專利名稱：單一菌種對木質纖維素水解產物的原位脫毒乙醇發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種乙醇發酵方法，具體地說是一種釆用單一菌種對木 質纖維素水解產物的原位脫毒乙醇發酵方法，本發明還涉及用于乙醇發
酵的微生物新菌株，具體地說是一種樹干畢赤酵母(尸/c/n'a S^7/to )新 菌株。
背景技術：
在以木質纖維素為原料生產乙醇的研究開發領域中，木質纖維素稀 酸水解被認為是最容易實現商業化的生產工藝[1]，國內外在該領域進行 了大量和深入的研究。但到目前為止，國內外在稀酸水解木質纖維素生 產燃料乙醇方面還存在著瓶頸問題，解決該技術瓶頸是要得到高效發酵 水解糖液中的木糖產乙醇并要高效代謝水解產物中的發酵抑制劑的菌 種。
能夠進行木糖乙醇發酵的菌種較少，目前研究較為深入的尸/c/n力 s印他能發酵木糖且具有很高的乙醇產率P] ， Lohmder-Vogel等人研究 發現，P W^/fe對木質纖維素稀酸水解產物中的糠醛、羥甲基糠醛和乙 酸等抑制因子比較敏感[3]。只有少數酵母菌能耐受木質纖維素稀酸水解 產物中較高濃度的抑制因子，如&cc/zaram;;ces cemWw'ae TMB 3400 ， XcerevWae TMB 3006, Co"/oc/z從to //gm.aha NRRL30616等，但是它們 卻不能代謝木糖產乙醇[4，5]。水解產物中的抑制因子會影響微生物的生長 和發酵能力，其中糠醛和5-羥甲基糠醛(5-HMF)是最為主要的抑制因 子[6]。發酵前通常要對水解液進行脫毒處理，這就需要添加處理設備， 并要使脫毒設備與發酵工藝很好整合，因而提高了整個乙醇發酵工藝的 復雜性并提高了生產的成本[7]。
為了對木質纖維素稀酸水解產物進行原位脫毒(即該發酵菌種在進 行乙醇發酵的同時能高效代謝發酵液中的毒性物質，不需進行任何額外 的脫毒處理，乙醇發酵就能高效進行的發酵過程)及葡萄糖和木糖的乙 醇發酵，本發明人通過大量篩選工作得到一種高效代謝葡萄糖和木糖產 乙醇并高效代謝抑制劑的菌株尸/c/z^勸)7/to Y7，發明人嘗試使用該菌株 對木質纖維素稀酸水解產物進行原位脫毒乙醇發酵，以了解該菌對木質 纖維素稀酸水解產物進行葡萄糖和木糖原位脫毒的高效乙醇發酵，為進 一步應用提供基礎數據。
發明內容
本發明的目的在于提供一種樹干畢赤酵母新菌株(尸/c/7/a Y7保藏號為CGMCC No.2661。
本發明的另一個目的在于提供該菌株在木質纖維素稀酸水解液的 原位脫毒乙醇發酵中的應用。
本發明中菌株是在長期的木質纖維素水解液實驗過程中發現的，該 菌代謝旺盛，能夠高效利用水解液中的葡萄糖和木糖，能夠耐受高濃度 的抑制劑，是發酵技術流程的核心。該菌株已于2008年9月4曰在中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京巿朝陽區大 屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101 )保藏，分類命名為樹干 畢赤酵母(尸/c/2/a 'to )，保藏號為CGMCC No.2661 。
在實施例中，將本發明菌株在含有葡萄糖的YPD培養基中培養， 結果表明，乙醇的產率可達0.486 g/g糖，達到理論值的95.3%;在含 有木糖的YPD培養基中培養，結果表明，乙醇的產率可達0.42g/g糖， 達到理論值的83.2%。
在實施例中，將本發明菌株在含有糠醛抑制劑的YPD培養基中培 養，結果表明，4g/L的濃度對本發明菌株沒有起到明顯的抑制作用；在
