Hpv融合蛋白、基因、載體、菌株、制備方法及用途的制作方法

專利名稱：Hpv融合蛋白、基因、載體、菌株、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種人乳頭瘤病毒(HPV) 16 型L2E7融合蛋白、其編碼基因、質(zhì)粒載體、表達(dá)菌株、制備方法及其免疫預(yù)防和治療用途。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)資料表明，子宮頸癌在全球婦女癌癥死亡率中排列第二，在一 些發(fā)展中國(guó)家甚至居首位。每年大約有50萬(wàn)新發(fā)宮頸癌病例，約20萬(wàn)人死于宮頸癌[1—3]， 其中80%在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)是宮頸癌高發(fā)國(guó)之一，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)我國(guó)宮頸癌年發(fā)病率約 13.8萬(wàn)人，每年死于宮頸癌的患者約5萬(wàn)人。已有研究資料證明高危人乳頭瘤病毒(HPV) 感染和子宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)，90%以上的宮頸癌以及癌前病變，鱗狀上皮病變組織中可 檢測(cè)到HPV DNA，是宮頸癌的重要致病因子。由于剛在美國(guó)上市的HPV預(yù)防性疫苗價(jià)格昂貴 及倫理問(wèn)題，目前臨床仍無(wú)廣泛預(yù)防HPV感染的措施，而現(xiàn)行的早期宮頸粘膜涂片篩查可 實(shí)現(xiàn)宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)，能降低癌癥死亡率，但并不能消除HPV感染，且費(fèi)用高，在不發(fā)達(dá) 國(guó)家難以普及。此外，目前對(duì)中晚期宮頸癌的化療和手術(shù)治療效果仍不理想，復(fù)發(fā)率較高且 花費(fèi)較大。因此，研制特異性的免疫治療方法即疫苗接種的辦法預(yù)防和治療HPV的慢性感 染及其所引起的癌前病變成惡性病變是迫在眉睫的任務(wù)，如果研究成功其將成為預(yù)防和治 療宮頸癌的重要手段，尤其在發(fā)展中國(guó)家應(yīng)更不失為一條經(jīng)濟(jì)有效的途徑。
由于HPV在體外難于培養(yǎng)和其致癌性，完整的病毒顆粒不大可能發(fā)展為疫苗，只 能研制基因工程疫苗。近十幾年來(lái)，HPV疫苗研究可以分為兩種類型預(yù)防性疫苗和治療性 疫苗。預(yù)防性疫苗一般以HPV16主要衣殼蛋白Ll和次要衣殼蛋白L2為靶抗原作用在于誘 發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體和有效的局部免疫反應(yīng)以阻止建立HPV的長(zhǎng)期感染和再感 染。HPV的衣殼蛋白在真核以及原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，能自我裝配或體外包裝折疊成病毒 樣顆粒(VLP)，其結(jié)構(gòu)和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似「4—9]。 VLP能與細(xì)胞受體結(jié)合 進(jìn)入細(xì)胞，這樣有利于抗原的加工呈遞，誘發(fā)強(qiáng)的細(xì)胞免疫。治療性疫苗通常是以經(jīng)修飾后 去除其轉(zhuǎn)化活性但仍保留其抗原性的HPV16早期蛋白作為靶抗原，誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫 反應(yīng)用于控制或消除感染HPV的良性和惡性病灶，可作為該類疾病的手術(shù)后輔助治療。在 大多數(shù)HPV16相關(guān)宮頸癌及其癌前病變中，HPV16的E6和E7蛋白是持續(xù)表達(dá)的，而這種持 續(xù)表達(dá)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和維持惡性特征所必需的，宮頸癌細(xì)胞不可能通過(guò)抗原丟失來(lái)逃避 免疫監(jiān)視，并且正常組織中不存在這兩種蛋白，因此E6和E7蛋白成為HPV16相關(guān)宮頸癌及 癌前病變治療性疫苗的理想靶抗原。中晚期癌癥病人手術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞可采用這種治 療性疫苗接種，激發(fā)細(xì)胞免疫來(lái)殺傷清除這些腫瘤細(xì)胞和已感染的上皮細(xì)胞，從而防止或 限制腫瘤的復(fù)發(fā)和擴(kuò)散。預(yù)防性和治療性這兩類疫苗劃分不是絕對(duì)的，如在良性疣和輕度 CIN病變中存在HPV晚期蛋白的表達(dá)，預(yù)防性疫苗對(duì)這些疾病也有一定治療作用，近年研制 的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等同時(shí)具備預(yù)防和治療雙重作。有些研究是將 HPV衣殼蛋白與早期蛋白融合在一起，目的是為了同時(shí)提供預(yù)防和治療兩種效果。
近幾年大量的研究資料表明[9]， L2次要晚期蛋白能誘發(fā)中和抗體，而且具有一定的交叉保護(hù)活性。

發(fā)明內(nèi)容
下面詳細(xì)討論本發(fā)明各種技術(shù)方案的制備和使用，但應(yīng)該理解，本發(fā)明提供了許 多適用的發(fā)明構(gòu)思，其可以體現(xiàn)在各種各樣的具體方面上。 為有助于理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語(yǔ)。本文定義的術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語(yǔ)可用于說(shuō)明的具體實(shí)例的一般類別，但它們的使 用不限制本發(fā)明，權(quán)利要求中所概括的除外。 除非另外指出，本文所述的"HPV"是指人乳頭瘤病毒(H咖anpapillomavirus);
除非另外指出，本文所述的"bp"是指堿基對(duì)(base pair); 除非另外指出，本文所述的"ELISPOT"是指酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme-linked imm皿ospot); 除非另外指出，本文所述的"IPTG"是指異丙基硫代-13 -D半乳糖苷(Isopropylt hio_0 _D_galactoside); 除非另外指出，本文所述的"SDS-PAGE"是指十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis);
