專利名稱：一種以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜及其制備方法
技術領域：
本發明屬于電化學生物傳感器及其制備技術領域，特別是涉及一種以聚碳酸酯膜 為基體的乙醇氧化酶膜及其制備方法。
背景技術：
準確、快速地檢測乙醇的含量在食品檢測、發酵控制及臨床診斷等方面具有重要 應用價值。乙醇的分析檢測方法有多種，其中最常用的有氣相色譜法、高效液相色譜 法及分光光度法等，但這些方法多需要較昂貴的儀器設備，同時檢測步驟也較復雜。 近年來人們開始用電化學生物傳感器檢測乙醇，這種方法簡單、快速且選擇性較高。
以乙醇氧化酶為生物活性物質制備的電化學生物傳感器可用于乙醇的檢測，其工 作原理是在乙醇氧化酶的作用下，溶液中的溶解氧可以氧化乙醇生成乙醛和過氧化 氫，通過檢測溶液中溶解氧的減少量或過氧化氫的生成量可以確定待測溶液中乙醇的 含量。
由于乙醇氧化酶在使用過程中活性維持時間較短，故通常將乙醇氧化酶固定在基 體膜上實現其與電極的分離，在酶失活后可以較方便地更換酶膜，從而降低傳感器成 本。因此篩選適宜的固定基體材料和改進酶的固定化方法以保持酶的活性及提高酶的 重復利用率是乙醇氧化酶膜研究的重要內容，目前被用于乙醇氧化酶固定的膜基體材 料包括動植物膜、醋酸纖維素及其衍生物膜、聚碳酸酯膜等。
在文獻(l) Biosensors and Bioelectronics， 2007， 23:121中,Guangming Wen 等人以殼聚糖為交聯劑將乙醇氧化酶固定在蛋殼膜上，再將其固定在氧電極上制成了 檢測乙醇的電化學生物傳感器，基于溶液中氧濃度的降低檢測乙醇的濃度。研究表明 乙醇氧化酶能夠較好地固定在蛋殼膜上，所制得的生物傳感器檢測乙醇濃度的線性范 圍為60 uM 0.08 mM，檢測限為30 nM (信噪比S/^3)，響應時間為1分鐘。此電 化學生物傳感器的抗干擾性較強，且具有良好的操作及儲存穩定性，對樣品的檢測結 果與用氣相色譜法所得到的檢測結果一致。但采用蛋殼膜作為基體膜，在規模化生產 上存在較大的難度。
在文獻(2) Analytica Chimica Acta， 2002， 469:217中，Dilek Wkeliler等人 首先采用等離子體聚合技術用乙二胺對孔徑為0. 03 u m的聚碳酸酯膜進行處理使其表 面帶有氨基，然后將乙醇氧化酶固定在處理過的聚碳酸酯膜上。研究表明乙醇氧化酶 能夠較好地固定在聚碳酸酯膜基體上，基于該酶膜制備的電化學生物傳感器的靈敏度 為5. 6 nA/mM，可對2 mM以下濃度的乙醇溶液進行檢測，響應時間為50秒。對啤酒樣 品的檢測結果與啤酒制造商所給的參數基本一致。但采用等離子體聚合技術對聚碳酸 酯膜進行預處理使酶膜的制備過于復雜，另外采用較小孔徑的聚碳酸酯膜增大了傳質 阻力，不利于反應物的擴散。
發明內容
本發明的目的在于提供一種以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜及其制備方法。
聚碳酸酯膜具有良好的機械強度和耐化學腐蝕性，并且其厚度和孔徑可以在很大范圍 內進行調節，生產技術成熟，有多種不同規格的市售產品可供選擇。本發明選擇適宜 厚度和孔徑的市售聚碳酸酯膜為基體材料，采用戊二醛蒸氣交聯法將乙醇氧化酶固定 于聚碳酸酯膜表面，制成乙醇氧化酶膜，有效地保持了乙醇氧化酶的活性。基于該酶 膜制備的電化學生物傳感器可用于乙醇的檢測，并具有較短的響應時間、較高的靈敏 度、較寬的線性范圍及良好的操作穩定性與儲存穩定性等。
本發明乙醇氧化酶膜由聚碳酸酯膜基體、乙醇氧化酶及固定酶的高分子物質戊二 醛組成，其中聚碳酸酯膜的質量分數為49. 96 96. 3%，乙醇氧化酶的質量分數為3. 35 41. 7%且單位面積酶膜中乙醇氧化酶的含量為12. 7 31. 2 U/cm2，固定酶的高分子物質 戊二醛的質量分數為0. 35 8. 34%;所述聚碳酸酯膜平均孔徑范圍為O. 10 0.80 n m， 厚度范圍為5 30 ixm。
