專利名稱：：黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法
技術領域：
：本發明專利屬于生物技術工程領域，特別是涉及一種植物病毒黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cwcw附6ermoW/e附(wa/cv/nw，CGMMV)的'決速檢領!l方法。
背景技術：
：黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cwcww6ermoW/emo抑/cv/n/s，CGMMV)是一種正單鏈RNA病毒，屬煙草花葉病毒屬(7b6a/nov/n^),主要分布在羅馬尼亞、波蘭、丹麥、英國、芬蘭、德國、前蘇聯、希臘克里特島、中國臺灣、日本、韓國、印度、伊朗、沙特阿拉伯、以色列、巴西等地。在自然界該病毒主要侵染葫蘆科作物，引起葉片斑駁、灼泡狀和畸形，并伴隨植株生長矮化，是葫蘆科作物上最具威脅的植物病毒病害。CGMMV侵染黃瓜引起葉片斑駁、水泡及變形，植株矮化、結果延時甚至導致不孕，果實大部分黃化或變白并產生黑綠色水皰狀的壞死斑，產量損失達15%以上；在前蘇聯的Georgia地區，黃瓜發病率達80100%。CGMMV早期侵染的西瓜(Citrullusvulgaris)植株生長緩慢，出現花葉，果實中嚴重變色或果實內部造成腐爛，果肉纖維化，果實產量下將30%。在中國，2002年首次從日本引進的種苗中截獲CGMMV，2004年廈門動植物檢疫局又從日本進口的南瓜種子上檢測到CGMMV。2005年遼寧省蓋州市感染CGMMV的西瓜面積達333hm2，絕收的13hm2。2006年12月21日農業部發布788號公告，將黃瓜綠斑駁花葉病毒確定為全國農業植物檢疫性有害生物，屬國家三類檢疫性病害。CGMMV可經多種途徑傳播，以種子傳播和接觸性傳染為主要傳播途徑。隨著種子運輸，病毒可長距離傳播到新的地區或國家，給當地農業生產帶來很大的威脅，如日本從印度進口帶毒的葫戶種子，導致該病毒在日本定殖擴散，給日本的葫蘆科作物的生產帶來毀滅性的打擊。因此，加強種子帶毒檢測，建立CGMMV的快速、準確、可靠的檢測方法，對于防止該病毒進一步擴散，保護農業生產，具有十分重要的意義。目前傳統的生物學、血清學、電子顯微鏡技術和反轉錄PCR等檢測方法都各有優缺點。反轉錄PCR作為一種比血清學更加靈敏的技術，可以對CGMMV進行準確的檢測。實時熒光定量PCR技術是近年新發展起來的一項檢測技術，是反轉錄PCR技術的延伸，它通過監測每個擴增循環中所收集的熒光信號，可以實時的、定量的檢測目的基因，該方法在病毒的定量評估研究中顯示了巨大的潛力，在植物病毒檢測領域已得到了廣泛的應用。因此，本發明利用實時熒光定量PCR技術，建立一套快速、簡便、準確、靈敏的CGMMV定量檢測方法，并應用此方法對西瓜種子攜帶的CGMMV進行了檢測。
發明內容基于上述研究領域中的空白，本發明提供了西瓜種子攜帶的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測技術，為植物病毒檢測提供了一種新方法。黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，采用一步實時定量RT-PCR反應，其特征在于耙基因為CGMMV分離物CP基因。所述RT-PCR反應體系中的引物對和探針為引物對CGMMV-F:CCAGACTCAAGCGGGAAGAG，CGMMV-R:TCTACGACAGACGAGGGTAACG，探針CGMMV-T:5、FAMTTCTTTCCGCGAGTCCCTGTBHQ-13、。所述RT-PCR反應體系為2倍反應緩沖液1ExTaq聚合酶(5U4U)0牟預制反轉錄反應液0牟上游引物(l(HiM)0.2^1下游引物(10pM)0，探針(10nM)0.2pl總RNA2(xl水6牟總體積20^1所述RT-PCR反應條件為42'C反轉錄5min;95'C變性5s;95°C10s，60°Clmin，45個循環。所述黃瓜綠斑駁花葉病毒為西瓜種子攜帶的黃瓜綠斑駁花葉病毒。