在含有5-羥甲基糠醛的培養基中培養時，結果表明，該4g/L的濃度對
Y7的生長沒有任何影響。進一步，將這兩種抑制劑同時添加到YPD培 養基中，來考察其對本發明菌株的抑制作用，結果表明，YPD培養基中 加入3g/L糠醛和3g/L羥甲基糠醋時，Y7僅出現了 一個24h的生長延遲期。
在上述研究的基礎上，將Y7種子液10ml接種于100ml未經任何脫 毒處理的稀酸水解液中，30 。C、 150rpm培養，測定乙醇、糖的濃度。木 質纖維素稀酸水解液中的葡萄糖36h利用完，木糖72h利用完，乙醇產 量為32.53g/L,乙醇產率為0.47g/g糖，達到理論值的92.4%。
Y7用于木質纖維素稀酸水解液的原位脫毒乙醇發酵的發酵條件是 25~35°C、 (0 300)rpm，發酵24~96小時；發酵培養基為木質纖維素 稀酸水解液，酵母膏適量(其他生長因子也可代替)，蛋白胨適量(其 他可利用氮源也可代替)，Ca (OH) 2調節pH為4.5~6.0。取10mLY7 種子液加入裝有100mL水解液(加入酵母膏10g/L,蛋白胨10g/L， Ca (0H)2調節pH5.0)的三角瓶中，最佳發酵條件是150rpm， 3(TC培養， pH5.0-5.5。接種發酵時，種子液的活菌數宜在105-101()個/1111,接種量宜
在1~20% ( W/W )。
木質纖維素稀酸水解被認為是最容易實現商業化的生產工藝，但是
該水解工藝在產生可發酵糖的同時，還產生大量的對乙醇發酵微生物有 強抑制作用的抑制劑，所以水解液中的糖轉化為乙醇的原位脫毒方法成 為該乙醇生產工藝的瓶頸。本發明用尸/c/w'a Y7對木質纖維素稀
酸水解液進行原位脫毒乙醇發酵，取得了很好的結果，解決了以木質纖 維素為原料生產乙醇的瓶頸問題。
本發明菌株能將木質纖維素稀酸水解液中的葡萄糖和木糖高效轉 化為乙醇，達到乙醇最高理論值的92.4%,該結果在國內外還未見報道。
低乙醇生產成本。對木質纖維素乙醇生產的商業化具有重要的理論和實 際意義。
圖1顯示的是Y7對葡萄糖的乙醇發酵；
圖2顯示的是Y7對木糖的乙醇發酵；
圖3顯示的是Y7對葡萄糖和木糖混合糖的乙醇發酵；
圖4顯示的是Y7對耐糠醛的耐受；
圖5顯示的是Y7對5-羥甲基糠醛的耐受；
圖6顯示的是Y7對糠醛和5-羥甲基糠醛的耐受；
圖7顯示的是Y7對木質纖維素稀酸水解液的乙醇發酵。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限 制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件 所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知 的常規手段。
實施例l Y7的分離鑒定
1篩選過程
由本實驗室從酒精廠下水污泥中分離獲得，在加有糠醛和羥甲基糠 醛的YPD液體培養基中進行富集培養，然后在含有木糖的固體平板上 涂布分離出單菌落，經大量篩選后發現，其中一株代謝旺盛，能夠高效 利用水解液中的葡萄糖和木糖，能夠耐受高濃度的抑制劑，將其命名為 Y7，最后進行斜面保藏。 2形態特征
菌落光滑，菌體圓球形，較小，以二分裂方式繁殖，不產生假絲。3培養特征
在液體培養基中培養一段時間后，菌液渾濁，無絮凝現象。 4代謝特征
能夠快速利用木糖和葡萄糖產乙醇，同時能夠耐受高濃度抑制劑。
實施例2 Y7對木質纖維素稀酸水解液的原位脫毒乙醇發酵的鑒定 1材料和方法
U菌種
菌種尸/c/z/a S爭to Y7
1.2培養基(g/L)
YPD培養基葡萄糖20,酵母膏10,蛋白胨20, pH5.0~5.5。 發酵培養基酵母膏10,蛋白胨20。另外，根據不同的需要分別添
