專利名稱：一種菌株熱應激修飾方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物定向改造技術。具體的說，涉及一種菌株熱應激修飾方法和裝置。
背景技術：
乳酸菌株的修飾是采用各種物理、化學或基因修飾等方法對菌株的某些功能特性 進行定向改造，應用于干酪制造中的菌株修飾技術主要目的是抑制乳酸菌的產酸性，同時 盡可能多的保留酶活性，使之能在干酪成熟期間加速生化降解，從而促進干酪成熟的方法。 修飾發酵劑的方法主要有熱休克、冷休克、冷凍或噴霧干燥、溶菌酶處理、溶劑處理和基因 修飾等。 菌株熱應激修飾方法是采用熱處理對乳酸菌株進行定向改造的一種物理方法。篩 選后的乳酸菌株經熱應激修飾后(稱作atte皿atedstarter)，菌株的產酸性能受到一定程 度的抑制，同時盡可能多的保留酶活力，與干酪加工所用發酵劑一起加入到干酪原料奶中， 熱應激修飾菌株不影響干酪的制作工藝和最終產品的理化指標，但能夠加速干酪蛋白、脂 肪的水解，從而縮短干酪成熟時間。與其它修飾方法相比，此方法采用物理熱激方法處理可 食用性乳酸菌，具有安全性；同時在干酪中使用時操作簡便，不需要增添額外的設備，可實 現批量連續式處理，是一種實用性很強的促干酪成熟的方法。 目前采用熱應激的方法主要通過兩種方式進行一是置換法，將篩選后的 菌株在預先加熱的一部分基液中保溫一定時間實現熱激，再加入另一部分基液使 熱激過程結束，即通過熱、冷基液的置換完成熱激處理(Frey. J.P. ， et a1，1986. Heat—and freeze—shocking cause changes inp印tidase and protease activity of Lactobacillus helveticus. Milchwissenschaft， 41 (11) :681—685)。這禾中方法在實際操 作時，菌液需用至少10倍于其體積(或重量)的基液進行相交換，所用基液量大、操作不方 便，而且在大批量處理時，往往會出現熱處理溫度不準確的情況，使熱應激效果具有極大的 不穩定性。 二是通過特殊熱交換器進行，將篩選后的菌株直接通過特定熱交換設備而完成 熱激處理(Asensio. C. ， et al， 1995， Effect of heat treatmenton the proteolytic activity of mesophilic bacteria isolated from goat'smilk cheese,21 :25—30)。這禾中 方法不必使用大量的基液進行熱處理，操作方便、效果穩定，但由于必須使用特定的設備， 分批處理菌液，其設備和生產成本較高，限制了實際應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡便、效果穩定、可連續批量進行熱應激菌株處理 的熱應激修飾方法。 本發明還提供一種進行菌株熱應激處理的組合裝置。
本發明采用組合設備的熱應激修飾方法，包括
1)菌株的活化；
2)菌株高密度培養； 3)菌株熱激處理熱處理溫度50 80°C ，熱處理時間5秒 100秒。 在進行熱應激修飾前，乳酸菌株一般需要進行活化和高密度培養，使菌體密度達
到108 10 fu/ml。具體的說，以篩選后的菌株為原始菌株，經活化培養后恢復菌株活力；
經優化試驗確定菌體增殖培養條件，然后采用化學中和法對菌體進行高密度培養，以獲得
高密度的菌株懸液；之后采用加料泵、加熱設備、冷卻設備和不銹鋼盤管進行熱應激處理。 先選擇菌株，菌株的活化條件如下 菌株原始菌株凍干菌粉 活化培養基8 % 15 %的脫脂奶培養基 活化培養溫度25 45 。C 活化培養時間2小時 72小時 菌株經活化，活力恢復后進行高密度培養，培養條件如下 脫脂奶培養基的配方8% 15%脫脂奶，酵母提取物0. 1% 3.0%，蛋白胨
0. 1% 3. 0%， CaC03 0. 1% 3. 0%，乳糖0. 1% 3. 0%， K2HP040 . 05% 5. 00%。