本發明選用CGMMV分離物CP基因作為靶基因，利用反轉錄PCR擴增方法，在同一反應體系中加入引物對CGMMV-F、CGMMV-R和探針CGMMV-T進行實時熒光定量檢測。本發明方法快速，準確，可靠，對于防止種子病毒的進一步擴散，有很重要的意義。圖1CGMMVCP擴增電泳圖，其中泳道l:DL2000;泳道2，3:CGMMVCP基因的擴增產物圖2引物和探針濃度的優化，橫坐標PCR循環數；縱坐標PCR反應熒光信號相對強度，其中令引物和探針濃度均為0.2nmol/L;T:引物濃度0.2pmol/L,探針濃度0.4pmol/L，■:引物濃度0.1nmol/L，探針濃度0.1nmol/L。圖3CGMMVCP標準曲線擴增圖橫坐標PCR循環數；縱坐標PCR反應熒光信號相對強度曲線自左至右模板中CGMMVCP拷貝數依次為500000，50000，5000，500,50。圖4CGMMVCP標準曲線橫坐標拷貝數LOG對應數值；縱坐標Ct值。圖5CGMMV標準曲線擴增圖，橫坐標PCR循環數；縱坐標PCR反應熒光信號相對強度。圖6CGMMV標準曲線橫坐標拷貝數LOG對應數值；縱坐標Ct值。圖7CGMMV分離物CP基因比對序列具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。下述實施例中所用方法如無特殊說明均為常規方法。1.實驗選用的材料1.1供試樣品CGMMV種子標樣為本組保存的各地區植保站送檢的西瓜種子，健康對照為健康植株的種子。1.2主要試劑RNAisoPlus購自TaKaRa公司。限制性內切酶S>na/，￡co//，5am/f/購自NewEnglandBiolabs公司。IPTG、X-Gal、氨芐青霉素、B型小量質粒快速提取試劑盒、B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒及A型質粒大量快速提取試劑盒均為博大泰恒公司產品。AxyPrepPCR清潔試劑盒購自Axygen公司。ExTaqDNA聚合酶、dNTP、RNase、RNAisoReagent(總RNA提取試劑)、TranscriptRNACleanUpKit、DL2000DNAMarker、RNAMarkerRLIOOOO、RNAMarkerRLIOOO、EASYDilution,OneStepPrimeScriptRT-PCRKit為TaKaRa公司產品。M-MLVReverseTranscriptase、pGEM-TEasyVectorSystemI，RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7購自Progenia公司。硝基苯磷酸鈉購自Sigma公司。電泳用瓊脂糖為西班牙進口產品。其他常用化學試劑購自北京試劑公司。2.本發明設計和引用的引物與探針在熒光定量檢測中，靶基因的選擇很重要。本發明在本實驗室近兩年對全國不同地區CGMMV分離物CP基因序列分析的基礎上，選定了序列比較保守的CP基因作為熒光定量檢測的靶基因。并通過對NCBI上登陸的所有CGMMV分離物CP基因序列進行比對(見圖7,同源性達97.7%),找到序列保守區域。然后利用Primerexpress2.0進行引物和探針的設計。將候選的幾組組合分別于所有CGMMV分離物CP基因序列進行比對，篩選出最合適的一組。設計的探針5'端用FAM(6-carboxyfluorescein)熒光素標記作為報告基因，3，端用BHQ-1(BlackHoleQuencher1)作為淬滅基團。引物探針均由北京英俊基因技術有限公司負責合成標記，設計的引物序列見表l。