專利名稱：一種生產寡霉素a的方法及其專用菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及寡霉素的生產方法及其生產菌株，特別是涉及一種生
5產寡霉素A的方法及其專用菌株。
背景技術：
寡霉素具有多種生物學活性，例如具有強烈的抗真菌活性、抗腫 瘤活性和呼吸抑制作用。
寡霉素ABC混合物可強烈抑制黑曲霉(J^wg/〃w m'gw),多孔木 10霉 (7b/_y/ oc/a<i/MW /"y/o^/w ), Fwsan'ww ocw^/ orM柳，新月彎孢菌 (CMrvw/an'a/"""to)和7Hc/zocfe環a a/6a, 尤其對人類致病菌皮炎芽 生菌(祝"Wowjc&y derma故Ws)具有顯著的抑制活性(Smith d a/., 1954;Gmmmatikova^a/.,2003 )。 一般地，寡霉素A、 B和C的抗真 菌活性強度為A > B > C ( Marty and McCoy, 1959 )。寡霉素A對植物 15致病菌灰葡萄孢菌(), 黃瓜黑星病菌(C7okiaspon'M附 cwc畫er/w訓),黃瓜炭疽病(Co〃eto n,c/7wm/agewan'膽), 稻瘟病菌 (gniea )禾口南瓜疫病菌(/V^top/z/Zzora ca/w/"')的最低 抑制濃度(MIC )為3 ~ 5嗎/ml ( Kim " a/., 1999 )。
在以線粒體作為靶標的37,000個化合物對人類60個腫瘤細胞株 20的抗癌活性試驗中，寡霉素是效果最好的37種化合物之一。抗阿霉 素的腫瘤細胞株R-HepG2細胞可產生P-糖蛋白，積累的阿霉素比親 代細胞少。寡霉素可阻止P-糖蛋白的活性，使R-HepG2細胞積累更 多阿霉素，從而引發細胞的程序性死亡(LiW"/.,2004)。 Korystov等 在2003年發現，寡霉素ABC的混合物在濃度為3 pg/ml時開始抑制 25小鼠P388淋巴性白血病細胞的存活，在30pg/ml (即38pM)時使 細胞存活率下降到54%。這些濃度比完全抑制各種細胞呼吸作用所需濃度(80 ~ 300 nM ) ( Currie " 1965 )要低1000倍以上。寡霉
素A對P388細胞的生長抑制作用與寡霉素ABC的混合物類似，但 是抑制濃度更低，即寡霉素A在lpg/ml時就開始抑制細胞的存活， 在10pg/ml時達到最大抑制率(Korystov"a/.,2003)。因此，寡霉素 5 A作為抗腫瘤劑極具應用潛力。
寡霉素是哺乳動物細胞氧化磷酸化的抑制劑。它能有效地結合線 粒體FoF,ATP合酶的功能亞基F(),使ATP合酶的構型發生改變，從 而抑制了線粒體膜間隙的質子流回流到線粒體基質，其結果是ATP 的合成被阻斷，造成生物代謝所需能量的不足，因此寡霉素對哺乳動
io物具有很強的毒性(Pinna1967)。寡霉素ABC混合物完全抑制 各種細胞呼吸作用所需濃度為80 300nM(按寡霉素ABC混合物的 平均分子量為791計算，則相當于0.0632-0.237 |ug/ml)(Currie"a/., 1965)。由于寡霉素的毒性，使得它們未在臨床上被應用。然而，作 為ATP合酶的抑制劑，寡霉素具有重要的科學意義。Lardy等是將寡
15霉素應用到科研實驗工作的先鋒人物(Lardy etal., 1958 ),這為后來 氧化磷酸化過程的闡明做出了巨大的貢獻(Lardy Wfl/.， 1969; 1975 )。 細胞生物能量的改變與許多疾病過程有關，對真核細胞產生大部分 ATP的酶-F1F0-ATP合酶進行調節，可望用于這些疾病的治療 (Johnson "fl/.， 2006)。線粒體是程序性死亡的關鍵性調節因素，這
20意味著線粒體可以作為癌癥治療的靶標。因此，作為線粒體氧化嫌酸 化抑制劑的寡霉素，被廣泛應用于氧化磷酸化、與線粒體功能紊亂有 關的疾病(Angelin""/.,2007)、以及程序性死亡等的相關研究當中 (Dairaku " a/., 2004; Karawajew d a/., 2005; Hanada " a/" 2006 )。在 科學研究上具有重要應用意義的寡霉素早已作為化學試劑被銷售，價