培養設備全自動培養生化反應器 培養溫度25 45。C 培養時間8小時 72小時 轉速100 600rpm pH值4.8 6.8 菌體密度108 1010cfu/ml 然后經無菌收集后，離心處理(2000 10000g，5 60分鐘)，洗滌后收獲菌泥，再 進行熱激處理 設備蠕動泵、精密水浴鍋、不銹鋼盤管、冰浴鍋；
熱處理溫度50 80°C ;
熱處理時間5秒 100秒。 本發明涉及的熱激處理方法可廣泛用于各種乳酸菌株，如嗜酸性乳酸菌 (Xactobacillus acibophilus)、 比菲德氏菌(Bif idobacteriumbidus)、乳鏈球菌 (Str印tococcus lactis)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、干酪乳桿菌 (Xactobacillus casei subsp)、長雙叉桿菌(Bifidobacterium longum)、瑞士乳桿菌 (Lactobacillus helveticus)等，優選瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)。
本發明提供的進行菌株熱應激處理的組合裝置，包括
1)加料泵通過管道與不銹鋼盤管1相連，控制進料速度；
2)加熱裝置加熱不銹鋼盤管1 ; 3)不銹鋼盤管1 :通過管道與不銹鋼盤管2相連，用于菌株的熱處理；
4)冷卻裝置冷卻不銹鋼盤管2 ;
5)不銹鋼盤管2 :用于菌株的冷卻。 其中加料泵可選用蠕動泵，加熱裝置和冷卻裝置可分別選擇水浴鍋和冰浴鍋，連 接用管道可選擇塑料管。其連接方式見圖l，管道一端連接待處理菌懸液，另一端連接蠕動泵進口，蠕動泵出口通過管道與不銹鋼盤管1的進口相連(該不銹鋼管置于精密水浴鍋 內)，不銹鋼管1的出口與不銹鋼盤管2通過管道相連(該不銹鋼管置于冰浴鍋內)，不銹 鋼盤管2的出口即為出料孔。所用管道可以是各種本領域內常用的管道，優選塑料管。
不銹鋼盤管1和2為不銹鋼管制成，將不銹鋼管旋轉盤成5 20圈成同心盤管 狀，進口與出口處分別為兩根豎管，與盤形管制成一體。不銹鋼管的內徑為3-10mm，外徑為 4-12mm，優選管外徑為6mm，管內徑為5mm的不銹鋼管。 本發明的熱應激處理乳酸菌株的方法不需要大量基液，操作簡便、效果穩定，不需 要使用特定設備。通過自制熱激套管配以輔助設備，就可以實現連續批量熱激處理。本發 明的熱激處理與菌株的活化、高密度增菌培養聯用，可形成一系列生產工藝，廣泛用于各種 菌株同樣目的的處理，開創了國內自主創新物理改造菌株加速干酪成熟的先河。
圖1為菌株熱激處理示意圖，圖中1、塑料管；2、蠕動泵；3、精密水浴鍋；4、冰浴 鍋；5、不銹鋼盤管1 ;6、不銹鋼盤管2。
圖2為不銹鋼盤管示意圖，圖中，1、進口 ；2、出口 ；3、固定夾板；4、不銹鋼盤管。
圖3為菌株處理流程圖。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1 以篩選后的瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)(中國微生物菌種保藏中 心)為原始菌株，經活化培養后恢復菌株活力。經優化試驗確定菌體增殖培養條件，然后采 用化學中和法對菌體進行高密度培養，以獲得高密度的菌懸液。之后采用蠕動泵、循環式精 密水浴鍋、冰浴進行熱應激處理，最后收集保存，具體步驟見圖3 。
菌株瑞士乳桿菌凍干菌粉
活化培養基12%的脫脂奶培養基
活化培養溫度3(TC
活化培養時間12小時 菌株經活化，活力恢復后進行高密度培養。并經無菌收集后，離心處理、洗滌后收 獲菌泥。 培養基配方12%脫脂奶，酵母提取物1.5%，蛋白胨1.5%， &0)32.0%，乳糖 1. 0%， K2HP04 0. 1%。
培養設備全自動培養生化反應器 培養溫度30。C ; 培養時間24小時； 轉速200rpm ; pH值5. 6; 菌體密度108 10 fu/ml 。 然后經無菌收集后，離心處理(5000g，30分鐘)，洗滌后收獲菌泥，再利用本發明
5提出的熱激處理設備進行熱激處理 設備蠕動泵、精密水浴鍋、不銹鋼盤管l(內徑為3mm，外徑為4mm，不銹鋼管旋轉
