和胞內反應的方式以及其所調節的功能蛋白等許多問題還有待進一步的研究。
Zm;^7基因編碼一個有功能的蛋白激酶，半定量RT-PCR分析表明，與其他/^74目似，Zm/^7的表達可以被信號分子SA所上調，表明Zmi^7可能在SA依賴的抗病信號途徑中起作用；在玉米中，不同非生物脅迫條件下，
Zm/^7也可以被低溫、甘露醇和鹽所誘導表達，但是不被ABA所誘導；在35S啟動子下，在擬南芥中持續表達Zmi^7，與野生型相比，轉基因植株的抗病性沒有明顯提高，再抗冷性和抗旱性方面沒有明顯的提高，但是明顯提高了抗鹽性(尸/a""c/e""， 2006， 171: 99-105.)。以上實驗顯示，該基因受到脅迫誘導，但是對它轉錄調控的分子機制還不清楚。在不同的植物體中，Zw/^7的誘導表達情況不同，可能原因是該基因在不同植物體內，和不同啟動子的調控作用下，顯示出表達量的差異。
發明內容
本發明提供一種玉米Zm;^7基因啟動子及其應用，該啟動子序列經分析發現含有與脅迫相關的轉錄因子的結合位點，Zm尸A7基因在玉米中受到該啟動子的調控，參與了逆境信號的傳導途徑。本發明構建了瞬時表達載體，該啟動子的瞬時表達的結果顯示，該啟動子是有功能的啟動子。
一種玉米Zm;^7基因啟動子，其特征在于是下列核苷酸序列之一
A. 序列表中的SEQIDNQ: 1;
B. 與序列表中的SEQ IDNq: 1限定的DNA序列具有90%以上同源性的DNA序列；
C. 在高嚴謹條件下可以與序列表SEQIDNQ: 1限定的DNA序列雜
交的序列。
所述的啟動子，其特征在于
所述的SEQIDN2: l中，在自5'端第53位至第747位堿基為該序列的啟動子核心序列，在自5'端第590位至第594位堿基有1個TATA-box,在自5'端第61位至第69位堿基有1個響應脫落酸ABA的motifllb序列，在自5'端第505位至第511位堿基有一個響應赤霉素的GARE-motif序列，在自5'端第584位至第589位堿基有1個CCAAT-box是MYBHvl轉錄因子的結合位點。
所述的SEQIDNq: l中，含有與信號傳導相關的順式作用元件。所述的與信號傳導相關的順式作用元件為與光應答有關的順式作用元件ACE 、 TGG-motif、 circadian 、 I-box 、 Spl ;增強轉錄的順式作用元件CAAT-box 、 CCAAT-box、 G-box 、 GC-motif ;胚乳表達的順式作用元件Skn-l-motif、 GCN4-motif;參與玉米醇溶蛋白代謝相關的順式作用元件02-site。
所述的啟動子具有明顯啟動子特性，與現已知啟動子無同源性，通過瞬間表達證明其能夠驅動基因表達，是個全新啟動子。
含有的所述的啟動子的表達盒、表達載體、細胞系、宿主菌，均屬于本發明的保護范圍。
能夠擴增出所述的啟動子任一片段的引物對，均屬于本發明的保護范圍。
研究所述的啟動子在植物中應用方法包括的步驟為啟動子下游基因
5'端的未知序列的擴增、啟動子片段的克隆、植物表達載體的構建、轉化植物、瞬時表達的顯微觀察，其特征在于，所述的啟動子下游基因5'端的擴增未知序列采用YADE法，所述的轉化植物的方法是基因槍法。
本發明的有益效果為
本發明中克隆的玉米Z/w尸07基因啟動子，研究該啟動子在玉米中的轉錄調控機制以及在抗逆信號途徑中的作用，有希望將它直接應用到轉基因工程中，改良作物抗逆性狀，加快作物的育種進程。
圖1:玉米基因組的酶切結果；
圖2: YADE法擴增ZmW〃基因5'端未知序列結果；
圖3: ZmpW基因5'端調控區序列及其分析結果；
圖4: Zm/^7基因啟動子的PCR檢測結果；
圖5: 基因啟動子驅動的GFP瞬時表達的顯微觀察結果。
具體實施例方式
實施例l: YADE法擴增Zm/^7基因5，端未知序列
1.引物的設計與合成
接頭序列的設計參照論文《用銜接頭PCR克隆新的胡蘿卜II型轉化酶基因啟動子》(王新國，肖成祖，張國華，方榮祥.^^^"激眾學與分f主激學叛,2001, 17(1): 61-65.)和《Analysis of differential gene expression bydisplay of 3， end restriction fragments of cDNAs》(Prashar Y, Weissman S M.尸racA^/A^/Sc7'[/AS, 1996,93:659-663.)中所述的方法，設計下述引物接頭長鏈A1: 5' CGGTAGGATCCCGCAGAACGACGCCAG3，；接頭短鏈A2: 5' AGCTCTGGCCCTCCAAGACGC3，；接頭引物A3: 5， CGGTAGGATCCCCAGAAC3，；