表1CGMMV的引物和探針編號用途位置序列及熒光標記基團CGMMV-CP-FCGMMV克隆片段的檢測引上游ATGGCTTACAATCCGATCACACC物CGMMV-CP-RCGMMV克隆片段的檢測引下游CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC物CGMMV-SCGMMV克隆片段的檢測引下游CCCGGGCTAAGCTTTCGAGGTG物CGMMV-FCGMMV實時定量PCR檢測上游CCAGACTCAAGCGGGAAGAG引物CGMMV-RCGMMV實時定量PCR檢測下游TCTACGACAGACGAGGGTAACG引物CGMMV-TCGMMV實時定量PCR檢測探針5'(FAM)探針TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ-1)3、3西瓜種子總RNA的提取種子樣品總RNA的提取是定量檢測中關鍵的一步，其純度、質量直接影響定量檢測結果，而西瓜種子含有大量多糖，提取純度較高的總RNA難度很大。本發明在植物葉組織RNA提取的基礎，建立了一套用于西瓜種子總RNA提取的方法。通過該方法可以抽提得到適合定量檢測的西瓜種子總RNA。在種子RNA抽提過程中，適當的加入高鹽溶液處理多糖多酚，在RNA溶解后，再次低溫離心，進一步剔除多糖。RNA純化的具體步驟如下取單粒西瓜種子，加液氮研磨，加入1ml的RNAisoplus(TaKaRaBiotechnology)進一步研磨并移至離心管中。12000rpm，4'C離心5min，將上清轉移至新的離心管；在上清中加入O.lml5MNaCl和0.3ml氯仿，振蕩混勻，12000rpm，4'C離心15min;將上清再轉移至新管，加入1/2體積的異丙醇和1/2體積的高鹽溶液，室溫靜置10min;12000rpm，4'C離心10min，75%乙醇洗滌沉淀物；12000rpm，4"離心5min，棄上清，將沉淀物干燥并溶于50pl的DEPC處理的TE中，1%普通凝膠電泳檢測RNA質量。4.CGMMVCP基因的擴增、克隆和測序以上述西瓜種子總RNA為模板，CGMMV-CP-F/CGMMV-CP-R為引物，進行RT-PCR擴增，得到約500bp的PCR產物，經過PCR產物的純化、與pGEM-TEasy載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞(JM10)、以及陽性克隆的篩選、鑒定，得到了陽性克隆。序列分析結果表明PCR產物長度為486bp。與GenBank中搜索到的CGMMV韓國甜瓜分離物(登陸號AF417243)、CGMMV韓國西瓜分離物(登陸號AF417242)、CGMMVSH分離物(登陸號D12505)和W分離物(登陸號AB015146)，以及本實驗室測定的CGMMV中國遼寧分離物(登陸號EU352259)序列比較分析結果表明本發明測定的分離物和上述分離物CP基因核苷酸序列一致性在96.1%左右，說明我們得到了正確的CGMMVCP基因序列。5.CGMMVCP基因的體外轉錄和RNA的純化5.1帶酶切位點的CGMMVCP基因的擴增、克隆片段正向插入的重組質粒的構建以上述含有正確序列的重組質粒為模板，以CGMMV-CP-F/CGMMV-S為引物對，PCR擴增3'末端帶有SmaI酶切位點的CGMMVCP基因。回收純化486bp的PCR產物，與pGEM-TEasy載體連接，轉化感受態細胞JMllO、以及陽性克隆的篩選、鑒定、序列分析，得到了CP基因片段正向插入克隆載體的重組質粒，命名為pT-CP500，該重組質粒經過線性化處理后可用于后期體外轉錄反應的模板。5.2重組質粒的大量制備將上述含有目的片段正向插入的重組質粒pT-CP500重新轉化大腸桿菌JMllO、涂平板培養、挑取單菌落，進行質粒的大量擴繁，利用博大泰恒公司的A型質粒大量快速提取試劑盒純化質粒，操作參照試劑盒說明，并通過凝膠電泳檢測質粒質量。5.3重組質粒的線性化、脫鹽純化及定量重組質粒線性化處理:重組質粒pT-CP500在25°C條件下，Smal酶切16小時，待完全酶切線性化后65'C溫育10min中止反應。酶切體系如下反應緩沖液5|ilSmal內切酶lpl載體DNA2嗎加水至50nl線性化的質粒作為體外轉錄的模板之前是必須進行脫鹽濃縮處理的，以保證體外轉錄反應能夠順利充分的進行。酶切反應產物采用Axygen公司的AxyPrepPCR清潔試劑盒進行脫鹽濃縮，具體步驟參照試劑盒進行。