本發明以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜的制備方法是
(1) 取平均孔徑范圍為O. 10 0.80 ym，厚度為5 30 y m的市售聚碳酸酯膜裁 剪成比所使用的鉑電極橫截面直徑大2 3 mm的圓片，隨后將裁剪好的聚碳酸酯膜圓 片粘在O型橡膠圈上，晾干待用；
(2) 將粘好0型橡膠圈的聚碳酸酯膜浸入pH值為6. 0 9. 0的磷酸緩沖溶液中處 理6 12小時，然后取出，用高純氮氣吹干；
(3) 按乙醇氧化酶為12. 7 31. 2 U/cm2的用量將濃度為0. 8 1.1 U/u L的乙醇氧 化酶溶液滴涂在處理過的聚碳酸酯膜上，在0 4 。C的冰箱中干燥0.5 2小時；
(4) 將酶膜懸掛在盛有質量分數為40 60%的戊二醛水溶液的密閉容器中并在 0 4 °C的條件下交聯6 18小時；
(5) 將酶膜浸入pH值為6. 0 9. 0的磷酸緩沖液中，以洗去結合不牢固的乙醇氧 化酶，即形成以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜，保存在0 4 。C的冰箱中備用。
本發明的效果可以從使用本發明以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜制作的電化 學生物傳感器看出。將本發明的乙醇氧化酶膜用0型橡膠圈套在鉑電極頂端作為工作 電極，鉑絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，組成安培型電化學生物傳感 器。將傳感器的三電極體系置于pH值為6. 0 9. 0的磷酸緩沖溶液中，用CHI660B電 化學工作站對該生物傳感器進行電化學表征。采用i-t法測試傳感器對乙醇的響應電 流(如圖l所示)，本發明乙醇氧化酶膜對乙醇響應的靈敏度較高，響應時間短；由圖 2可以看出，本發明乙醇氧化酶膜對乙醇的線性響應范圍為0.01 2.5 ramol/L，大于 文獻(1)及文獻(2)中乙醇的線性響應范圍；對本發明乙醇氧化酶膜進行連續200次的 測試(如圖3所示)，其響應信號未見下降，，200次的測試中響應信號大小波動在5% 以內，這說明本發明以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜具有良好的操作穩定性。
本發明的優點在于在基體選擇方面，本發明對聚碳酸酯膜厚度、孔徑大小進行 了優化，選用平均孔徑范圍為O. 10 0.80 urn,厚度范圍為5 30 uro的聚碳酸酯膜， 在保證對乙醇氧化酶有效固定的前提下，有利于反應物的快速擴散，減小傳質阻力， 從而減小酶膜對底物的響應時間，實現傳感器的快速響應；在制備方法方面，本發明
的乙醇氧化酶膜制備方法簡便易行、工序較少、成本較低；在性能方面，本發明乙醇 氧化酶膜具有較短的響應時間、較高的靈敏度、較寬的線性響應范圍及良好的操作穩 定性與儲存穩定性。
圖1.本發明以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜對lmmol/L的乙醇溶液的i-t
響應曲線。其中，橫坐標一時間t (單位秒，S);縱坐標一響應電流i (單位微安，
UA)。
圖2.乙醇濃度與本發明以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜的響應電流的關系 曲線。其中，橫坐標一乙醇溶液的濃度(單位毫摩爾/升，mraol/L);縱坐標一響應 電流i (單位微安，wA)。
圖3.本發明以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜操作穩定性測試圖。其中，橫坐 標一測試次數(單位次)縱坐標一相對響應(單位％)。
圖4.本發明以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜穩定性測試前30次響應情況。 其中，橫坐標一測試次數(單位次)，縱坐標一相對響應(單位％)。
