專利名稱：一種防止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)污染的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)，是指在DNA聚合酶催化下， 以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母 鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程，其本質(zhì)是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在 體外擴(kuò)增任何目的DNA。目前，PCR技術(shù)可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基 因多態(tài)性研究等許多方面，同時(shí)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測，微生 物群落結(jié)構(gòu)監(jiān)測等方面。如中國專利(專利號(hào)03137645. 2)公布了一種提高PCR技術(shù)檢 測植物病原細(xì)菌靈敏度的方法；中國專利(專利號(hào)01104063. 7)公開了一種聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)基因芯片，用于病原微生物的鑒定；中國專利(專利號(hào)02136206.8)公開了一種應(yīng)用于 微生物分子生態(tài)學(xué)的并行比較為生物群落結(jié)構(gòu)的分子生態(tài)監(jiān)測方法。 在上述應(yīng)用過程中，PCR擴(kuò)增過程中出現(xiàn)污染將導(dǎo)致假陽性結(jié)果或假陰性結(jié)果，是 一個(gè)亟待解決的問題。PCR污染的原因是多方面的，反應(yīng)體系中成分的污染是主要原因之 一，目前已經(jīng)有一些方法加以預(yù)防，主要是采用環(huán)境消毒，操作中注意交叉污染等，如中國 專利(專利號(hào)02133044. 1)公布了一種利用鹽酸蒸汽消滅核酸污染的方法，該方法主要用 于消除實(shí)驗(yàn)儀器、器皿、耗材、實(shí)驗(yàn)場地等引起的核酸污染，從而降低PCR過程出現(xiàn)污染的 機(jī)會(huì)。這類方法可以有效控制PCR操作過程中可能出現(xiàn)的污染，但PCR體系中的不同成分 都是要多次使用的，任何一次微小的失誤從而引入外界微生物都可能造成結(jié)果的錯(cuò)誤。
抗生素也稱抗菌素，可以抑制或殺死其他微生物。由于不同種類的抗生素的化學(xué) 成分不一，因此它們對(duì)微生物的作用機(jī)理也很不相同，有些抑制蛋白質(zhì)的合成，有些抑制核 酸的合成，有些則抑制細(xì)胞壁的合成。抗生素被廣泛應(yīng)用于家禽、家畜、作物等病害的防治， 現(xiàn)已成為治療傳染性疾病的主要藥物。抗生素還應(yīng)用于食品保存，如四環(huán)素應(yīng)用于肉類等 的保存，制霉菌素應(yīng)用于柑桔等的保存。 目前，通過向PCR反應(yīng)的不同成分中加入抗生素，減少PCR出現(xiàn)污染的機(jī)會(huì)，未見 文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種防止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)污染的新方法。 發(fā)明原理PCR反應(yīng)體系中的緩沖液、dNTP溶液、無菌水在保存前加入一定量抗生
素，避免多次凍融過程中由于引入環(huán)境微生物，造成微生物在緩沖液、dNTP溶液、無菌水中
繁殖，從而引起PCR污染，造成PCR結(jié)果錯(cuò)誤。體系中加入抗生素可以抑制微生物的生長、
繁殖，避免或減少外來微生物的污染。
實(shí)施方法 1、稱取一定量的抗生素，溶解于超純水中，配制成母液，過濾除菌，分裝于無菌的
3離心管中，冷藏或冷凍保存。 2、無菌操作吸取一定量母液加入PCR反應(yīng)體系中的緩沖液、dNTP溶液、無菌水中， 冷凍保存。 步驟一中所述抗生素可以是青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺
卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小諾霉素、阿斯霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉
素、甲砜霉素、紅霉素、白霉素、無味紅霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素及交沙霉素中一種或
多種的混合物，母液中各種抗生素混合后的總濃度為1 P g/ml-20mg/ml。 步驟二中保存的各種PCR成分中，各種抗生素的總濃度為0. 01 ii g/ml-100ii g/ml。 本發(fā)明技術(shù)方案可以防止PCR反應(yīng)體系受到外來微生物的污染，延長使用次數(shù)。 以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神 實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1 : 1)稱取一定量的青霉素，溶解于超純水中，配制成母液lmg/ml，過濾除菌，分裝于 無菌的離心管中，冷藏或冷凍保存。 2)處理管為無菌操作吸取一定量母液加入PCR反應(yīng)體系中的dNTP溶液中，青霉素
終濃度為1 P g/ml，對(duì)照管為同樣條件下加等量無菌超純水，冷凍保存。 3)正常PCR操作，對(duì)照管反復(fù)凍融5次后PCR結(jié)果表現(xiàn)為污染，而處理管反復(fù)凍融
11次后PCR結(jié)果仍表現(xiàn)為無污染。 實(shí)施例2: 1)稱取一定量的四環(huán)霉素，卡那霉素，分別溶解于超純水中，各配制成母液2mg/ ml，過濾除菌，分裝于無菌的離心管中，冷藏或冷凍保存。 2)處理管為無菌操作分別吸取一定量四環(huán)霉素，卡那霉素母液加入PCR反應(yīng)體系 中的dNTP溶液中，四環(huán)霉素終濃度為1 P g/ml，卡那霉素終濃度為0. 1 ii g/ml，對(duì)照管為同 樣條件下加等量無菌超純水，冷凍保存。 3)正常PCR操作，對(duì)照管反復(fù)凍融5次后PCR結(jié)果表現(xiàn)為污染，而處理管反復(fù)凍融 8次后PCR結(jié)果仍表現(xiàn)為無污染。
權(quán)利要求
一種防止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)污染的新方法，其特征在于稱取一定量的抗生素，溶解于超純水中，配制成母液，過濾除菌，分裝于無菌的離心管中，冷藏或冷凍保存；無菌操作吸取一定量母液加入PCR反應(yīng)體系中的緩沖液、dNTP、無菌水中，-2℃～-25℃冷凍保存。
2. 權(quán)利要求1所述的抗生素，包括青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小諾霉素、阿斯霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、氯 霉素、甲砜霉素、紅霉素、白霉素、無味紅霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素及交沙霉素中一種或多種的混合物，母液中各種抗生素混合后的總濃度為1 y g/ml-20mg/ml。
3. 權(quán)利要求1所述的各種PCR成分，其特征在于保存的各種PCR成分中，各種抗生素 的總濃度為0. 01 ii g/ml-100 ii g/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防止聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)污染的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法是通過向PCR反應(yīng)體系的不同成分中加入一定濃度抗生素，抑制環(huán)境微生物在這些成分中的繁殖，從而有效降低該基因在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中受到污染的機(jī)會(huì)，避免由于PCR反應(yīng)成份污染導(dǎo)致的假陽性，延長PCR反應(yīng)體系的使用周期，減少浪費(fèi)。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101724671SQ200810224369
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日
發(fā)明者張建云, 李祖明, 白志輝, 谷立坤, 鄒國 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心