經純化的酶切產物，用H20或TE適當稀釋后，用NanoDropND-1000核酸蛋白測定儀(NanoDropTechnologies,USA)測定260nm與280nm處的光吸收值，A260/A280值應在1.82.0之間。根據A260值，以A26(M時，雙鏈DNA濃度為50ug/mL標準，計算DNA樣品的濃度。后述體外轉錄反應要求線性化質粒脫鹽濃縮后，質粒濃度應大于0.5mg/ml。5.4體外轉錄體外轉錄反應要求模板的A260/A280必須在1.8-2.0之間，質粒序列的3'端用合適的平末端限制性內切酶切斷質粒，否則T7RNA聚合酶轉錄RNA的效率非常低。本發明中以純化的線性質粒作為模板，在T7RNA聚合酶作用下，采用Promega公司的RiboMAXLargeScaleRNAProducitonSystems-T7試劑盒進行體外轉錄體外轉錄生成RNA。標準的體外轉錄反應為100ul，室溫下順序加樣制備下列反應體系，混勻后，37'C恒溫反應24h。隨后，采用TaKaRa公司的TranscriptRNACleanUpKit對體外轉錄的RNA產物進行純化，具體操作步驟參照試劑盒說明，并電泳檢測體外轉錄物的質量。體外轉錄的反應體系T7體外轉錄反應緩沖液20^1rNTPs(25mMATP,CTP，GTP，UTP)30nl線形化DNA(510ug)40nlT7體外轉錄酶10^1總體積lOOpl6.CGMMV—步實時定量RT-PCR標準曲線的制作6.1CGMMV—步實時RT-PCR反應體系的優化為了盡量避免試劑配制中污染和誤差，CGMMV實時PCR反應采用TaKaRa公司的OneStepPrimeScriptRT-PCRKit。一步法RT-PCR比較兩步法RT-PCR更能保證定量檢測樣品間的穩定性，而采用預混試劑可以簡化實驗操作并減少污染。本發明對OneStepRealTimeRT-PCR反應進行了優化，引物和探針濃度的組合如下ABC2倍反應緩沖液軍，1ExTaq聚合酶(5U/pl)O牟0.4nl預制反轉錄反應液0.4^10.4^10.4nl上游引物(lOpM)O.化lO.化l0.2nl下游引物(10nM)O牟0.4^10.2pl探針(10nM)0.8^10.4pl0.2^1總RNA2^12pl2pl水5.6^16pl總體積20^120^120[il反應參數42。C反轉錄5min;95'C變性5s;95°C10s，60°Clmin，45個循環。擴增結果表明引物和探針的濃度均為0.2pmol/L時擴增信號最強，當探針濃度提高至0.4timol/L時信號反而降低，而引物和探針的濃度分別為0.1nmol/L;0.1nmol/L時擴增信號最弱。(圖2)6.2CGMMV—步實時定量RT-PCR標準曲線的制作本發明配制的標準曲線是從500000~50拷貝的ssRNA片段序列，其目的片段550bp，RNA的濃度是1.5ng/nl，PCR反應中所用的RNA體積是用2pl/管。以ssRNA為模板，進行一步法實時RT-PCR擴增，每個梯度設置3個重復，以EASYDilution作為模板定義為空白對照制備標準曲線(圖3)，標準曲線見圖5。結果顯示，模板中ssRNA拷貝數從50到500000，均得到了成功的擴增，而且具有良好的重復性(表2)，達到了制作標準曲線的要求。這說明本發明采用的檢測體系，只要在2ul的模板中有50拷貝的靶基因時就能檢測到，并可根據標準曲線進行CGMMVCPRNA的定量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以Ct值為縱坐標，基因拷貝數的對數值為橫坐標做標準曲線，二者的回歸方程為Y=-3.232X+41.030，R=1.000,PCR擴增效率為103.9%，Ct值從22.52到35.76個循環(圖4)。一般情況下斜率只要在-3.0-3.6即可滿足RealTimePCR對擴增效率的要求，-3.3時最理想。本發明制備的標準曲線的斜率為-3.232，完全符合實驗要求，表明該反應體系是可行的。本發明建立的針對CGMMVCPRNA的一步法實時定量RT-PCR標準曲線定量范圍是從50拷貝到500000拷貝。曲線斜率均在-3.0-3.6之間，這表明所建立的標準曲線是可靠的。