專利名稱：：熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏工程菌及其構建方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
及環境工程領域，具體涉及一種熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏工程菌及其構建方法。技術背景-染料和染料廢水對環境的污染以及對人類的危害已廣為世人所關注，己經成為全球性的生態環境問題。控制和消除這一污染已引起各國學者的高度重視。實踐證明，厭氧一好氧生物強化處理體系是最經濟有效的技術。生物強化技術的實現途徑有①投加有效降解的微生物；②優化現有處理系統的營養供給；③投加基因工程菌。目前，印染廢水處理生物強化最為普遍的方式為直接投加經過篩選、馴化后對目標污染物具有降解能力的微生物。這種方式整體水平上效率低、脫色率不高、脫色范圍單一、處理時間長。偶氮、蒽醌和三苯基甲烷類染料是目前應用最為廣泛的三大類染料。脫色希瓦氏菌^co/ora"om》S12是本發明人的研究團隊分離的、已在實驗室水平和工程實踐中證明的可有效進行生物強化的優秀高效菌株，該菌株對目前應用廣泛的偶氮和蒽醌兩大類染料的脫色能力較強，但對三苯基甲垸染料脫色能力較弱。嗜水氣單胞菌^^0附0"^/23^"印/7/&subspDN322是本發明人的研究團隊從印染廢水處理廠的活性污泥中分離到的一株對結晶紫、堿性品紅、燦爛綠及孔雀綠等多種三苯基甲烷類染料具有高效脫色能力的嗜水氣單胞菌。從該菌中分離到一種新的三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD，三苯基甲垸類染料脫色酶TpmD蛋白分子量為58.8kDa，等電點為5.6。酶蛋白是由兩個相同分子量的亞基組成的二聚體，每個亞基的分子量為29.4kDa。該酶能夠催化結晶紫、堿性品紅、燦爛綠及孔雀石綠等多種三苯基甲烷類染料脫色降解，對底物具有結構專一性，能夠高效脫色降解三苯基甲烷染料的菌株，但由于這類菌對魚類、蛙類具有潛在的致病性，從而限制了該菌株在環境生物修復中的應用。因此構建能夠應用于實現生物強化的具有脫色范圍廣、脫色效率高、遺傳穩定性好的新的基因工程菌顯得非常必要。由于目前生物強化用基因工程菌(geneticallyengineeredmicroorgantsms，GEMS)在各種處理系統中的存活情況和時空數量變化的監控和追蹤仍然是目前的技術難點，因此賦予遺傳穩定性好、降解效率高、降解范圍廣的基因工程菌可示蹤性對于生物強化技術進一步發展具有重要意義。
發明內容-本發明的目的是在對脫色希瓦氏菌S12和嗜水氣單胞菌DN322對不同染料的脫色特點研究的基礎上，通過基因工程技術，提供一種對偶氮、蒽醌和三苯基甲垸類染料三大類染料都具有高效脫色能力，并且具有熒光示蹤功能的基因工程菌及其構建方法。本發明通過下述方案予以實施的本發明所述的熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏工程菌是將外源基因整合進入染色體中，所述的外源基因是融合基因5"尸r^M7^T，所述的融合基因57t^D^r是在脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子序列5Pr之后連接三苯基甲烷染料脫色酶修飾基因t/M/T構成，所述的三苯基甲垸染料脫色酶修飾基因，是在三苯基甲烷染料脫色酶基因^歷"的5'端起始密碼子ATG前加有SD序列，在3'端終止密碼子之前加有能螯合雙砷熒光染料的編碼6個氨基酸(CCPGCC)的小標簽，所述的序列如SEQ1所示，所述的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子序列如SEQ2所示，所述的SD序列如SEQ7所示，所述的螯合雙砷熒光染料編碼CCPGCC六個氨基酸的堿基序列如SEQ6所示，所述的工程菌能分泌能螯合雙砷熒光染料的三苯基甲垸染料脫色酶。所述的熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏菌工程菌的構建方法，其步驟如下-a)/pw"'序列的獲取應用PCR技術，以嗜水氣單胞菌DN322的DNA為模板，擴增出三苯基甲烷染料脫色酶基因^m"，在其5'端的起始密碼子前加有SD序列，在其在3'端終止密碼子之前加螯合雙砷熒光染料的編碼CCPGCC六個氨基酸的堿基序列，將此序列命名為/pwD'。b)脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子SiV的獲取以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板PCR擴增NAD(P)H脫氫酶基因的啟動子序列。c)片段五E4的獲取以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板，PCR擴增而得片段五E4。d)片段五FS的獲取以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板，PCR擴增而得片段5i^。e)5TV伊wD'的構建利用TP-PCR技術，在伊w"'序列5'端前加脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子S/V，從而構建成S/V伊w"'。