2. 內切酶的選用
采用CTAB (CTAB:十六烷基三甲基溴化銨)法提取從玉米自交系178的葉片中提取玉米基因組，選用6種常用內切酶BamHI、 EcoRI、HindIII、 Ncol、 Sall、 Xhol，酶切玉米基因組DNA。酶切結果在含0.5昭/ml溴乙啶的1%瓊脂糖凝膠上電泳；電泳圖如圖1所示，泳道M中為DL15000DNA marker,泳道l陽6中分別為BamHI、 EcoRI、 HindIII、 Ncol、 Sall、Xhol對該玉米基因組的酶切結果；表明不同的酶切對玉米DNA的酶切效率各不相同，其中NcoI對玉米DNA酶切后片斷較散，另外5種酶酶切較完全。因此，選用這6種酶切產物進行連接和擴增。
3. YADE法擴增》w; n7基因5 ，端未知序列
A:酶切取2昭玉米基因組DNA，用10U的上述6種內切酶按產品說明書的條件按20^1體系酶切過夜，再進行70°C 10min滅活，得到玉米基因組酶切滅活產物；
B. 加接頭取2|il接頭短鏈(0.68ug/(xl)，加入5U T4 Polynucleotidekinase, 10mmol/LATP lpl，按產品說明書的條件按lOpl體系加入上述的玉米基因組酶切滅活產物，37。C保溫30min，再進行70。C滅活10min;再加入2 pl 10X退火緩沖液，2^接頭長鏈(0.68ug4il)和6^il水，65。C保溫10min，慢慢卻冷到室溫；取2^1接頭引物(130ng爾l)和5ng上述玉米基因組酶切滅活產物，加入5U連接酶，16'C連接16h，得到連接產物。
C. YADE法擴增a.第一步線性擴增
根據玉米Zmptil的cDNA設計的特異引物為上游引物5'TGAAGCATTAAACCTCGTGCAG3， ； (Z3)下游弓l物5，AACCATTTCCTTTCTCCTC3'; (Z4)擴增反應體系為總反應體積為25(il:上述的連接產物lpl; 10XPCR
Buffer 2.5^1; dNTPs 200 mol/L; 1.5mmol/L MgCl2; 200mnol/L特異引物；
lUTaq DNA聚合酶；
PCR反應的程序為
94 °C 5min
94 °C30s 、
756°C 30s 40個循環
72 °C 30s 72 °C 7min; 得到線性擴增產物； b.第二步指數擴增-
取l^ll上述的線性擴增產物進行第二步指數擴增，除引物為接頭引物 和特異引物外，反應體系中其他成分同上述的線性擴增。PCR反應程序為 94 °C 5min 94°C 30s 、 56°C 30s^ 35個循環 72°C 30s J 72 °C lOmin;
得到指數擴增產物，即為ZmpW基因5'端未知序列；將該ZmpW 基因5'端未知序列在含0.5pg/ml溴乙啶的1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測； 如圖2所示，泳道1中為DL15000 DNAmarker,泳道2-7中分別為經內切 酶BamHI、 EcoRI、 HindIII、 Ncol、 Sall、 Xhol酶切玉米基因組酶切滅活 產物的對Zmptil基因5'端延伸的結果；圖2中，泳道2-泳道4中均顯示 擴增出的長度在750bp和lOOObp之間的片段；將該片段經過測序，可知 該片段為一個長度為S48bp的序列。
D. Zmp"7基因5'端未知序列分析
經相似性分析和比對，上述長度為848bp的Zm;^7基因5，端未知序 列與已知的啟動子沒有相似性，是個全新的啟動子。如圖3所示，對上述 長度為848bp的基因5'端未知序列的通過啟動子預測軟件 PlantCARE對序列進行在線分析(網址為http: 〃 bioinfo腿tics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html)，其中"+"表示該序列的正鏈，"-"表示該序 列的負鏈；圖3中的分析結果為該序列中，在自5'端第53位至第747 位堿基為該序列的啟動子核心序列，在自5'端第590位至第594位堿基 有l個TATA-box，在自5'端第61位至第69位堿基有1個響應脫落酸 ABA的motifIIb序列，在自5'端第505位至第511位堿基有一個響應赤 霉素的GARE-motif序列，在自5'端第584位至第589位堿基有1個 CCAAT-box是MYBHvl轉錄因子的結合位點。如圖3所示，對上述長度為848bp的Zm;^7基因5'端未知序列的序 列結構進一步用PlantCARE軟件進行分析；圖3中的分析結果為該序列 含有一些與各種信號傳導相關的順式作用元件，如與光應答有關的ACE 、 TGG-motif、 circadian 、I-box 、Spl ，增強轉錄的CAAT-box 、CCAAT-box、 G-box 、GC-motif ,及胚乳表達的瞬式作用元件Skn-l-motif、 GCN4-motif， 參與玉米醇溶蛋白代謝相關的順式作用元件02-site等。上述結果表明，該 長度為848bp的ZmpW基因5'端未知序列具有明顯的啟動子特性，為 Zm; //7基因的啟動子。
