專利名稱：：一種酸性木聚糖酶xynb及其基因和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種產酸性木聚糖酶的菌株Bisporasp.X_l，和從該菌種中得到的酸性木聚糖酶及其基因、包含該基因的重組載體和應用。
背景技術：
：半纖維素是自然界中含量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機碳含量的三分之一(Prade.Biotech,andGenticEngi.Rev.13(12):101131，1995)。木聚糖是主要類型的半纖維素(Collinsetal..FEMSMicrobiolRev.29:323.2005)，廣泛存在于在農業副產物如玉米芯、麥麩、米糠、秸稈、甘蔗渣等中，但這一重要的可再生資源一直難以得到有效的利用。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一類酶的總稱，對木聚糖酶的研究早在六十年代就已開始，主要研究集中在適合于食品工業、制漿造紙工業、能源工業等方面的木聚糖酶。許多微生物包括細菌、真菌和酵母菌都能產木聚糖酶。大多數木聚糖酶屬第F/10、G/ll族糖基水解酶，不同來源的木聚糖酶其氨基酸序列、空間結構、相對分子質量、等電點以及底物特異性各不相同，因而有必要對編碼各種木聚糖酶的基因進行克隆和表達，以滿足工業應用的需求。目前，已有許多種木聚糖酶編碼基因得到分離，在木聚糖酶基因的高效表達方面也進行了較多嘗試(張紅蓮等，科學通報，48(4):364368,2003;Zhouetal…BioresourceTechnology.831-838，2008;Lietal.，Appl.Microbiol.Biotechol..inpress，2008)。近年來，從極端微生物中分離木聚糖酶引起了人們的極大的興趣。這些木聚糖酶由于適應極端環境而獲得了特殊的性質，可以滿足工業應用的特殊需求。如來源于Thermotogasp.嗜熱木聚糖酶(Simpsonetal.BiochemJ.277:413-417.1991);來源于嗜堿菌Bacillussp.strain41M-1嗜堿木聚糖酶(Nakamuraetal.，ApplEnvironMicrobiol.59:2311-2316.1998);來源于Penicilliumsp.40嗜酸性木聚糖酶(Kimuraetal.BiosciBiotechnolBiochem.64:1230-1237.2000)等。但迄今為止，關于酸性木聚糖酶的報道卻不多。由于酸性木聚糖酶在pH值4.0以下時仍然保持較高酶活性，通常酸性木聚糖酶可以廣泛應用于飼料工業、釀酒工業、食品工業等眾多領域，充分顯示出它在生產上的巨大潛力。目前，同時具備耐酸、耐高溫、抗蛋白穩定性等性質并運用基因工程手段來產業化生產嗜酸木聚糖酶產品還未見報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種產酸性木聚糖酶的菌株Bisporasp.X_l。本發明的再一目的是提供來源于上述菌株的酸性木聚糖酶。本發明的再一目的是提供上述木聚糖酶的基因。本發明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重組載體。本發明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重組菌株。本發明的再一目的是提供一種制備酸性木聚糖酶的方法。本發明的再一目的是提供上述酸性木聚糖酶的應用。本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優良的、適合于在飼料、食品、釀酒以及能源工業中應用新的木聚糖酶。本發明人篩選到一種天然菌株，它所產生的木聚糖酶適合于在飼料、食品、釀酒以及能源工業中使用。該嗜酸真菌Bisporasp.X_l，于2008年9月26日、保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)其保藏號為CGMCCNo.2676。從上述菌株中獲得了一種酸性木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1:1MHAFSYLAVALSALPLLQAAPTSVQKRGAHNFMLSPDHPLMVAKRNASLARRSSTNYDQDYTTGGSVYFAPASGEFYVSWDTTDDFVVGVGWNPGSTEPITHGGSFNVDSGLASLSVYGWSTNPLVEYYIIDDEVDLPLSGTEKGTVYSDGSTYTIWENQRVDEPSIEGTSTFNQYISIRDSPRVSGTVTVENHFQAWANLGMDLGTLNFQVIAIESWDGSGNAYQTVSN該酶具有230個氨基酸，其中N端19個氨基酸為其預測的信號肽序列"MHAFSYLAVALSALPLLQA"。