除非另外指出，本文所述的"HRP"是指辣根過(guò)氧化物酶 (Horseradishperoxidase); 除非另外指出，本文所述的"IFN-Y "是指Y-干擾素(Interfern gamma);
除非另外指出，本文所述的"PBS"是指磷酸鹽緩沖液(Phosphate bufferedsaline) 5 本發(fā)明旨在提供一種能簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的制備人類乳頭瘤病毒HPV16L2E7融合 蛋白的優(yōu)化基因核苷酸序列，該優(yōu)化基因能在大腸桿菌中獲得大量表達(dá)，表達(dá)蛋白能用于 HPV16感染和相關(guān)宮頸癌的預(yù)防和治療。 具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋 白。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種用于前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋 白的DNA序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體。本發(fā)明的另 一個(gè)目的在于，提供一種用于生產(chǎn)前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的大腸桿 菌菌株。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種制備前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融 合蛋白的方法。 針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案 —方面，本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒(HPV)16型L2和E7的融合蛋白，所述融合 蛋白的氨基酸序列為SQE ID N0.2所示的序列。 另一方面，本發(fā)明提供一種用于前述的人乳頭瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白的 DNA序列，所述DNA序列的核苷酸序列為SQE ID NO. 1所示的序列。 再一方面，本發(fā)明提供一種大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體，所述的質(zhì)粒載體是由前述的 HPV16的L2和E7基因片段插入至質(zhì)粒pET9a的Ndel和BamHI位點(diǎn)之間來(lái)構(gòu)建的。
優(yōu)選地，前述大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體中，所述的大腸桿菌是BL21 (DE3)。
又一方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型的L2E7融合
4蛋白的大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌株含有前述的質(zhì)粒載體。
優(yōu)選地，前述的大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)。 還一方面，本發(fā)明提供一種制備前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的 方法，所述方法包括以下步驟 1)將前述的HPV16L2E7基因片段插入大腸桿菌表達(dá)載體pET9a的Ndel和BamHI 位點(diǎn)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含有pET9al6L2E7的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
2)表達(dá)菌體經(jīng)離心裂解后，收獲包涵體，用6M尿素懸起，離心，取上清用CM柱純化 表達(dá)蛋白。 優(yōu)選地，在本發(fā)明制備前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的方法中， 所述的大腸桿菌是BL21。 另一方面，本發(fā)明提供一種制備用于治療人乳頭瘤病毒16型感染及其相關(guān)疾病 (如宮頸癌)藥物的方法，所述方法包括，將含有pET9al6L2E7的大腸桿菌菌株用于中試發(fā) 酵生產(chǎn)L2E7融合蛋白。 另一方面，本發(fā)明提供前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白、前述的人 乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的DNA序列、前述的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體或前述的 大腸桿菌菌株在制備用于治療人乳頭瘤病毒16型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)的藥物 中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的藥物為疫苗；最優(yōu)選地，所述的疫苗具備預(yù)防和治療雙重作用。
下面根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，結(jié)合說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn) 行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明 本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，首先將分離測(cè)序獲得的HPV16早期蛋白E7與晚期蛋 白L2的多肽序列融合，根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子及mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)綜合分析，設(shè)計(jì)出編碼 HPV16L2E7融合蛋白多肽的核苷酸序列，經(jīng)公司合成后，將其插入原核表達(dá)載體pET9a，改 造基因獲得高效表達(dá)，表達(dá)水平占全菌的50%，表達(dá)蛋白經(jīng)純化后免疫小鼠，用動(dòng)物免疫實(shí) 驗(yàn)評(píng)價(jià)合成基因表達(dá)蛋白的免疫原性。 本發(fā)明根據(jù)優(yōu)化密碼子的基因序列來(lái)生產(chǎn)乳頭瘤病毒16型L2E7融合蛋白的方法 包括以下步驟 將設(shè)計(jì)的密碼子優(yōu)化HPV16L2E7基因片段插入大腸桿菌表達(dá)載體pET9a的Ndel 和BamHI位點(diǎn)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含有pET9al6L2E7的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo) 表達(dá)； 表達(dá)菌體經(jīng)離心裂解后，收獲包涵體，用6M尿素懸起，離心，取上清用CM柱純化表 達(dá)蛋白。 優(yōu)選地，在本發(fā)明生產(chǎn)HPV16L2E7融合蛋白的方法中，所述的大腸桿菌是 BL21(DE3) (BL21(DE3)是常用的大腸桿菌表達(dá)菌株， 一般配合以強(qiáng)表達(dá)載體來(lái)進(jìn)行目的基 因的強(qiáng)表達(dá))。 本發(fā)明的含有重組質(zhì)粒pET9al6L2E7的大腸桿菌菌株能用于中試發(fā)酵生產(chǎn)L2E7 融合蛋白，研制治療人乳頭瘤病毒16型感染和與此感染相關(guān)的疾病(如宮頸癌)藥物。