本實施例中采用YADE法分步擴增得到ZwAz7基因5'端未知序列。 YADE法為一種"Y"形接頭延伸未知序列的方法(YADE， Y-shaped Adaptor Dependant Extension)。其原理是接頭引物處于"Y"接頭的2個分叉單鏈 上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導合成了接頭的互補序列后，接 頭引物才能退火參與擴增。該方法能夠減少接頭引物的單引物擴增，具有 假陽性低、效率高的優點，理論上能擴出所有目的片段。
實施例2: Z/M/^7基因啟動子的克隆
根據上述序列分析后得到Zw/^7基因的啟動子，設計了PCR擴增引物 P848上游引物5，-ATTACGCCGTGCCCCGCC-3， P848下游引物5'隱ACCGACCTTTCCTTTGACTTA-3，； PCR擴增反應體系為
擴增反應體系為總反應體積為25nl;玉米基因組DNA50ng; 2.5^1 10 XPCRBuffer; dNTPs 200 mol/L; 1.5mmol/L MgCl2; 200mnol/L特異引物； lplTaqDNA聚合酶. PCR擴增反應程序為 94 °C 5min 94 °C 30s 、
72 °C 10min;
將上述序列的擴增產物在含0.5|ig/ml溴乙啶的1%瓊脂糖凝膠上進行 電泳檢測；如圖4所示，泳道1中為DL2000 DNA marker,泳道2-3中分 別為該Zm;^'7基因的啟動子擴增的結果；圖4中，泳道2、泳道3中均顯示擴增出的該Zm/^7基因的啟動子片段；將該片段測序驗證正確，并按照
產品T-載體使用說明書中的方法將該ZmpW基因的啟動子連接到T載體 上；
將該連接有Zm;^7基因的啟動子的T載體轉入大腸埃希氏菌 (&c/z^v'c/H'aco//)中，將該含有連接有Zm;^7基因的啟動子的T載體的 大腸埃希氏菌命名為Zmptil promoter001，送交中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，登記入冊編號(CGMCC No) 為2760，保藏日期為2008年11月24日。
再在所述的P848上游引物和P848下游引物上加入限制性內切酶 HindIII和Spel的酶切位點，PCR擴增得到含有酶切位點的片斷并測序驗 證結果正確。
實施例2中測序驗證含有酶切位點的片斷，兩端的酶切位點均為 HindIII和SpeI，將該片斷分別連接到質粒pGreen0029上，得到中間載體 pGreen0029-848;通過基因重組方法在該長度為848bp的啟動子后面引入 綠色熒光標記基因GFP，經過測序驗證正確后，得到植物表達載體 pGreen0029-848-GFP。
將所述的瞬時表達載體轉化到大腸桿菌DH5a (￡.co//)，擴大培養后
提采用堿裂解法提取質粒，將質粒溶液的濃度調整到lng/|il，用于實施例 4中的轉化。
實施例3:植物表達載體基因槍法轉化玉米葉片
A. 植物材料準備
a. 玉米植物材料為玉米自交系178;將玉米種子置于30X的NaC10 消毒5分鐘，再置于70%的乙醇洗兩次，最后用滅菌水洗數次，并置于滅 菌水中過夜，后將種子播種于蛭石中，27匸培養。10天后，植株長到大約 20cm高，葉片約10cm長；將整個植株平鋪于板上，葉片置于平板中心，用于
打基因槍。
b. 洋蔥切取2cmX4cm的洋蔥表皮組織置于MS固體平板培養基上， 27'C暗培養16h后用于打基因槍。
B. 基因槍轉化
a.微粒子彈的準備
取50pl金粉至無菌離心管，彈動；加入5^ll質粒(l嗎/)11)，彈指混合；加入50|il2.5MCaCl2，彈指混合；加入2(^1亞精胺，彈指混合；繼續震蕩 2 3min，靜置1 min， 1000rpm離心3min，吸去上清；14(^170%乙醇洗 沉淀，吸去上清；140^1無水乙醇洗沉淀，吸去上清；60^1無水乙醇重懸 沉淀，分散顆粒。