盤成15圈)、不銹鋼盤管2(內徑為5mm，外徑為6mm，不銹鋼管旋轉盤成20圈)冰浴鍋； 熱處理溫度55°C ; 熱處理時間30秒。 熱激處理完畢，無菌收集菌泥，備用。 實施例2 以篩選后的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei subsp，中國微生物菌種保藏中 心)為原始菌株，進行活化、高密培養和熱激處理，實驗條件如下菌株干酪乳桿菌凍干菌 粉 活化培養基8%的脫脂奶培養基
活化培養溫度25°C
活化培養時間2天 菌株經活化，活力恢復后進行高密度培養。并經無菌收集后，離心處理、洗滌后收 獲菌泥。 培養基配方8%脫脂奶，酵母提取物0. 1%，蛋白胨O. 1%， CaC030. 1 %，乳糖 0.1%， K2HP04 0.1%。
培養設備全自動培養生化反應器 培養溫度25"; 培養時間72小時； 轉速400rpm ; pH值6.2; 菌體密度108 10 fu/ml 。 然后經無菌收集后，離心處理(10000g， 15分鐘)，洗滌后收獲菌泥，再進行熱激處 理 設備蠕動泵、精密水浴鍋、不銹鋼盤管l(內徑為5mm，外徑為6mm，不銹鋼管旋轉
盤成20圈)、不銹鋼盤管2(內徑為5mm，外徑為6mm，不銹鋼管旋轉盤成20圈)冰浴鍋； 熱處理溫度7(TC ; 熱處理時間80秒。 熱激處理完畢，無菌收集菌泥，備用。
權利要求
一種菌株熱應激修飾方法，包括以下步驟1)高密度培養菌株；2)熱激處理菌株熱處理溫度50～80℃，時間5秒～100秒。
2. 如權利要求1所述的修飾方法，其特征在于，步驟1)之前還包括菌株的活化。
3. 如權利要求1所述的修飾方法，其特征在于所述高密度培養菌株所用的培養基為 脫脂奶培養基，其配方為8% 15%脫脂奶，酵母提取物0. 1% 3.0%，蛋白胨0. 1% 3.0%，CaC03 0. 1% 3. 0%，乳糖0. 1% 3. 0%， K2HP04 0 . 05% 5. 00% ;培養溫度為 25 45°C ;培養時間為8小時 72小時。
4. 如權利要求2所述的修飾方法，其特征在于所述菌株活化所用的活化培養基為權利 要求3所述的脫脂奶培養基；活化培養溫度為25 45°C ;活化培養時間為2 72小時。
5. 如權利要求l-4任一所述的修飾方法，其特征在于，所述菌株為瑞士乳桿菌或干酪 乳桿菌。
6. —種菌株熱應激修飾裝置，包括1) 加料泵(2):通過管道(1)與不銹鋼盤管管1(5)相連，控制進料速度；2) 加熱裝置(3):加熱不銹鋼盤管1(5);3) 不銹鋼盤管1(5):通過管道(1)與不銹鋼盤管2(6)相連，用于菌株的熱處理；4) 冷卻裝置(4):冷卻不銹鋼盤管2(6);5) 不銹鋼盤管(2):用于菌株的冷卻。
7. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于所述加料泵為蠕動泵。
8. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述加熱裝置為水浴鍋。
9. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述冷卻裝置為冰浴鍋。
10. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于，不銹鋼盤管(1)和(2)采用的不銹鋼管的 內徑為3-10mm，外徑為4-12mm。
全文摘要
本發明涉及一種菌株熱應激修飾方法和裝置。本發明的熱應激修飾方法不需要大量基液，操作簡便，效果穩定，得到的熱激乳酸菌可加速干酪成熟。本發明不需要使用特定設備，利用常見的實驗設備加料泵、加熱裝置、不銹鋼套管、冷卻裝置，組合成可連續批量熱應激修飾各種乳酸菌株的裝置，降低了設備投資和生產成本。
文檔編號C12R1/225GK101735965SQ20081022747
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月26日 優先權日2008年11月26日
發明者陳歷俊, 隋欣 申請人:北京三元食品股份有限公司