眾所周知，同一種氨基酸有幾組密碼子，生物學(xué)上將幾組密碼子代表一種氨基酸 的現(xiàn)象稱為密碼子的簡(jiǎn)并性，而簡(jiǎn)并性主要是由于密碼子的第三個(gè)堿基發(fā)生擺動(dòng)現(xiàn)象形成 的，也就是說(shuō)密碼子的專一性主要由前兩個(gè)堿基決定，即使第三個(gè)堿基發(fā)生突變也能翻譯出正確的氨基酸，這對(duì)于保證物種的穩(wěn)定性有一定意義；例如GCU， GCC， GCA， GCG均代表丙氨酸。除色氨酸和甲硫氨酸外，其他氨基酸的密碼子均多于l個(gè)(2 6個(gè))。簡(jiǎn)并性并不意味著密碼不完善，每個(gè)密碼子只對(duì)應(yīng)1種氨基酸。簡(jiǎn)并性可使突變的有害影響減到最小。大部分密碼子具有簡(jiǎn)并性，即兩個(gè)或者多個(gè)密碼子編碼同一氨基酸。簡(jiǎn)并的密碼子通常只有第三位堿基不同，例如，GAA和GAG都編碼谷氨酰胺。如果不管密碼子的第三位為哪種核苷酸，都編碼同一種氨基酸，則稱之為四重簡(jiǎn)并；如果第三位有四種可能的核苷酸之中的兩種，而且編碼同一種氨基酸，則稱之為二重簡(jiǎn)并， 一般第三位上兩種等價(jià)的核苷酸同為嘌呤(A/G)或者嘧啶(C/T)。只有兩種氨基酸僅由一個(gè)密碼子編碼，一個(gè)是甲硫氨酸，由AUG編碼，同時(shí)也是起始密碼子；另一個(gè)是色氨酸，由UGG編碼。遺傳密碼的這些性質(zhì)可使基因更加耐受點(diǎn)突變。例如，四重簡(jiǎn)并密碼子可以容忍密碼子第三位的任何變異；二重簡(jiǎn)并密碼子使三分之一可能的第三位的變異不影響蛋白質(zhì)序列。由于轉(zhuǎn)換變異(嘌呤變?yōu)猷堰驶蛘哙奏ぷ優(yōu)猷奏?比顛換變異(嘌呤變?yōu)猷奏せ蛘哙奏ぷ優(yōu)猷堰?的可能性更大，因此二重簡(jiǎn)并密碼子也具有很強(qiáng)的對(duì)抗突變的能力。遺傳學(xué)上將基因的這種不影響氨基酸序列的突變稱為沉默突變。然而，在特定的表達(dá)菌株中，在不改變蛋白的氨基酸序列的前提下，使用不同的密碼子對(duì)編碼蛋白的產(chǎn)量有著非常顯著的影響。因此，從多種密碼子中選擇特定的密碼子以獲得較高蛋白產(chǎn)量稱為"密碼子優(yōu)化"。對(duì)于分子量較大，即組成的氨基酸數(shù)目較多的蛋白而言，尋找及確定密碼子優(yōu)化的核苷酸序列是具有相當(dāng)難度的。
本發(fā)明人選擇將分離的HPV16早期蛋白E7與晚期蛋白L2的多肽序列融合，根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子，設(shè)計(jì)出編碼HPV16L2E7融合蛋白的核苷酸序列，并根據(jù)設(shè)計(jì)序列合成后，將其插入原核表達(dá)載體pET9a，改造基因獲得高效表達(dá)，表達(dá)水平占全菌的約50 % ，并進(jìn)行了該蛋白的純化，免疫動(dòng)物后，結(jié)果表明該蛋白具有較好的免疫源性，同未經(jīng)優(yōu)化基因表達(dá)的L2E7融合蛋白具有相同的免疫原性，經(jīng)ELISP0T檢測(cè)免疫后的小鼠可產(chǎn)生針對(duì)HPV16E749—57CTL表位肽特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，且能夠保護(hù)部分C57BL/C小鼠抵抗TC-1腫瘤細(xì)胞的攻擊，成瘤時(shí)間明顯推遲。本發(fā)明可用于研發(fā)預(yù)防和治療性宮頸癌疫苗。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的明顯優(yōu)點(diǎn) 使用本發(fā)明的優(yōu)化基因能夠獲得高效表達(dá)，表達(dá)水平占全菌的50%，表達(dá)蛋白經(jīng)純化后免疫小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白與未經(jīng)優(yōu)化基因表達(dá)的蛋白具有相同的免疫原性，可產(chǎn)生針對(duì)HPV16E749—57CTL表位肽特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，腫瘤生長(zhǎng)抑制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明蛋白免疫對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，其中90%小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)完全抑制。該優(yōu)化基因建立的L2E7融合蛋白原核高效表達(dá)系統(tǒng)能用于HPV16感染和相關(guān)宮頸癌的預(yù)防和治療疫苗的中試生產(chǎn)及新藥研發(fā)。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例，其中 圖1為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的方法構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18sL2E7的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。
圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的方法構(gòu)建的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET9asL2E7的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。 圖3為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4的進(jìn)行的密碼子優(yōu)化基因sL2E7在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE凝膠分析的結(jié)果；其中，1為Marker, 2為優(yōu)化基因表達(dá)產(chǎn)物，3為未優(yōu)化基因(編碼同一蛋白的其他基因)的表達(dá)產(chǎn)物，4為空載體對(duì)照。 圖4為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5進(jìn)行的密碼子優(yōu)化基因sL2E7在大腸桿菌中表達(dá)蛋白的Western-blot鑒定結(jié)果；其中，1為載體對(duì)照，2為優(yōu)化基因表達(dá)的裂解液，3為Marker。
圖5為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例6進(jìn)行的密碼子優(yōu)化基因sL2E7在原核系統(tǒng)表達(dá)經(jīng)凝膠層析純化后的SDS-PAGE凝膠分析的結(jié)果，其中，1為Marker ;2為經(jīng)純化的L2E7蛋白。
圖6為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7進(jìn)行的優(yōu)化基因表達(dá)蛋白經(jīng)純化，免疫小鼠后的抗體滴度檢測(cè)的結(jié)果。 圖7為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7進(jìn)行的密碼子優(yōu)化基因sL2E7表達(dá)蛋白免疫小鼠后酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果。 圖8為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7進(jìn)行的密碼子優(yōu)化基因sL2E7表達(dá)蛋白對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。 實(shí)施例1 :設(shè)i十并合成人乳頭瘤病毒16型L2E7融合蛋白大腸桿菌表汰的優(yōu)化密石好細(xì) 將從宮頸癌病人標(biāo)本中分離克隆的HPV16晚期基因L2和早期基因E7測(cè)序，根據(jù)
獲得的HPV16晚期基因L2和早期基因E7的編碼的多肽氨基酸序列，并將E7蛋白與pRB結(jié)
合位點(diǎn)的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸第24位半胱氨酸和第26位谷氨酸的密碼子分別突變?yōu)楦拾彼崦?br> 碼子GGT和GGG，以消除其腫瘤轉(zhuǎn)化活性。將HPV16病毒的次要衣殼蛋白序列L2與HPV16
病毒的E7蛋白序列組合設(shè)計(jì)為如下的融合蛋白MRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQ ILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPV RPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTSVPSIPPDVSGFSIT TSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFT LSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYS RTTQQVKVVDPAFVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFSSNDN SINIAPDPDFLDIVALHRPALTSRRTGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDLSTIDPAEEIELQTITPSTYTTTSHAASPTSINNGLY DIYADDFITDTSTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLIPIVPGSPQYTI IADAGDFYLHPSY預(yù)LRKRR KRLPYFFSDVSLAAMHGDTPTLHE預(yù)LDLQPETTDLYGYGQLN DSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP. (571個(gè)氨基酸) 利用基因簡(jiǎn)并性，在其編碼的產(chǎn)物蛋白氨基酸序列保持不變的前提下設(shè)計(jì)出優(yōu)化密碼子核苷酸序列，發(fā)明人將該序列命名為sL2E7，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證明，該適于在大腸桿菌中表達(dá)的HPV16L2E7融合蛋白，其序列具體如下
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ATGCGTCATAAACGTTCTGCGAAACGTACCAAACGTGCGAGC GCGACCCAGTTATATAAAACGTGTAAACAGGCCGGTACCTGC CCGCCGGATATTATTCCGAAAGTGGAAGGCAAAACCATTGCG GATCAGATTCTGCAGTATGGCAGCATGGGCGTGTTCTTTGGCG GCCTGGGCATTGGCACCGGCAGCGGCACCGGCGGCCGTACC GGCTATATTCCGCTGGGCACCCGTCCGCCGACCGCGACCGAT ACCCTGGCGCCGGTGCGTCCGCCGCTGACCGTTGATCCGGTG GGCCCGAGCGATCCGAGCATTGTGAGCCTGGTGGAAGAAAC CAGCTTTATTGATGCGGGCGCGCCGACCAGCGTGCCGAGCAT TCCGCCGGATGTGAGCGGCTTTAGCATTACCACCAGCACCGAT ACCACCCCGGCGATTCTGGATATTAATAATACCGTGACCACCG TGACCACCCATAATAATCCGACCTTTACCGATCCGAGCGTGCT GCAGCCGCCGACCCCGGCGGAAACCGGCGGCCATTTTACCCT GAGCAGCAGCACCATTAGCACCCATAATTATGAAGAAATTCC GATGGATACCTTTATTGTGAGCACCAATCCGAATACCGTGACC AGCAGCACCCCGATTCCGGGCAGCCGTCCGGTGGCGCGTCTG GGCCTGTATAGCCGTACCACCCAGCAGGTGAAAGTGGTTGAT CCGGCGTTTGTGACCACCCCGACCAAACTGATTACCTATGATA ATCCGGCGTATGAAGGCATTGATGTGGATAATACCCTGTATTTT