25 格昂貴，具有一定的經濟價值。在寡霉素A、 B和C各組分中，寡霉 素A的抗真菌活性和抗腫瘤活性最強。因此，除寡霉素ABC混合物 夕卜，寡霉素A是最廣泛應用于科學研究的一個組分。由于寡霉素A
比寡霉素ABC混合物的生產成本更高，因此巿售價格更高。
寡霉素A是分離得到的第一個寡霉素家族的抗生素，由淀粉酶 產色鏈霉菌(S. (^astotoc/2ramoge"&s)產生(Smith W a/., 1954 )。后來， 人們從其他鏈霉菌，例如阿維鏈霉菌(5^eptowyc^ m^nmWfe ) (Ikeda 5 " a/.， 1993a)， 51. /Aa"/ (Kim W a/.， 1999)和淺灰鏈霉菌(& ) (Grammatikova " a/.， 2003)，也分離得到了寡霉素A。在已報道的野 生型阿維鏈霉菌菌株中，寡霉素A的產量很低(Ikeda a a/., 1993a; 1993b )。
發明內容
io 針對上述問題，本發明目的是提供一種能生產寡霉素A的菌株。
本發明的另一個目的是提供應用本發明菌株生產寡霉素A的方法。
本發明提供的高產寡霉素A的阿維鏈霉菌(5^印tom;/CM avewn力'fe) L033菌株(阿維鏈霉菌也稱為除蟲鏈霉菌；拉丁文名稱 15簡稱&m^m^fe)，已于2008年9月26曰保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC),保藏編號為CGMCC No. 2678。
L033菌株在有機培養基上一般生長良好，形成豐富的氣生菌絲 和基內菌絲。光學顯微鏡下可見基絲無斷裂，無橫隔。通過制作電鏡
20 樣品并進行掃描電鏡觀察，可見L033菌株的孢子絲呈螺旋形，每條 孢子鏈可含有大于35個孢子。孢子呈球形、卵形、或柱狀，表面光 滑，大小為0.65-1.0 x 0.75-1.6 nm。菌絲直徑為0.75 ~ 1.5 pm。唯一 碳源利用試驗表明，L033菌株能利用L(+)-阿拉伯糖，D-木糖，葡萄 糖，D-果糖，L(+)-鼠李糖，棉子糖，甘露醇，肌醇，檸檬酸納，D-
25半乳糖，甘油，麥芽糖，乳糖，D-甘露糖，不能利用蔗糖，松三糖， L(-)-山梨糖，菊糖。可以使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固。可使明膠 液化，能產生黑色素和硫化氫，不能分解纖維素。抗生素抗性測定的
結果表明，L033菌株對安普霉素、硫鏈絲菌素、鏈霉素、卡那霉素 和氯霉素敏感，對氨節青霉素和萘啶酮酸不敏感。
以L033菌株的總DNA為模板，以￡. co/z' 16S rRNA的基因序列 保守區域的序列合成的引物1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3) 5 和Eubac27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')為引物，進行了 16SrDNA的幾乎完全序列的擴增。PCR產物長約1.5 kb，與預期的 一致。經過測序可知，該PCR產物全長1487bp。將該序列與GenBank 中的數據進行BLAST分析，將緊密相關的菌株的16S rDNA序列進 行比較，結果顯示L033菌株的16S rDNA序列與51. averw衍^ ATCC
io 312677的16S rDNA序列最相似，同源性為99.93%，與其他近鄰的 同源性在98.23 ~ 98.97%之間。將這些序列進行alignment分析，去掉 gap和不確定的位置，在L033中，1461個確定的核苷酸序列用于計 算進化距離。釆用CLUSTAL軟件進行多序列匹配排列，通過MEGA 3.1軟件中的鄰接法來構建的系統發育樹(如圖1)。從圖中可見L033
15 菌株與<S. avmrn力7^ ATCC 31267T的親緣關系最近，它們聚類在同一 簇上。L033菌株16S rDNA序列測定結果在GenBank數據庫中的注 冊號為EU621830。
DNA同源性分析能夠最終確定菌株分類地位，也是新屬種確定 的一個必需指標。待測的L033菌株與系統發育分支中關系最近的已
20知種5*. m^7w'"fc的模式菌株ATCC 31267進行了 DNA雜交試驗。 結果顯示，這兩個菌株的DNA同源性為100% ，表明L033菌株屬于 禾中& averm"http://^, 將其命名為<S. averm"z'/^ L033。