因此，成熟的酸性木聚糖酶的理論分子51101151201:為23.lkDa，其氨基酸序列如SEQIDNO.21APTSVQKRGAHNFMLSPDHPLMVAKRNASLARRSSTNYDQDYTTGGSVYFAPASGEFYVSWDTTDDFVVGVGWNPGSTEPITHGGSFNVDSGLASLSVYGWSTNPLVEYYIIDDEVDLPLSGTEKGTVYSDGSTYTIWENQRVDEPSIEGTSTFNQYISIRDSPRVSGTVTVENHFQAWANLGMDLGTLNFQVIAIESWDGSGNAYQTVSN該木聚糖酶XYNB同時具有好的熱穩定性而在常溫下又具備高活性、在酸性和中性的范圍內均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本發明篩選到的嗜酸真菌Bisporasp.X-l所產生的木聚糖酶，其最適pH值為2.6，在pH24的范圍內維持50%以上的酶活性；最適溫度為65°C，在6(TC下保溫60min，酶活性基本維持不變，7(TC下保溫15min，剩余酶活性為90%以上，處理60min后，酶活仍在70%以上；用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理60分鐘，酶活性維持在85100%。這種性質的木聚糖酶還未曾有過報道。本發明還提供了編碼上述酸性木聚糖酶的基因。該酶的全基因序列如SEQIDNO.3所示1ATGCATGCATTCTCATACTTGGCTGTGGCGCTCTCCGCCCTCCCGTTGTTACAAGCTGCT61CCAACATCTGTCCAAAAGCGCGGGGCCCACAACTTCATGCTTTCCCCTGATCATCCACTG121ATGGTGGCTAAGCGGAATGCAAGCCTTGCCCGTAGATCCTCCACAAATTACGATCAAGAT181TACACTACTGGAGGGTCGGTATATTTCGCGCCTGCCAGCGGCGAGTTCTATGTCTCGTGG241GATACTACAGATGATTTCGTTGTTGGCGTAGGCTGGAACCCAGGCAGTACCGAGTAAGTC301TTCGTTACACGTTCCCGTGCTGCTGTCATTGTCTTCTCGTACTGACCTATTGGCACTAGA361CCAATCACCCACGGTGGTAGTTTCAACGTCGATTCCGGCTTGGCTAGCCTCTCTGTATAT421GGCTGGTCGACCAACCCACTGGTTGAATACTATATCATCGACGACGAAGTCGACCTACCT481CTGTCAGGTACGGAGAAAGGCACTGTCTATAGCGACGGCTCCACCTACACCATTTGGGAG541AACCAACGTGTGGATGAGCCTTCCATCGAAGGCACGTCGACCTTTAATCAGTATATCTCC601ATTCGCGACTCCCCACGTGTTAGTGGAACTGTCACTGTAGAAAACCATTTCCAAGCATGG661GCAAATCTCGGTATGGACCTTGGAACTCTGAATTTCCAGGTTATTGCGATCGAAAGTTGG721GACGGGAGTGGAAATGCGTATCAGACTGTGTCGAATTAG本發明通過PCR的方法分離克隆了這一木聚糖酶基因xynB，DNA全序列分析結果表明，木聚糖酶XYNB結構基因xynB全長759bp，含有一個內含子，cDNA長693bp，+294+359bp為66bp的內含子序列，其cDNA序列如SEQIDNO.4所示。SEQIDNO.4:1ATGCATGCATTCTCATACTTGGCTGTGGCGCTCTCCGCCCTCCCGTTGTTACAAGCTGCT61CCAACATCTGTCCAAAAGCGCGGGGCCCACAACTTCATGCTTTCCCCTGATCATCCACTG121ATGGTGGCTAAGCGGAATGCAAGCCTTGCCCGTAGATCCTCCACAAATTACGATCAAGAT181TACACTACTGGAGGGTCGGTATATTTCGCGCCTGCCAGCGGCGAGTTCTATGTCTCGTGG241GATACTACAGATGATTTCGTTGTTGGCGTAGGCTGGAACCCAGGCAGTACCGAACCAATC301ACCCACGGTGGTAGTTTCAACGTCGATTCCGGCTTGGCTAGCCTCTCTGTATATGGCTGG361TCGACCAACCCACTGGTTGAATACTATATCATCGACGACGAAGTCGACCTACCTCTGTCA421GGTACGGAGAAAGGCACTGTCTATAGCGACGGCTCCACCTACACCATTTGGGAGAACCAA481CGTGTGGATGAGCCTTCCATCGAAGGCACGTCGACCTTTAATCAGTATATCTCCATTCGC541GACTCCCCACGTGTTAGTGGAACTGTCACTGTAGAAAACCATTTCCAAGCATGGGCAAAT601CTCGGTATGGACCTTGGAACTCTGAATTTCCAGGTTATTGCGATCGAAAGTTGGGACGGG661AGTGGAAATGCGTATCAGACTGTGTCGAATTAG其中，信號肽的堿基序列為ATGCATGCATTCTCATACTTGGCTGTGGCGCTCTCCGCCCTCCCGTTGTTACAAGCT。