AGCAGCAATGATAATAGCATTAATATTGCGCCGGACCCGGATT TTCTGGATATTGTGGCGCTGCATCGTCCGGCGCTGACCAGCCG TCGTACCGGCATTCGTTATAGCCGTATTGGCAATAAACAGACC CTGCGTACCCGTAGCGGCAAAAGCATTGGCGCGAAAGTGCAT TATTATTATGATCTGAGCACCATTGATCCGGCGGAAGAAATTG AACTGCAGACCATTACCCCGAGCACCTATACCACCACCAGCC ATGCGGCGAGCCCGACCAGCATTAATAATGGCCTGTATGATAT TTATGCGGATGATTTTATTACCGATACCAGCACCACCCCGGTA CCGAGCGTGCCGAGCACCAGCCTGAGCGGCTATATTCCGGCG AATACCACCATTCCGTTTGGCGGCGCGTATAATATTCCGCTGG TGAGCGGCCCGGATATTCCGATTAATATTACCGATCAGGCGCC GAGCCTGATTCCGATTGTGCCGGGCAGCCCGCAGTATACCATT ATTGCGGATGCGGGCGATTTCTATCTGCATCCGAGCTATTATAT GCTGCGTAAACGTCGTAAACGTCTGCCGTATTTCTTTAGCGAT GTGAGCCTGGCGGCGATGCATGGCGATACCCCGACCCTGCAT GAATATATGCTGGATCTGCAGCCGGAAACCACCGATCTGTATG GCTATGGCCAGCTGAATGATAGCAGCGAAGAAGAAGATGAAA TTGATGGCCCGGCGGGCCAGGCGGAACCGGATCGTGCGCATT ATAATATTGTGACCTTTTGCTGCAAATGCGATAGCACCCTGCG TCTGTGCGTGCAGAGCACCCATGTGGATATTCGTACCCTGGA
AGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATTGTGTGCCCGATTTGC
AGCCAGAAACCGTAA(1716bp)
實(shí)施例2 : 將上述sL2E7核苷酸序列送基因合成公司合成，并由公司將其克隆于pUC18中，獲
得合成基因的重組克隆質(zhì)粒pUC18sL2E7，該重組克隆質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。 本實(shí)施例中所使用的pUC18為可商購(gòu)獲得的質(zhì)粒載體，其具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)文獻(xiàn)薩姆
布魯克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.1992.第二版(北京)科學(xué)出版
社第9頁(yè)。實(shí)施例3 : 將合成并克隆的L2E7優(yōu)化基因用酶切消化，所述酶切消化的操作如下先用NdeI酶37t:水浴消化2小時(shí)，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，再BamH I酶37。C水浴消化2小時(shí)，最后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收片段，所使用的Nde I和BamH I酶均為Biolabs公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京北方儀濤商貿(mào)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品，然后將其插入大腸桿菌表達(dá)載體pET9a的Nde I和BamH I位點(diǎn)，經(jīng)Nde I和BamH I酶切鑒定并測(cè)序篩選獲得有正確插入的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET9asL2E7，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖如圖2所示。所使用的pET9a為可商購(gòu)獲得的表達(dá)質(zhì)粒載體，為Novagen公司產(chǎn)品，購(gòu)自華美生物工程公司北京分公司。
實(shí)施例4 : 使用實(shí)施例3獲得的重組質(zhì)粒pET9asL2E7轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)大腸桿菌，涂平皿后，37t:過(guò)夜培養(yǎng)。挑單斑在LB培養(yǎng)基(已知培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.1992.第二版(北京)科學(xué)出版社第908頁(yè))中培養(yǎng)，當(dāng)0D = 0. 6，加入終濃度為0. 4mM的IPTG(為Promega公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)誘導(dǎo)表達(dá)二小時(shí)，取適量菌體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，在分子量約90KD處有一新增蛋白帶，該蛋白帶約占全菌蛋白總產(chǎn)量的50% ，電泳結(jié)果如圖3所示。由此可見(jiàn)，優(yōu)化基因比未優(yōu)化基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平提高了近三倍。 實(shí)施例5 :HPV16sL2E7優(yōu)化基因原核表達(dá)的Western-blot檢測(cè) 取實(shí)施例4獲得的誘導(dǎo)表達(dá)菌液200iil，離心收獲菌體，重懸于lOOiU的
SDS-PAGE加樣緩沖液(已知緩沖液，該緩沖液的具體配方、配制方法見(jiàn)薩姆布魯克J，弗里
奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.1992.第二版(北京)科學(xué)出版社笫935頁(yè))
混勻，IO(TC加熱3分鐘。離心后取5-10 iil上樣于10%的SDS-PAGE膠，進(jìn)行電泳，然后電
轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。 使用抗HPV16L2自制豚鼠多抗和抗HPV16E7的單抗(抗HPV16L2自制豚鼠多抗，用HPV16L2原核系統(tǒng)表達(dá)并純化的蛋白加弗氏佐劑，皮下多點(diǎn)注射免疫豚鼠，免疫兩次后心臟采血，離心取血清。抗HPV16E7的單抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京北方儀濤商貿(mào)有限公司)作為第一抗體； 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的蛋白A/G(購(gòu)自北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司)為與抗HPV16L2豚鼠多抗反應(yīng)的第二抗體； 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，為與抗HPV16E7的單抗反應(yīng)的第二抗體，購(gòu)自