具體實施例方式
實施例1
(1) 將平均孔徑為0.45 um，厚度為IO ym的聚碳酸酯膜裁剪成直徑10mm的圓 片，隨后將裁剪好的聚碳酸酯膜粘在O型橡膠圈上，晾干待用；
(2) 將粘好0型橡膠圈的聚碳酸酯膜浸入pH值為7. 5的磷酸緩沖溶液中處理6小 時，然后取出，用高純氮氣吹干；
(3) 將5 UL濃度為1.02U/PL的乙醇氧化酶溶液滴涂在處理過的聚碳酸酯膜上， 形成直徑為5 ram的酶層圓斑，將該酶膜在4 °C的冰箱中干燥1小時；
(4) 將酶膜懸掛在盛有質量分數為50%的戊二醛水溶液的密閉容器中，并在4 °C 的冰箱中交聯12小時；
(5) 將酶膜浸入pH值為7.5的磷酸緩沖液中，以洗去結合不牢固的乙醇氧化酶， 即形成以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜，保存在4 °C的冰箱中備用。
將以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜套在鉑電極頂端作為工作電極，鉑絲電極 作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試體系為pH值7. 5的磷酸緩沖溶液，采 用CHI660B電化學工作站對以聚碳酸酯膜為基體的電化學生物傳感器進行電化學表征。 采用i-1法測試傳感器對乙醇水溶液的響應電流(如圖1所示)，得出其響應靈敏度為 4.68 uA.L/mmo1，響應時間5秒；傳感器對乙醇水溶液響應的線性范圍為0. 01 2. 5 mmol/L (如圖2所示)；連續測試200次的信號響應如圖3所示，圖4為前30次測試 的信號響應情況，從圖中可以看出，連續測試200次響應信號未見明顯下降，在200 次的測試中響應信號大小波動在5%以內；該酶膜在連續測試3個月后其響應信號仍保 持其初始響應信號的80%以上。 實施例2
(1)將平均孔徑為0.10 um，厚度為30 um的聚碳酸酯膜裁剪成直徑10mm的圓
片，隨后將裁剪好的聚碳酸酯膜粘在0型橡膠圈上，晾干待用；
(2) 將粘好0型橡膠圈的聚碳酸酯膜浸入pH值為6. 0的磷酸緩沖溶液中處理12 小時，然后取出，用高純氮氣吹干；
(3) 將8 UL濃度為1.1 U/uL的乙醇氧化酶溶液滴涂在處理過的聚碳酸酯膜上， 形成直徑為6 mm的酶層圓斑，將該酶膜在0 °C的冰箱中干燥2小時；
(4) 將酶膜懸掛在盛有質量分數為60%的戊二醛水溶液的密閉容器中，并在0。C 的冰箱中交聯18小時；
(5) 將酶膜浸入pH值為6.0的磷酸緩沖液中，以洗去結合不牢固的乙醇氧化酶， 即形成以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜，保存在O 。C的冰箱中備用。
將以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜套在鉑電極頂端作為工作電極，鉑絲電極 作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試體系為pH值6.0的磷酸緩沖溶液，釆 用CHI660B電化學工作站對以聚碳酸酯膜為基體的電化學生物傳感器進行電化學表征。 采用i-t法測試傳感器對乙醇水溶液的響應電流，得出其響應靈敏度為2.84 u A.L/mmo1，響應時間8秒；傳感器對乙醇水溶液響應的線性范圍為0. 01 2. 5 mmol/L; 該酶膜在連續測試3個月后其響應信號仍保持其初始響應信號的70%以上。 實施例3
(1) 將平均孔徑為0.80 um，厚度為20 ym的聚碳酸酯膜裁剪成直徑10咖的圓 片，隨后將裁剪好的聚碳酸酯膜粘在0型橡膠圈上，晾干待用；
(2) 將粘好0型橡膠圈的聚碳酸酯膜浸入pH值為9. 0的磷酸緩沖溶液中處理10 小時，然后取出，用高純氮氣吹干；
(3) 將2 UL濃度為0.8 U/wL的乙醇氧化酶溶液滴涂在處理過的聚碳酸酯膜上， 形成直徑為4 mm的酶層圓斑，將該酶膜在0 T的冰箱中干燥0. 5小時；