成熟蛋白理論分子量為23.lkDa。將木聚糖酶基因xynBcDNA序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對。推導的氨基酸序列同Hypocreajecorina，Penicilliumf皿iculosum禾口Phanerochaetechrysosporium來源的木聚糖酶有較高的序列相似性，分別為57.1，49.8和44.4%。為此基因的改造并在各種外源基因表達系統中高效表達提供優良的基因材料，說明XYNB是一種新的木聚糖酶。本發明還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組載體，優選為pPIC9-xynB。將本發明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將木聚糖酶基因插入到質粒pPIC9上的EcoRI和Notl限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于A0X1啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒pPIC9-xynB。本發明還提供了包含上述木聚糖酶基因的重組菌株，優選為重組菌株GS115/xynB。本發明還提供了一種制備酸性木聚糖酶的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶的表達；以及3)回收并純化所表達的木聚糖酶。其中，優選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(Pichicpastoris)GS115，得到重組菌株GS115/xynB。本發明還提供了上述酸性木聚糖酶的應用。本發明的木聚糖酶最適pH為2.6，在pH2.04.0都有較高的酶活性；熱穩定性好，能夠滿足普通飼料制粒工藝；具有極好的抗蛋白酶的能力。符合動物消化生理特點、pH適應范圍提高飼料消化能和代謝能，降低配方成本，減少環境污染；提高谷物加工副產品的營養價值，提升飼料產品品質。本發明的木聚糖酶可應用于釀酒工業，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉層，提高淀粉利用率，增加酒精的產率。還可以將造紙工業廢料及農業廢棄物中的木聚糖可被轉化為D-木糖單體，而D-木糖又可被細菌、酵母及真菌轉化成有價值的燃料。因此，本發明的木聚糖酶在能源工業中的應用也顯示出其巨大的潛力。水解產物(木糖和低聚木糖)可應用在食品行業，作為增稠劑、脂肪代替物和抗凍食品添加劑；在制藥工業中木聚糖與其它物質結合使用，可以延緩藥物成分的釋放。木聚糖的水解產物還可以進一步轉化為液體燃料、單細胞蛋白、溶劑和低熱量甜味劑。嗜酸真菌Bisporasp.X_l，于2008年9月26日、保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)其保藏號為CGMCCNo.2676。圖lxynB在畢赤酵母中表達的木聚糖酶的SDS-PAGE分析，l，分子量標準；2，3發酵培養上清；4，純化的重組木聚糖酶。圖2本發明重組木聚糖酶的最適pH值。圖3本發明重組木聚糖酶的pH穩定性。圖4本發明木重組聚糖酶最適反應溫度。圖5本發明重組木聚糖酶熱穩定性。圖6蛋白酶處理本發明木聚糖酶后的酶活曲線(A)和SDS-PAGE分析(B)，l，分子量標準；2，胰蛋白酶處理后的XYNB;3，胃蛋白酶處理后的XYNB;4，純化的重組木聚糖酶XYNB。具體實施例方式試驗材料和試劑1、菌株及載體Bisporasp.X_l由本發明人分離獲得，畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養基(l)Bisporasp.X-1培養基為馬鈴薯汁培養基1000mL馬鈴薯汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，pH2.5。(2)大腸桿菌培養基LB(1X蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0)。(3)BMGY培養基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。(4)B匪Y培養基除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4.0。