9北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，進(jìn)行目的蛋白表達(dá)的特異性鑒定。結(jié)果表明，由優(yōu)化基因表達(dá)的L2E7融合蛋白分子量約在90KD處，與未優(yōu)化基因表達(dá)蛋白的大小相同，結(jié)果參見(jiàn)圖4，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)其氨基酸序列與前述實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的嵌合蛋白序列相符。
實(shí)施例6 :L2E7優(yōu)化某閔在大腸桿菌中的表汰和蛋白的純化 a.將實(shí)施例4獲得的菌種以1 : 1000接種于300ML2XYT培養(yǎng)基(已知培養(yǎng)基，見(jiàn)參考文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF， and曼尼阿蒂斯T，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.1992.第二版(北京):科學(xué)出版社第909頁(yè))，在37。C下振蕩培養(yǎng)至0D6。。 = 0. 8，加入IPTG (為Promega公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司)至終濃度為O. 84mM/升，在37t:下誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，收集菌體沉淀； b.將前述步驟a中收獲得到的表達(dá)菌體，溶解在lOmL裂解緩沖液(20mMTris，0. 5% TritonX-lOO， 0)中加入溶菌酶，于室溫下放置30分鐘后，在冰浴中超聲處理(200瓦12次)12秒，間隔30秒。離心(12， OOOrmp， 20分鐘，4°C )收集沉淀;
c.將前述步驟b獲得的沉淀懸浮于20mL含有1M尿素的緩沖液(20mMTris， 1摩爾/升尿素，PH8. 0)，在冰浴中超聲處理(200瓦，12次)12秒，每次間隔30秒。離心(12000rmp，20分鐘，4。C )收集沉淀； d.將前述步驟c獲得的沉淀重新懸浮于10mL含8M尿素緩沖液(20mMTris， 8摩爾/升尿素，PH8. 0)，在冰浴中超聲處理(200瓦，12次)12秒，間隔30秒。離心(12000rmp，20分鐘，4°C )，收集上清液備用。 e.離子交換層析將前述步驟d得到的上清液經(jīng)QFF離子交換柱(請(qǐng)確定該交換柱的全稱、并提供其現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)出處或商購(gòu)?fù)緩?和SP柱(請(qǐng)確定該交換柱的全稱、并提供其現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)出處或商購(gòu)?fù)緩?純化得到目的蛋白，純度達(dá)95%以上，所得純化蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖5。
QFF:Q S印harose" Fast Flow,
SP:SP S印harose" Fast Flow 均為Amersham Biosciences (安瑪西亞)公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司 將回收蛋白經(jīng)透析袋(購(gòu)自華美生物工程公司北京分公司，規(guī)格匿-49，孔徑為12-14KD)透析，最后透析至磷酸緩沖鹽溶液(PBS，其配方見(jiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.1992.第二版(北京)科學(xué)出版社第927頁(yè))中儲(chǔ)存供免疫動(dòng)物使用。 實(shí)施例7 :L2E7融合蛋白動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn) a. L2E7融合蛋白免疫小鼠后血清特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè) 使用由前述實(shí)施例6制備得到的L2E7融合蛋白20yg，來(lái)免疫C57BL/6小鼠
(C57BL/6小鼠，6-8周齡，雌性，購(gòu)自中國(guó)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，在SPF2級(jí)動(dòng)物房飼
養(yǎng))，二周后加強(qiáng)一針(劑量為20 ii g)，免疫結(jié)束后兩周進(jìn)行血清特異性抗體檢測(cè)和細(xì)胞免
疫檢測(cè)。 (1)特異性抗體檢測(cè)取血清，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)進(jìn)行L2抗體和E7抗體的檢測(cè)，以試劑組PBS為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。從圖6中可看出，L2E7融合蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生1 : 160000的高滴度L2抗體和1 : 14700的E7抗體。
10