本發明提供一種生產寡霉素A的方法，包括如下步驟
1 )菌株培養將產寡霉素A的阿維鏈霉菌(X m;wm/"to ) L033 25菌株(CGMCC No. 2678 )在28°<:條件下發酵培養24 ~ 216小時得到
菌體；
2 )有機溶劑浸提菌絲體得到寡霉素A。
所述發酵培養的培養基含有下述物質可溶性淀粉70g,干酵母 16 g, MgS04.7H20 0.5 g, K2HP04,3H20 0.5 g, KC1 4 g， CaC03 2 g，蒸 餾水1000ml， pH為7.0 — 7.2。
為了使發酵的效果更好，在進行液體培養前，凍存的菌種還經過 5平板培養活化，常用平板培養基含有下述物質酵母膏4g，可溶性 淀粉4g，麥芽膏10g，瓊脂20g，蒸餾水1000 ml, pH為7.0 7.2。
在生產過程中，所述得到的菌絲體一般可釆用離心方式，如在 3000 rpm離心即可得到菌絲體。
所述有機溶劑浸提菌絲體得到寡霉素A的過程是向菌絲體中加 io入有機溶劑如丙酮、乙酸乙酯等，浸提30分鐘到24小時，抽濾得到 溶解于有機溶劑的寡霉素A的溶液，除去有機溶劑后，得到寡霉素A 的粗產品。浸提時間優選24小時。有機溶劑優選丙酮，其加入量可 控制在丙酮與菌絲體的體積比為2: 1。
除去寡霉素A溶液中有機溶劑的方式可釆用減壓蒸餾。經過減 15壓蒸餾后，回收水相殘余物并使其直接析出固體物質，回收該固體物 質并對其進行進一步純化，即可得到寡霉素A的粗品。或將水相殘 余物用乙酸乙酯進行萃取，再進行減壓蒸餾除去乙酸乙酯，亦可得到 寡霉素A的粗品。
本發明的菌株可產生豐富的孢子，生長速度快，便于工業化生產； 20 本發明的菌株生產寡霉素A的產率較高，產量可達1461ng/ml發酵液。
本發明的阿維鏈霉菌(5^印tom少cw avenrn'"/^ ) L(B3菌株，已于 2008年9月26曰保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(簡稱CGMCC),保藏編號為CGMCCNo. 2678。
25 圖l是根據16S rRNA基因序列構建的L033菌株及相關菌株的系
統發育樹。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1阿維鏈霉菌L033菌株的分離篩選
1、 樣品釆集
5 從廣東省廣州巿花都區釆取土壤樣品。
2、 菌株的分離和篩選
配制Bennett's培養基(酵母膏1.0g，牛肉膏1.0g,水解酪素2.0g,
葡萄糖10.0 g,瓊脂20g，蒸僧水1000ml， pH7.3), 115°C，高壓蒸 汽滅菌20min,倒平板。 io 釆用常規方法對土樣系列稀釋后進行平板分離，于28。C培養4、 7、 14、 21天后挑取放線菌菌落，其中一株菌命名為L033，純化后保
實施例2菌株的培養
配制平板培養基酵母膏4g,可溶性淀粉4g，麥芽膏10g，瓊 15脂20g，蒸餾水1000 ml， pH為7.2。將平板培養基在121°〇下滅菌
20min,倒平板，冷卻后接入L033菌株，在28。C下培養7天。
配制液體培養基可溶性淀粉70g，干酵母16g， MgS04.7H20
0.5 g, K2HPO4.3H2O0.5, KC14g, CaC03 2 g，蒸餾水1000 ml,
pH為7.2,將100 ml培養基裝入500 ml培養瓶中滅菌。從平板培養 20物中切一塊菌，接種于無菌液體培養基中，在28。C下進行搖床培養,
轉速為170rpm。培養24小時后開始產生寡霉素A，此后隨著時間增
長，寡霉素A的產量不斷增加，在培養216小時后寡霉素A的產生
進入停滯期，可以停止發酵。
實施例3寡霉素A粗品的提取 25 將發酵液在3000 rpm下離心10 min,棄上清液，收集菌絲體。
向菌絲體中加入丙酮(丙酮與菌絲體的體積比為2: 1)，用攪拌器攪
拌均勻，靜置24小時，抽濾，回收濾液，得到寡霉素A的丙酮溶液。
若仍有寡霉素A殘留在細胞殘渣中，可重復上述搡作步驟，直至不
再能提取出寡霉素A為止。
將所得到的丙酮溶液進行減壓蒸餾，回收水相殘余物。用乙酸乙 酯對水相殘余物進行萃取，再經減壓蒸餾，回收殘余物，即可得到寡