(4) 將酶膜懸掛在盛有質量分數為40%的戊二醛水溶液的密閉容器中，并在2。C 的冰箱中交聯6小時；
(5) 將酶膜浸入pH值為9.0的磷酸緩沖液中，以洗去結合不牢固的乙醇氧化酶， 即形成以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜，保存在2 。C的冰箱中備用。
將以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜套在鉑電極頂端作為工作電極，鉑絲電極 作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試體系為pH值9.0的磷酸緩沖溶液，采 用CHI660B電化學工作站對以聚碳酸酯膜為基體的電化學生物傳感器進行電化學表征。 采用i-t法測試傳感器對乙醇水溶液的響應電流，得出其響應靈敏度為1.17 uA.L/mmo1，響應時間為10秒；傳感器對乙醇水溶液響應的線性范圍為0.01 2.5 mmol/L;該酶膜在連續測試3個月后其響應信號仍保持其初始響應信號的56%以上。
權利要求
1. 一種以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜，其特征在于，由聚碳酸酯膜基體、乙醇氧化酶及固定酶的高分子物質戊二醛組成，其中聚碳酸酯膜的質量分數為49.96～96.3％，乙醇氧化酶的質量分數為3.35～41.7％且單位面積酶膜中乙醇氧化酶的含量為12.7～31.2U/cm2，固定酶的高分子物質戊二醛的質量分數為0.35～8.34％；所述聚碳酸酯膜平均孔徑范圍為0.10～0.80μm，厚度范圍為5～30μm。
2. —種制備權利要求1所述的以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜 的方法，其特征在于，工藝步驟為根據所使用的鉑電極的橫截面尺寸，將聚碳酸酯膜裁剪成比鉑電極 橫截面直徑大2 3 mm的圓片，然后將裁剪好的聚碳酸酯膜粘在O型橡 膠圈上，晾干；將粘好O型橡膠圈的聚碳酸酯膜浸入pH值為6.0 9.0 的磷酸緩沖溶液中處理6 12小時后取出，用高純氮氣吹干；按乙醇氧 化酶為12.7 31.2 U/cr^的用量將乙醇氧化酶溶液滴涂在處理過的聚碳 酸酯膜上，在0 4 。C的冰箱中干燥0.5 2小時；隨后將酶膜懸掛在盛 有戊二醛水溶液的密閉容器中，在0 4 °C的條件下交聯6 18小時； 最后將酶膜浸入pH值為6.0 9.0的磷酸緩沖液中，以洗去結合不牢固 的乙醇氧化酶，制成以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜，保存在0 4 °C的冰箱中備用。
3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，聚碳酸酯膜平均 孔徑范圍為0.10 0.80nm，厚度范圍為5 30pm;乙醇氧化酶溶液濃度 為0.8 1.1 U/pL;戊二醛蒸氣由質量分數為40 60%的戊二醛水溶液揮 發產生。
全文摘要
一種以聚碳酸酯膜為基體的乙醇氧化酶膜及其制備方法，屬于電化學生物傳感器及其制備技術領域。該乙醇氧化酶膜由聚碳酸酯基體膜、乙醇氧化酶及固定酶的戊二醛組成。該乙醇氧化酶膜的制備方法是將聚碳酸酯膜粘在O型橡膠圈上，晾干后將該聚碳酸酯膜浸入磷酸緩沖溶液中，取出用高純氮氣吹干后滴加乙醇氧化酶，再通過戊二醛蒸氣交聯固定乙醇氧化酶制成酶膜。本發明乙醇氧化酶膜具有較短的響應時間、較高的靈敏度、較寬的線性響應范圍以及良好的操作穩定性與儲存穩定性；此外本發明的乙醇氧化酶膜制備方法簡單、成本較低。
文檔編號C12Q1/26GK101382515SQ20081022524
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月29日 優先權日2008年10月29日
發明者劉長霞, 利 楊, 楊文勝 申請人:北京化工大學