b.打基因槍步驟
先用70%乙醇對基因槍(PSD1000/He (Bio-md))表面及樣品室進行滅 菌，吹干；同時將可裂膜(臨界壓力為1300psi)浸泡在異丙醇中進行滅菌， 阻擋網、微彈載體及其固定器、固定工具、托座和鑷子等進行高壓滅菌(120 °C， 20min);打開氦氣瓶總閥，順時針旋轉氦氣調節閥，使壓力表指針的 示數為1300psi;打開基因槍及變壓器開關；將微粒載片固定環中，取DNA 及金粉的混合物加于微粒載片中心，干燥l-3min;安裝可裂膜于其托座上， 順時針擰到氣體加速器上；將空間環、阻擋網、阻擋網托座、微粒載片及 固定環(帶有微粒的一面朝下)安裝好，旋緊蓋子，插入槍中；把樣品 放在轟擊室中，關好門；按動真空鍵，待真空度至28英寸汞柱(約 88.05-94.82kpa)時，迅速按下"hold"鍵，接著按住發射鍵，并保持不動， 直到擊發為止；按通氣鍵待真空表回零后，取出樣品；最后關機。
用基因槍轟擊后，仍將玉米植株和洋蔥表皮置于有水的器皿中，同時 保證植株不折、不彎，于黑暗中放置，待顯微鏡觀察。
實施例4: Zm/^7基因啟動子瞬時表達的顯微觀察
將轟擊后12-24h的玉米葉片材料和洋蔥表皮在激光掃描共聚焦顯微 鏡(fTCSSP2)下進行分層掃描觀察，激發光波長為488nm和568nm，通 過FITC和TRITC濾光器觀察并收集GFP熒光。將收集到的GFP熒光圖 片轉入Adobe Photoshop軟件，同時進行疊加。
在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀察，通過FITC濾光器和TRITC濾 光器分別可以收集葉綠素熒光和GFP熒光。而未經基因槍轟擊的玉米葉 片(對照)在顯微鏡下沒有綠色熒光，只看到紅色的葉綠素熒光(圖略)。
在經包裹有質粒的金粉轟擊后的玉米葉片細胞中均看到綠色的GFP 熒光，如圖5所示。在細胞中，收集到GFP綠色熒光如圖5(A)，葉綠素 的發出紅色的熒光圖5(B) ， A和B疊加后，紅光和兩側光重疊的部分， 顯示黃的熒光，如圖5(C)。由于玉米葉片較厚，部分明場未掃描到，因 此無清晰明場圖，如圖5(D)。
11從顯微鏡觀察的結果可以看出，經基因槍轟擊后的葉片均能收集到 GFP表達的綠色熒光；在用普通熒光顯微鏡觀察時，848bp長度的片斷作 為啟動子的瞬時表達載體能夠觀察到綠色熒光，說明該片段具有啟動子功 能。
實施例1至實施例4中，各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA 聚合酶均購自Takara公司；DL2000+15000Marker購自Takara公司；植物 表達載體pGreen0029、 DNA純化試劑盒、T-載體試劑盒、凝膠回收試劑盒 均購自Promega公司；CTAB等其他常規生化試劑購自北京經科宏達生物 技術公司和北京欣經科生物技術公司。
實施例1至實施例4中，PCR引物合成和DNA測序工作均由上海生 工生物工程技術服務有限公司完成。
實施例1至實施例4中，所述的PCR反應使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因擴增儀，購自MJ Research Inc公司；所述的瓊脂糖凝膠電泳使 用UVP Gel Documentation凝膠分析系統，購自基因公司；所述的瓊脂糖 凝膠電泳使用DYCP-31DN電泳儀，購自北京六一儀器公司。
實施例1至實施例4中，所采用的DNA提取、PCR、酶切、連接、 轉化等基因工程基本操作方法記載于《分子克隆實驗指南第三版》中((美〕 J.薩姆布魯克等著，科學出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理 與技術》中(王關林，方宏筠著，科學出版社,1998)。<110>北京市農林科學院
<120> <210> 1 <211>848 <212>DNA
<213>玉米屬玉米(Ze緒，L.) <400> 1
cgccgtgccccgccgtcgscccgcctcsggt333CCCCtCtgctctctctctctccgtct60
cgcgcggcggggttgttccgcgggggcgctggtgtgctccggctggctgcggtgtgctgc120
cg3taggttttggcgcctgggcgccgtgctggtctccgcttggggtggcggcggcctggc180
gggtggssgccggggcggcgtgggtgssgttgttctctgstgcgatgtctcgsgggtctg240