加葡萄糖,木糖(濃度以實際測定為準)pH5.0~5.5。
1.3木質纖維素稀酸水解液(g/L)
本研究所用木質纖維素稀酸水解液由華東理工大學提供，其中葡萄 糖為44.678,木糖24.35，糠醛1.37, 5-HMF0.47,乙酸IO， Ca(OH)2調節 水解液pH到5.0。 1.4菌種的培養
將菌種Y7接種于100mlYPD培養基中，30°C、 150rpm培養12h。 1.5乙醇發酵
Y7種子液(活菌數8x 1()8個/ml 9x 1。8個/ml) 10ml接種于100ml 發酵培養基以及100ml未經任何脫毒處理的稀酸水解液中，30 °C、 150rpm培養，測定乙醇、糖的濃度。 1.6耐抑制劑實驗
YPD培養基中分別加入不同梯度的糠醛，羥甲基糠醛以及糠醛和羥 甲基糠醛的混合物(比例為1: 1),定時取樣，樣品經稀釋測定菌液OD 值。
1.7分析方法
1.7.1糖濃度測定
高效液相色譜儀(Waters 2690 )測定糖濃度，色譜條件氨柱 (200x4.6mm)，柱溫40。C， waters410示差檢測器，流動相V(乙腈) V(水"80: 20,流速lmL/min,進樣量20pL。 1.7.2乙醇含量測定
氣相色譜儀(SP-3420)測定乙醇及糠醛和5-HMF的含量。乙醇測 定條件柱溫8(TC，注射室溫度15(TC,檢測器溫度50。C，進樣量0.5pL。
2結果和討論
2. 1葡萄糖、木糖、混合糖的發酵 2.1.1 Y7葡萄糖發酵特性
如圖l所示，在含有24.86 g/L的葡萄糖培養基中，葡萄糖12h利用 完，最大乙醇產量為12.08g/L,乙醇產率為0.486 g/g糖，達到理論值的 95.3%。
2丄2 Y7木糖發酵特性
如圖2 ,在含有23.81g/L木糖培養基中，木糖72h利用完，最大乙 醇產量為10.10g/L,乙醇產率為0.424 g/g糖，達到理論值的83.2%。
圖1和圖2可以看出，該菌能高效的代謝葡萄糖和木糖產乙醇，12 小時的葡萄糖乙醇發酵和72小時的木糖乙醇發酵達到了世界先進水平。 2丄3 Y7混合糖發酵特性
如圖3,在含有16.29g/L葡萄糖8.15g/L木糖的混合糖培養基中,葡 萄糖12h利用完，木糖36h利用完，最大乙醇產量為11.36g/L,乙醇產 率為0.465 g/g糖，達到理論值的91.2%。
由圖3可以看出，當葡萄糖和木糖同時存在時，葡萄糖促進了木糖
的轉化，僅需48小時即可將木糖轉化為乙醇。48小時完全轉化木糖成
乙醇，在國內外還未及見報道。
2.2 Y7對抑制劑糠醛和5-羥甲基糠醛的耐受
在了解了該菌利用葡萄糖、木糖、混合糖產乙醇特性的基礎上，進 一步闡明該菌乃抑制劑的能力，主要調查了該菌對糠醛和5-甲基糠醛的 降解能力。如圖4所示，Y7在YPD培養基中，能夠耐受的糠醛量達到 4g/L,但出現了 24h的延遲期，在3g/L時,延遲期僅為12h。
圖5顯示了在培養基中加入4g/L的5-羥甲基糠醛時，該抑制劑的 濃度對Y7的生長沒有任何影響。
如圖6所示,在YPD培養基中,同時加入4g/L糠醛和4g/L5-羥甲基糠 醛時，菌體生長受到了完全抑制，但在YPD培養基中加入3g/L糠醛和 3g/L羥甲基糠醛時，Y7僅出現了一個24h的生長延遲期。
2.3 Y7對木質纖維素稀酸水解液的原位脫毒乙醇發酵 在了解了該菌既能快速代謝葡萄糖和木糖產乙醇，又能高效代謝發
酵抑制劑的基礎上，接著，以木質纖維素稀酸水解液為乙醇發酵底物， 闡明該菌代謝木質纖維素稀酸水解液中的葡萄糖和木糖及代謝其中的 發酵抑制劑的實際應用的特性。如圖7所示，木質纖維素稀酸水解液中 的葡萄糖36h利用完，木糖72h利用完，乙醇產量為32.53g/L,乙醇產 率為0.471 g/g糖，達到理論值的92.4%。