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例1分離嗜酸真菌Bisporasp.X-17將來源于江西某礦的鈾礦廢水樣品經富集培養后(富集培養基(NH4)2S045g/L，KH2P04lg/L，MgS047H200.5g/L，FeS047H200.01g/L，CaCl20.2g/L，玉米芯粉0.5%，麩皮0.5%，pH2.5)，按常規稀釋后涂布于產酶培養基((NH4)2S045g/L，KH2P04lg/L，MgS047H200.5g/L，FeS047H200.01g/L，CaCl20.2g/L，木聚糖1%，1.5%瓊脂糖，pH2.5)平板上，3(TC培養56d，挑取產生透明圈菌落在產酶培養基平板劃線分離，重復劃線分離過程3輪，使菌株純化。通過此方法篩選到該分泌木聚糖酶的菌株。本菌株在PDA上3(TC下培養7d菌落直徑23cm，灰黑色或灰褐色，呈圓形放射狀，表面有絨狀皺褶且不易于挑起。分生孢子梗直立，(69)iimX(1013)iim。頂端產生鏈生孢子，分生孢子有隔，O1隔，橢圓形至紡錘形，無分枝，棕色至深棕色，(58.25)iimX(1019)iim。其最適生長pH為2.53.0，最適溫度30°C。實施例2嗜酸真菌Bisporasp.X-1木聚糖酶編碼基因xynB的克隆提取嗜酸真菌Bisporasp.X-1基因組DNA:將液體培養3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65。C水浴鍋裂解20min，每隔10min混勻一次，在4t:下10000rpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4t:下10000rpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-2(TC備用。根據第十一家族木聚糖酶基因的保守(YLAVYGW和STFNQYI)序列設計合成了簡并引物P1，P2P1:5'-TACCTTGC(C/T)(A/T/C/G)T(C/G)TA(C/T)GG(A/T/C)TGG3';P2:5'-AT(A/G)TA(C/T)TG(A/G)TT(A/G)AA(A/T/G/C)GT(A/T/G/C)GA-3'。以嗜酸真菌Bisporasp.X-1總DNA為模板進行TouchdownPCR擴增。PCR反應參數為94。C變性3min;然后94。C變性30sec，46。C退火30sec，72。C延伸lmin，為一個循環;然后每個循環退火溫度降低rC，10個循環后退火溫度為37°C;94t:變性30sec，37t:4退火30sec，72。C延伸lmin，30個循環后72。C保溫10min。得到一約191bp片段，將該片段回收后與pEASY-T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。根據測序得到的核甘酸序列，設計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設計方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在spl的內側，sp3位于sp2的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度一般2230nt，退火溫度在6065°C。并將它們分別命名為uspl，usp2，usp3(上游特異性引物)，dspl，dsp2，dsp3(下游特異性引物)見表l。表l.木聚糖酶XYNBTAIL-PCR特異性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>usp2CTGTCAGGTACGGAGAAAGGCACTGTC27usp3CCAACGTGTGGATGAGCCTTCCATCGAAG29dsplCGACGTGCCTTCGATGGAAGGCTCATCC28dsp2CAAATGGTGTAGGTGGAGCCGTCGCTATAG30dsp3TGATATAGTATTCAACCAGTGGGTTGGTCGACC_^_通過反向TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收后送三博生物技術有限公司測序。實施例3木聚糖酶基因的RT-PCR分析提取Bisporasp.X_l的總RNA，利用反轉錄酶得到cDNA的一條鏈，然后設計恰當的引物(XynBF:5'-ATGCATGCATTCTCATACTTGGCTGTGGCG—3'，XynBR:5'-CTAATTCGACACAGTCTGATACGCATTTCCACTCC-3')擴增該單鏈cDNA，獲得木聚糖酶的cDNA序列，擴增得到產物回收后送三博生物技術有限公司測序。通過比較木聚糖酶的基因組序列和cDNA序列后發現該基因有l個內含子，cDNA長693bp，編碼231個氨基酸，N端19個氨基酸為其信號肽序列。推導的氨基酸序列同Hypocreajecorina，Penicilliumf皿iculosum禾口Phanerochaetechrysosporium來源的木聚糖酶有較高的序列相似性，分別為57.1，49.8和44眉。