(2)細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)取脾細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)方法進(jìn)行E7的第49-57位肽剌激產(chǎn)生的特異性分泌Y -IFN的效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)目檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。ELISPOT檢測(cè)是依據(jù)Miyahira等人和Murali-Krishna等人的方法(參見(jiàn)MiyahiraY， Murata K， Rodriguez D，等人Quantification of antigen specific CD8+ T cellusing an ELISPOT assay. JImm皿ol Methods, 1995， 181 (1) :45-54. Murali-Krishna K，Altman JD，Suresh M，et al. Counting antigen—speific CD8T cells :a reevaluation ofbystander activationduring viral infection. Immunity, 1998， 8 (2) : 1771-87.)，操作參見(jiàn)ELISPOT試劑盒說(shuō)明書(ELISPOT試劑盒為U-CyTech公司產(chǎn)品，購(gòu)自深圳達(dá)科維生物技術(shù)有限公司)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7，經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)確定，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組斑點(diǎn)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p< 0. 05)，說(shuō)明由優(yōu)化后的基因表達(dá)的本發(fā)明嵌合蛋白能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 b. HPV16L2E7對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用 先用1X104TC_1腫瘤細(xì)胞(TC-l腫瘤細(xì)胞系HPV16-E6、E7和ras基因轉(zhuǎn)化的C57BL/6小鼠肺上皮細(xì)胞，可穩(wěn)定表達(dá)和遞呈E7蛋白，由John Hopkins大學(xué)T. C. Wu教授饋貝曾，見(jiàn)參考文獻(xiàn)丄in KY， Guarnieri FG， Stavelev-o' Canrroll KF， et al. Treatmentof established tumor with a novelvaccine that enhance major histocompatibilityclass II presentation of tumorantigen. Cancer Res， 1996， 56 Q) :21 26)腹股溝皮下注射(注射劑量為100iU)C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠，6-8周齡，雌性，購(gòu)自中國(guó)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，在SPF2級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng))處，第二天肌肉注射20 g的L2E7融合蛋白(由前述實(shí)施例6制備得到的L2E7融合蛋白)免疫C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠，6_8周齡，雌性，購(gòu)自中國(guó)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，在SPF2級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng))10天后加強(qiáng)免疫(劑量為20 i！ g的L2E7融合蛋白)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況(每周2次)。結(jié)果表明經(jīng)蛋白免疫后對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，其中90 %小鼠TC-1腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)完全抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。 參考文獻(xiàn) 1. IARC :The Human Papillomaviruses. In :Monographs on the evaluation ofthecarcinogenic risks to humans. Eds :IARC，Lyon， (1995); 2.Munoz， N. :Human papillomavirus and cervical cancer :印idemiologicalevidence. In :New Developments in Cervical Cancer ScreeningandPrevention.Eds :E. Franco and J. Monsonego， Blackwell Science, Oxford,3-13(1997); 3.M皿oz N，Bosch FX，Castellsague Diaz M，etal. Int J Cancaer，2004 ;111 (2):278-285 ; 4.Hagensee ME， Yaegashi N， Galloway DA. S e 1 f-as s emb 1 y ofhumanp即illomavirus type 1 c即sids by expression of the LI protein alone orbycoexpression of the LI and L2 capsid proteins. J Virol. 1993Jan ;67 (1) :315-22;
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7. Nardelli-Haefliger D，Wirthner D，Schiller, JT，et al. Specific antibody levelsat the cervix during the menstrual cycle of women vaccinated with huma即即illomavirus 16 virus-like particles. J Natl Cancer Inst， 2003， 95 (15): 1128-1137 ; 8. Harro CD， Pang YY， Roden RB， et al. Safety and imm皿ogenicity trial inadult volunteers of a human papillomavirus 16 LI virus—like particle vaccine. J Natl Cancer Inst， 2001， 93 (4) :284-292;9. Roden RB， Yutzy WH， Fallon R， et al. Minor Capsid Protein of H皿am GenitalPapillomaviruses Contains Subdiminant Cross—Neutalizing Epitopes. Virology,2000，270 :254-275。