實施例3 Y7對木質纖維素稀酸水解液的原位脫毒乙醇發酵
1種子液制備
在250mL三角瓶中加入100mL YPD液體培養基(葡萄糖20g/L,蛋白 胨20g/L,酵母膏10g/L),放入115t:滅菌鍋中滅菌25分鐘。挑取一 環單菌落接入三角瓶，150rpm，搖床30。C培養12小時。 2水解液的處理在水解液中加入蛋白胨(20g/L)，酵母膏(10g/L), Ca(OH)2調 節pH為5.0，放入115。C滅菌鍋中滅菌25分鐘。 3木質纖維素稀酸水解液發酵
取10mL Y7種子液(活菌數8 x 108個/ml ~9 x 108個/ml)加入裝有 水解液的三角瓶中，150rpm，搖床30。C培養。 4分析方法 4. 1糖濃度測定
高效液相色譜儀(Waters 2690 )測定糖濃度，色譜條件氨柱 (200x4.6mm)，柱溫4(TC， waters410示差檢測器，流動相V(乙腈) V(水)-80: 20,流速lmL/min,進樣量20pL。 4. 2乙醇含量測定
氣相色譜儀(SP-3420)測定乙醇及糠醛和5-HMF的含量。乙醇測 定條件柱溫80°C，注射室溫度15(TC,檢測器溫度50 °C，進樣量0.5pL。 5發酵結果
如圖7所示，木質纖維素稀酸水解液中的葡萄糖36h利用完，木糖 72h利用完，乙醇產量為32.53g/L,乙醇產率為0.471 g/g糖，達到理論 值的92.4%。
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權利要求
1、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)Y7CGMCC No.2661。
2、 權利要求1所述的菌株在木質纖維素稀酸水解液的原位脫毒乙醇 發酵中的應用。
3、 一種木質纖維素稀酸水解液的原位脫毒乙醇發酵方法，其特征在 于使用權利要求1所述的菌株進行發酵。
4、 如權利要求3所述的方法，其特征在于將權利要求1所述的菌株 制成種子液，接種含木質纖維素稀酸水解液的發酵培養基，進行發酵， 發酵條件是25~35°C、 0 300rpm,發酵24~96小時；發酵培養基為 木質纖維素稀酸水解液，酵母膏適量，蛋白胨適量。
5、如權利要求4所述的方法，其特征在于，發酵條件是3(TC、150rpm, 發酵72小時；發酵培養基為木質纖維素稀酸水解液，酵母膏10g/L,蛋 白胨20g/L。
6、如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，種子液的活菌數 為105-101()個/1111,接種量為1%~20%。
全文摘要
本發明提供了一種采用單一菌種對木質纖維素水解產物的原位脫毒乙醇發酵方法。為此，本發明首先提供了一種樹干畢赤酵母(Pichia.Stipitis)新菌株Y7，保藏號為CGMCC No.2661，實驗表明，該菌株能夠對木質纖維素稀酸水解產物進行原位脫毒，其能將木質纖維素稀酸水解液中的葡萄糖和木糖高效轉化為乙醇，達到乙醇最高理論值的92.4％。利用該菌株可以簡化以木質纖維素為原料生產乙醇的工藝、降低乙醇生產成本，對木質纖維素乙醇生產的商業化具有重要的理論和實際意義。
文檔編號C12N1/16GK101353629SQ20081022330
公開日2009年1月28日 申請日期2008年9月24日 優先權日2008年9月24日
發明者楊秀山 申請人:首都師范大學