證明從Bisporasp.X_l中分離克隆得到的編碼木聚糖酶的基因為新基因。實施例4重組木聚糖酶的制備。將表達載體pPIC9進行雙酶切(EcoRI+NotI)，同時將編碼木聚糖酶的基因xynB雙酶切(EcoRI+NotI)，切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達載體pPIC9連接，獲得含有Bisporasp.X_l木聚糖酶基因xynB的重組質粒pPIC-xynB并轉化畢赤酵母GS115,獲得重組畢赤酵母菌株GS115/xynB。取含有重組質粒的GS115菌株，接種于400mLBMGY培養液中，30°C250rpm振蕩培養48h后，離心收集菌體。然后于200mLB匪Y培養基重懸，30°C250rpm振蕩培養。誘導48h后，離心收集上清。測定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達量為64U/mL。SDS-PAGE結果(圖1)表明，重組木聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達。所表達的木聚糖酶經過純化之后，其蛋白質的含量達到總蛋白的95%以上。實施例5重組木聚糖酶的活性分析DNS法具體方法如下在pH2.6，65t:條件下，lmL的反應體系包括100iiL適當的稀釋酶液，900iiL底物，反應10min，加入1.5mLDNS終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm測定0D值。l個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出lymol還原糖的酶量。實施例6重組木聚糖酶XYNB的性質測定1、重組木聚糖酶XYNB的最適pH和pH穩定性的測定方法如下將實施例4純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。底物木聚糖用不同pH的O.lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中65t:下進行木聚糖酶活力測定。結果(圖2)表明XYNB的最適pH為2.6。XYNB在pHl.56.0之間，處理后剩余酶活性在80%以上，而在pH7.09.0處理后酶活開始下降，在pH9.O，酶活剩余52%。在pH高于10.0的緩沖液中處理后，酶活剩余不足10%(圖3)。該酶在整個酸性和中性條件9下穩定性好。2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩定性測定方法如下木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH2.6)緩沖液體系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在65t:下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果表明，其最適溫度為65t:。在4(TC75°C間具有50%以上的酶活力(圖4)。XYNB在6(TC下保溫60min，酶活性基本維持不變，7(TC下保溫15min，剩余酶活性為90%以上，處理60min后，酶活仍在70%以上。說明該酶在6(TC和7(TC條件下，具有非常好的熱穩定性(圖5)。3、木聚糖酶的Km值測定方法如下用不同濃度的木聚糖(4_0_Me_D_glucurono_D_xylan，SigmaFrombirchwood)為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH2.6)緩沖液體系中，65t:下測定酶活性，計算出其在65t:下的Km值。經測定，此木聚糖酶在65t:下以木聚糖為底物的Km值為29.96mg/mL，V隨為1757.2limol/minmg。4、不同金屬離子化學試劑對XYNB酶活的影響測定如下在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響，各種物質終濃度為1，5和10mmol/L。在65°C、pH2.6條件下測定酶活性。結果(表2)表明低濃度的Mg"、C、Ni"、F^+和P-巰基乙醇對木聚糖酶XYNB有明顯的激活作用。低濃度的Cu2+、Pb3+和Hg2+對酶活有部分的抑制作用，SDS的存在使酶完全失活。其余金屬離子在低濃度時對XYNB的酶促反應無顯著影響。高濃度的Li+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Cr3+、Ni2+、Fe3+、13-巰基乙醇和EDTA對酶活有明顯的激活作用。高濃度的Cu2+、Pb3+和Hg2+對酶活有較強抑制作用，SDS可使酶完全失活。高濃度的其它離子對酶活影響不大。表2.各種金屬離子及化學試劑對木聚糖酶XYNB活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注"-"代表無法檢測。