序列表
〈110〉中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 〈120〉HPV融合蛋白、基因、載體、菌株、制備方法及用途 〈130>DIC08110143 〈160>2
〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>1716 〈212>DNA
〈213〉人乳頭瘤病毒融合蛋白16L2E7 〈400>1
aacgttctgc gaaacgtacc









60
120
180
240
300
360
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ccgtttggcg gcgcgtataa tattccgctg gtgagcggcc cggatattcc gattaatatt
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ctgaatgata gcagcgaaga agaagatgaa attgatggcc cggcgggcca ggcggaaccg
13
530 535 540 Thr His Val Asp lie Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu 545 550 555 560 Gly lie Val Cys Pro lie Cys Ser Gin Lys Pro 565 570
權(quán)利要求
一種人乳頭瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列為SQE ID NO.2所示的序列。
2. —種用于編碼權(quán)利要求l所述的人乳頭瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白的DNA序 列，其特征在于，所述DNA序列的核苷酸序列為SQE ID NO. l所示的序列。
3. —種大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體，其特征在于，所述的質(zhì)粒載體是由權(quán)利要求2所述的 HPV16L2E7基因片段插入至質(zhì)粒pET9a的Ndel和BamHI位點(diǎn)之間來(lái)構(gòu)建的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體，其特征在于，所述的大腸桿菌是 BL21(DE3)。
5. —種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的大腸桿 菌菌株，其特征在于，所述大腸桿菌菌株含有權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的大腸桿菌菌株，其特征在于，所述的大腸桿菌為BL21 (DE3)。
7. —種制備權(quán)利要求l所述的人乳頭瘤病毒(HPV)16型L2E7融合蛋白的方法，其特征 在于，所述方法包括以下步驟1) 將權(quán)利要求2所述的HPV16L2E7基因片段插入大腸桿菌表達(dá)載體pET9a的Ndel和 BamHI位點(diǎn)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含有pET9al6L2E7的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表 達(dá)；2) 表達(dá)菌體經(jīng)離心裂解后，收獲包涵體，用6M尿素懸起，離心，取上清用CM柱純化表達(dá) 蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的大腸桿菌是BL21 (DE3)。
9. 一種制備用于治療人乳頭瘤病毒16型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物的方法， 其特征在于，所述方法包括，將權(quán)利要求5或6所述的大腸桿菌菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)L2E7融 合蛋白。
10. 權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白、權(quán)利要求2所述的人 乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白的DNA序列、權(quán)利要求3_4任一項(xiàng)所述的大腸桿菌表 達(dá)質(zhì)粒載體或權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的大腸桿菌菌株在制備用于治療人乳頭瘤病毒16 型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述藥物為疫苗；最優(yōu)選地， 所述疫苗同時(shí)具有為預(yù)防和治療作用。
11. 一種用于預(yù)防和治療宮頸癌的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括權(quán)利要求1所述的 人乳頭瘤病毒(HPV) 16型L2E7融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在大腸桿菌中高效表達(dá)的人乳頭瘤病毒16型L2E7重組蛋白的密碼子優(yōu)化基因，將其插入原核表達(dá)載體pET9a，優(yōu)化基因獲得高效表達(dá)，表達(dá)水平占全菌的50％，表達(dá)蛋白經(jīng)純化后免疫小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白與未經(jīng)優(yōu)化基因表達(dá)的蛋白具有相同的免疫原性，可誘發(fā)特異性的γ-INF的釋放，腫瘤生長(zhǎng)抑制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明蛋白免疫對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，其中90％小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)完全抑制。該優(yōu)化基因建立的L2E7重組蛋白原核高效表達(dá)系統(tǒng)能用于HPV16感染和相關(guān)宮頸癌的預(yù)防和治療疫苗的中試生產(chǎn)及新藥研發(fā)。
文檔編號(hào)C12P21/04GK101735310SQ20081022704
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者任皎, 張卉, 田厚文, 趙莉, 阮力, 高見(jiàn) 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所