在實際檢測定量過程中，可以根據未知樣品的大體濃度范圍，適當調整標準曲線的定量范圍。7.—步實時定量RT-PC方法檢測種子攜帶CGMMV以單粒西瓜種子總RNA為模板，應用本發明建立的一步實時定量RT-PC方法對未知濃度樣品(本實驗室保存的CGMMV侵染的西瓜種子標樣)中CGMMVCPRNA進行了定量分析，擴增圖和標準曲線見圖5，圖6。本次制備的標準曲線的樣品拷貝數分別為200，500，5000，50000，500000，成功的進行了擴增，標準曲線的回歸方程為y=-3.265x+38.464，r=0.991，建立的標準曲線符合實驗要求，另外，經稀釋的未知濃度的樣品也全部落在了標準曲線范圍內(見圖6)，因此可直接通過標準曲線確定未知樣品中CGMMVCPRNA的數量。本發明對10個種子標樣進行了檢測，根據Ct值(表3)可以看出IO個種子樣品全部檢測到CGMMVCPRNA，且含量較高，檢出率為100%。但常規的RT-PCR僅檢測到6個陽性樣品，檢出率為60%。這說明本發明建立的檢測技術叫常規的RT-PCR靈敏。表3種子中CGMMVCPRNA的定量Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>附錄引物對CGMMV墨F:5，-CCAGACTCAAGCGGGAAGAG-3，CGMMV-R:5，-TCTACGACAGACGAGGGTAACG-3'探針CGMMV-T:5，-(FAM)TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ－l)-3,權利要求1.黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)的快速檢測方法，采用一步實時定量RT-PCR反應，其特征在于靶基因為CGMMV分離物CP基因。2、根據權利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，RT-PCR反應體系中的引物對和探針為引物對CGMMV-F:5，-CCAGACTCAAGCGGGAAGAG-3，CGMMV-R:5，-TCTACGACAGACGAGGGTAACG-3'探針CGMMV-T:5，-(FAM)TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ-1)-3，。3、根據權利要求2所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，所述RT-PCR反應體系為:2倍反應緩沖液ExTaq聚合酶(5U4d)o牟預制反轉錄反應液0.4^1上游引物(lOpM)0.2^1下游引物(l(HiM)0.2^1探針(10^iM)0.2pl總RNA2(xl水6.6^1總體積20^14、根據權利要求3所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，所述RT-PCR反應條件為42。C反轉錄5min;95。C變性5s;95。C10s，60°Clmin，45個循環。5、根據權利要求1所述的黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，所述黃瓜綠斑駁花葉病毒為西瓜種子攜帶的黃瓜綠斑駁花葉病毒。全文摘要本發明涉及“黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法”，屬于生物技術工程領域。黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測方法，采用一步實時定量RT-PCR反應，其特征在于靶基因為CGMMV分離物CP基因。同時本發明對RT-PCR的反應體系和條件作了優化。本發明方法快速，準確，可靠，對于防止種子病毒的進一步擴散，有很重要的意義。文檔編號C12Q1/70GK101368217SQ20081022239公開日2009年2月18日申請日期2008年9月18日優先權日2008年9月18日發明者艷劉,周廣和,珣張,莉李,王錫鋒申請人:中國農業科學院植物保護研究所