5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力測定如下用pH2.0KC1-HC1緩沖液配制0.lmg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl緩沖液配制0.lmg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KC1-HC1緩沖液稀釋后的0.5mL純化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl緩沖液稀釋后的0.5mL純化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/木聚糖酶(w/w)"0.1，37。C保溫0、2、5、8、10、20、30和60min取樣，在pH2.6及65。C條件下測定酶活性。實驗結果表明木聚糖酶XYNB用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后60min后，胰蛋白酶處理的XYNB的酶活性略有降低，是原來的85%。胃蛋白酶處理的XYNB的酶活基本沒有發生變化。說明XYNB具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力(圖6A)。胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后的木聚糖酶XYNB經SDS-PAGE分析表明胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后的XYNB的分子量沒有發生改變(圖6B)。6、木聚糖酶降解燕麥木聚糖產物的分析如下在500iiL1%的木聚糖中加入100iiL純化的酶液，最適溫度下保溫34h。用無水乙醇將酶蛋白沉淀，上清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培(HPAEC-PAD)檢測方法，進行產物中糖種類的分析。分析結果表明木聚糖酶XYNB降解燕麥木聚糖的產物主要是木糖，木二糖和少量木三糖和木四糖。產物中木糖含量為47.9%，木二糖含量為50.58%，木三糖的含量為0.21%，木四糖的含量為1.31%。序列表〈110〉廣東溢多利生物科技股份有限公司〈120〉一種酸性木聚糖酶XYNB及其基因和應用〈160>4〈210>1〈211>230〈212>PRT〈213〉真菌(Bisporasp.X_l)〈400>1MHAFSYLAVALSALPLLQAAPTSVQKRGAHNFMLSPDHPLMVAKRNASLARRSSTNYDQD60YTTGGSVYFAPASGEFYVSWDTTDDFVVGVGWNPGSTEPITHGGSFNVDSGLASLSVYGW120STNPLVEYYIIDDEVDLPLSGTEKGTVYSDGSTYTIWENQRVDEPSIEGTSTFNQYISIR180DSPRVSGTVTVENHFQAWANLGMDLGTLNFQVIAIESWDGSGNAYQTVSN230〈210>2〈211>211〈212>PRT〈213〉真菌(Bisporasp.X_l)〈400>2APTSVQKRGAHNFMLSPDHPLMVAKRNASLARRSSTNYDQDYTTGGSVYFAPASGEFYVS60WDTTDDFVVGVGWNPGSTEPITHGGSFNVDSGLASLSVYGWSTNPLVEYYIIDDEVDLPL120SGTEKGTVYSDGSTYTIWENQRVDEPSIEGTSTFNQYISIRDSPRVSGTVTVENHFQAWA180NLGMDLGTLNFQVIAIESWDGSGNAYQTVSN211〈210>3〈211>759〈212>DNA〈213〉真菌(Bisporasp.X_l)〈400>3atgcatgcattctcatecttggctgtggcgctctccgccctcccgttgttacaagctgct60ccaacatctgtccaaaagcgcggggcccacaacttcatgctttcccctgatcatccactg120atggtggcteagcgg朋tgc朋gccttgcccgtegatcctccac3朋ttecgatc朋gat180tecactectggagggtcggtatetttcgcgcctgccagcggcgagttctetgtctcgtgg240gatectecagatgatttcgttgttggcgteggctggaacccaggcagteccgagteagtc300ttcgttecacgttcccgtgctgctgtcattgtcttctcgtactgacctettggcactega360cc朋tcacccacggtggtegtttcaacgtcgattccggcttggctegcctctctgtetet420ggctggtcgaccaacccactggttgaatectetetcatcgacgacgaagtcgacctecct■12ctgtcaggtacggag朋3ggcactgtctetagcgacggctratttgggag540朋cc朋cgtgtggatgagccttccatcgaaggcacgtcgaccttteatcagtetetctcc600attcgcgactccccacgtgttegtgg皿ctgtcactgtegcc皿gcatgg660gcaaatctcggtetggaccttggaactctgaatttccaggttettgcgatcg腿gttgg720g3Cggg3gtgga朋tgcgtetcagactgtgtcgaatteg759〈210>4〈211>693〈212>DNA〈213〉真菌(Bisporasp.X_l)〈400>1atgcatgcattctcatecttggctgtggcgctctccgccctcccgttgttacaagctgct60ccaacatctgtcc朋朋gcgcggggcccacaacttcatgctttcccctgatcatccactg120atggtggcteagcggaatgcaagccttgcccgtegatcctcgatc皿gat180tecactectgg郷gtcggtatetttcgcgcctgccagcggcgagttctetgtctcgtgg240gatectecagatgatttcgttgttggcgteggctgg皿cccaggragteccgaaccaatc300acccacggtggtegtttcaacgtcgattccggcttggctegcctctctgtatetggctgg360tcgaccaacccactggttgaatectetetcatcgacgacgaagtcgacctacctctgtca420ggtecgg卿朋ggcactgtctetegcgacggctccacctacaccatttgggag皿cc皿■cgtgtggatgagccttccatcg皿ggcacgtcgaccttteatcagtetetctccattcgc540gactccccacgtgttegtggaactgtcactgteg皿皿ccatttccaagc600ctcggtetggaccttggaactctgaatttccaggttettgcgatcg^agttgggacggg660Elgtgg腿tgcgtetcagactgtgtcgaatteg69權利要求一種嗜酸真菌Bisporasp.X-1，其保藏號為CGMCCNo.2676。2.—種酸性木聚糖酶XYNB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.—種酸性木聚糖酶XYNB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一種酸性木聚糖酶基因xynB，其特征在于，編碼權利要求2或3所述的木聚糖酶。5.如權利要求4所述的木聚糖酶基因xynB，，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.3所示。6.如權利要求4所述的木聚糖酶基因xynB，，其特征在于，其堿基序列如SEQIDNO.4所示。7.包含權利要求4所述木聚糖酶基因的重組載體。8.包含權利要求4所述木聚糖酶基因的重組載體pPIC9-xynB。9.包含權利要求4所述木聚糖酶基因的重組菌株。10.—種制備酸性木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權利要求7的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶XYNB的表達；以及3)回收并純化所表達的木聚糖酶XYNB。11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞。12.權利要求2或3所述的酸性木聚糖酶XYNB的應用。全文摘要本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種酸性木聚糖酶XYNB及其基因和應用。本發明分離了一種產酸性木聚糖酶的菌株Bisporasp.X-1，從該菌種中得到酸性木聚糖酶，其具有如SEQIDNO.1或2所示氨基酸序列，并獲得編碼上述木聚糖酶的基因，其具有如SEQIDNO.3或4所示的核苷酸序列。本發明的木聚糖酶的具有以下性質最適pH2.6，最適溫度65℃，良好的pH穩定性和熱穩定性；比活2049U/mg；極好的蛋白酶抗性以及易于工業化發酵生產。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于動物飼料、食品、醫藥、釀酒、能源工業等。文檔編號C12N15/81GK101724565SQ20081022374公開日2010年6月9日申請日期2008年10月10日優先權日2008年10月10日發明者史寶軍,羅長財,胡愛紅申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司