gatgactcaattscggcccg3tgc3gttttttcttgagtttcasggttcgcggcttgagc300
ccgggacggggscgsgcsgccgtgcttggtgtaaacgtgtggtgcggtgactctsttcgt360
ggcg3tttgcgttgccstggtscttctgtct3tg3t3tta420
gcactctggctt3t3333tgcggtctgst3tggttgtacatgggtatccacgttsgttst480
ttatcgttat3C3tg3ttg3tggttctgtttsttg3tttcg3c3cgg3gt3t33tttttt540
tttt3tctcgtgstsgttstgtg3tc3ccsattcaacggt3t3gattttg600
csgctggtcatsgtsgttcsctgg33ccsggsttggttgccsgctgccsgctgcc3gcct660
3g3gctctt3tgttttggtc3gtgg3sct33C3ttttCCttstgsggcttgggsgc3ctg720
ttttctcgtttgcstgtcc3C3tgtsgstg33gtg3C3ctttttagtcas3sttggtgta780
ttstggct33cttgttctctttcgc3tcgstggc3t3g33gtcsaaggsa840
3ggtcggt848
權利要求
1. 一種玉米Zmptil基因啟動子，其特征在于是下列核苷酸序列之一A. 序列表中的SEQ ID №1；B. 與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列；C. 在高嚴謹條件下可以與序列表SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的序列。
2. 根據權利要求l所述的玉米Zm;^7基因啟動子，其特征在于 所述的SEQIDNq: l中，在自5'端第53位至第747位堿基為該序列的啟動子核心序列，在自5，端第5卯位至第594位堿基有1個TATA-box, 在自5'端第61位至第69位堿基有1個響應脫落酸ABA的motif lib序歹!j， 在自5'端第505位至第511位堿基有一個響應赤霉素的GARE-motif序列， 在自5'端第584位至第589位堿基有1個CCAAT-box是MYBHvl轉錄 因子的結合位點。
3. 根據權利要求2所述的玉米Zm/^7基因啟動子，其特征在于所 述的SEQIDNq: l中，含有與信號傳導相關的順式作用元件。
4. 根據權利要求3所述的玉米Zm內//基因啟動子，其特征在于所 述的與信號傳導相關的順式作用元件為與光應答有關的順式作用元件 ACE 、 TGG-motif、 circadian 、 I-box 、 Spl ;增強轉錄的順式作用元件 CAAT-box 、 CCAAT-box、 G-box 、 GC-motif ;胚乳表達的順式作用元 件Skn-l-motif、 GCN4-motif;參與玉米醇溶蛋白代謝相關的順式作用元 件02-site。
5. —種表達盒，其特征在于含有權利要求1或2或3或4所述的啟動子。
6. —種表達載體，其特征在于含有權利要求1或2或3或4所述的 啟動子。
7. —種細胞系，其特征在于含有權利要求1或2或3或4所述的啟 動子。
8. —種宿主菌，其特征在于含有權利要求1或2或3或4所述的啟動子。
9. 一種引物對，其特征在于含有權利要求1或2或3或4所述的啟 動子的任一片段。
10. —種玉米Zm;^7基因啟動子的應用，其特征在于將根據權利要 求1或2或3或4所述的基因轉入玉米中，得到抗逆性玉米。
全文摘要
本發明提供一種玉米Zmpti1基因啟動子及其應用，該啟動子序列經分析發現含有與脅迫相關的轉錄因子的結合位點，ZmPti1基因在玉米中受到該啟動子的調控，參與了逆境信號的傳導途徑。本發明構建了瞬時表達載體，該啟動子的瞬時表達的結果顯示，該啟動子是有功能的啟動子。本發明的有益效果為研究該啟動子在玉米中的轉錄調控機制以及在抗逆信號途徑中的作用，有希望將它直接應用到轉基因工程中，改良作物抗逆性狀，加快作物的育種進程。
文檔編號C12N15/29GK101475941SQ20081022759
公開日2009年7月8日 申請日期2008年11月28日 優先權日2008年11月28日
發明者吳忠義, 張秀海, 李春華, 梁宏霞, 王永勤, 黃叢林 申請人:北京市農林科學院