霉素A的粗提物，產率為3.6g寡霉素A粗產品/L發酵液。 實施例4寡霉素A粗品的提取
將發酵液在3000 rpm下離心10min, 棄上清液,收集菌絲體。 向菌絲體中加入丙酮(丙酮與菌絲體的體積比為2: 1)，用攪拌器攪 拌均勻，靜置24小時，抽濾，回收濾液，得到寡霉素A的丙酮溶液。 io若仍有寡霉素A殘留在細胞殘渣中，可重復上述操作步驟，直至不 再能提取出寡霉素A為止。
將所得到的丙酮溶液進行減壓蒸餾，回收水相殘余物。將水相殘 余物于1『C放置過夜，出現米白色固體和棕色油狀物。該水相殘余 物在3000rpm下離心20min后分為3層，上層為棕色油狀物，中間
15層為米白色固體，下層為澄清的棕色水相。經HPLC分析，發現寡霉 素A主要存在于米白色固體中。回收這些固體物質，向其中加入正 己烷-乙醇(96: 4)溶液，攪拌，離心去除不溶物，得到澄清的上清 液。經減壓蒸餾除去正己烷-乙醇溶液后，得到寡霉素A的粗提物， 產率為l.Olg寡霉素A粗產品/L發酵液。
20實施例5寡霉素A純結晶的獲得
用制備型HPLC進行寡霉素A的進一步純化，柱溫為環境溫度， 流動相為正己烷-乙醇(95: 5)溶液，流速為25 ml/min。收集寡霉 素A的洗脫峰，合并，進行減壓蒸餾以去除有機溶劑，得到白色固 體。向該固體殘余物中滴加適量正己烷-乙醇(95: 5)溶液，攪拌，
25立即出現純白色結晶。離心回收結晶，用正己烷-乙醇(95: 5)溶液 洗滌1次，再離心回收結晶，并使殘余有機溶劑在空氣中完全揮發， 最后得到寡霉素A的純結晶，產率為20.45 mg寡霉素A純結晶/L發 酵液。
權利要求
1.一種阿維鏈霉菌菌株(Streptomyces avermitilis)L033，保藏號為CGMCC No.2678。
2、 一種釆用權利要求l所述菌種生產寡霉素A的方法，其特征 5在于，包括如下步驟1 )菌株培養將產寡霉素A的菌株阿維鏈霉菌(<S. avwm&to ) L033 CGMCC No. 2678發酵培養得到菌絲體； 2)用有機溶劑浸提菌絲體得到寡霉素A。
3、 如權利要求2所述的生產寡霉素A的方法，其特征在于，所述 io步驟l)的菌株在28'C條件下發酵培養24 216小時。
4、 如權利要求2所述的生產寡霉素'A的方法，其特征在于，所述發酵培養的培養基含有下述物質可溶性淀粉，干酵母， MgS04.7H20， K2HP04.3H20， KC1, CaC03,蒸餾水；pH為7.0 — 7.2。
5、 如權利要求2所述的生產寡霉素A的方法，其特征在于，在進 15行培養前，所述菌株經過平板培養活化。
6、 如權利要求5所述的生產寡霉素A的方法，其特征在于，所述活化所用的平板培養基含有下述物質酵母膏，可溶性淀粉，麥芽膏， 瓊脂，蒸餾水；pH為7.0 7.2。
7、 如權利要求2所述的生產寡霉素A的方法，其特征在于，所述 20步驟2)中有機溶劑浸提菌絲體得到寡霉素A的過程是向菌絲體中加入有機溶劑，浸提30分鐘到24小時，抽濾得到溶解于有機溶劑的寡霉 素A的溶液，除去有機溶劑后，得到寡霉素A的粗產品。
8、 如權利要求2或7所述的生產寡霉素A的方法，其特征在于， 所述有機溶劑與菌絲體的加入量的體積比為2: 1。
9、如權利要求2或7所述的生產寡霉素A的方法，其特征在于，所述有機溶劑為丙酮或乙酸乙酯。
全文摘要
本發明提供一種生產寡霉素A的方法及其專用菌株，該方法包括如下步驟1)菌株培養將產寡霉素A的菌株阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)L033 CGMCC No.2678發酵培養得到菌絲體；2)用有機溶劑浸提菌絲體得到寡霉素A；該菌株為阿維鏈霉菌(S.avermitilis)L033 CGMCC No.2678。本發明的菌株可產生豐富的孢子，生長速度快，便于工業化生產；本發明的菌株生產寡霉素A的產率較高，產量可達1461μg/ml發酵液。
文檔編號C12N1/20GK101368166SQ200810223500
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月28日 優先權日2008年9月28日
發明者瑩 文, 李季倫, 林秀萍, 芝 陳 申請人:中國農業大學