f)五E4S戶n^wD'的構建利用TP-PCR技術，在S尸W/mD'的5'端前加片段而構建成。g)EFAS7V^7wZ)'fF5的構建，利用TP-PCR技術，在￡化5TV伊wD'的3'端加片段￡F5。h)將構建好的￡E4SPn^m￡電擊轉化到脫色希瓦氏菌S12中。i)利用同源重組使￡E4SiV^w￡>'￡i^整合到脫色希瓦氏菌S12基因組染色體。j)通過PCR驗證，脫色能力測定，熒光篩選，獲得脫色希瓦氏菌S12基因工程菌。所述的片段EFA是脫色希瓦氏菌S12—不編碼蛋白的基因間區上半部分，其序列如SEQ3所示，所述的片段是脫色希瓦氏菌S12—不編碼蛋白的基因間區下半部分，其序列如SEQ4。所述的PCR驗證篩選是通過以熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏菌S12工程菌的基因組DNA為模板PCR擴增五E4Si^/7wD'五F5,SiW;mZ)'，^附"'片段測定分析的，選取能同時擴增出^T^S7^;wZ)'五F5,S7V(pwZ)',/pm"'片段的菌株為目的菌株。所述的脫色能力篩選是通過將脫色希瓦氏菌S12基因工程菌對偶氮、蒽醌和三苯基甲烷類染料進行脫色能力測定，選取對偶氮、蒽醌和三苯基甲烷類染料具有高效脫色作用的為目的菌株。所述的熒光篩選是通過顯微鏡對脫色希瓦氏菌S12基因工程菌進行分析的，選取具有四半胱氨酸一雙砷熒光標記的菌株為目的菌株。用于本發明的嗜水氣單胞菌DN322和脫色希瓦氏菌S12，其中嗜水氣單胞菌DN322己經在文獻中公開記載(參考文獻"細菌脫色酶7>mD對三苯基甲垸類染料脫色的酶學特性研究"，任隨周，郭俊，王亞麗，岑英華，孫國萍微生物學報，第46巻第3期，第385389頁，2006年4月；"細菌脫色酶的酶學特性研究"，任隨周，郭俊，王亞麗，岑英華，孫國萍微生物學報，第46巻第5期，第823826頁，2006年10月)，其中脫色希瓦氏菌S12也在文獻中公開記載(參考文獻"脫色希瓦氏菌(幼ewa"e〃a^co/ora"om》S12的脫色特性"，許玫英，鐘小艷，曹渭，郭俊，岑英華，孫國萍；微生物學通報，第32巻第1期，第5-9頁，2005年)上述兩微生物本申請人持有，并且保證可以在本發明申請日起20年內向公眾提供。本發明構建的熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏菌S12工程菌通過實驗證明，該細菌具有脫色范圍廣，對偶氮、蒽醌和三苯基甲垸三大類染料都具有脫色作用，并且具有脫色效率高，其對上述三種染料脫色能力與嗜水氣單胞菌DN322對三苯基甲烷染料和脫色希瓦氏菌S12對偶氮和蒽醌類染料的的脫色能力相當，遺傳穩定性好等優點。由于選擇的是S12染色體上一段沒有功能的區域作為同源重組位點，這樣不會對脫色希瓦氏菌S12的任何功能造成破壞和影響,同時又利用了S12自身的組成型強表達基因的啟動子來啟動外源基因的表達，這樣既不會造成表達量不夠的問題,也解決了表達量太高而造成的對宿主菌的傷害的問題,能夠安全的對環境中的染料進行脫色，由于熒光示蹤標記的加入，使得能夠對工程菌在處理系統中的存活情況和時空數量變化進行監控和追蹤，精確的控制處理系統，使其在生物強化應用時的跟蹤和檢測更為方便、快捷。-圖1是PCR產物電泳分析圖，圖中，Ml:DNAMarker(DL5000);P+T，Spr和tpmD，的連接產物；EFA:EF383142A的PCR產物；EFB:EF383142B的PCR產物；EFAPTEFB:EFA，SPrtpmD，，EFB3個片段的連接產物；M2:DNAMarker(DL2000);圖2是PCR產物電泳圖，圖中，Ml:DNAMarker(DL5000);1:以脫色希瓦氏菌S12-tpmD'-l基因組為模板，S.Viq，S.Vxlown為引物擴增的PCR產物；2:以脫色希瓦氏菌S12-tpmD，-79基因組為模板，S.Viq，S.Vdown為引t/T增的PCR產物；3:以S12-1pmD，-91基因組為模板，S.Vup，S.Vdown為引物擴增的PCR產吻；4:以脫色希瓦氏菌S12基因組為模板，S.Vup，S.Vdown為引牧擴增的PCR，；5:以脫色希瓦氏菌S12-1pmD'-l基因組為模板，EF383142AF，EF383142BR為引牧)T增的PCR產物；6:以脫色希瓦氏菌S12-^mD'-79基因組為模板，EF383142AF，EF383142BR為引t)T增的PCR產物；7:以脫色希瓦氏菌S12-1pmD，-91基因組為模板，EF383142AF，EF383142BR為引物擴增的PCR，；8:以脫色希瓦氏菌S12基因組為t難，EF383142AF，EF383142BR為引4姊廣增的PCRJ^勿；9:以脫色希瓦氏菌S12-1pmD'-l基因組為t鎌，prometerEF，TpmDC4ER為弓物的PCR，；10:以脫色希瓦氏菌S12-扭iD'-79基因組為模板，ptometerEF，TpmDC4ER為引t/T增的PCR產物；11:以脫色希瓦氏菌S12-1pmD'-91基因組為模板，prometerEF，TpmDC4ER為引牧擴增的PCR產物；12:以脫色希瓦氏菌S12基因組為模板，prometerEF,TpmDC4ER為引物擴增的PCR產物；M2:DNAMarker(DL2000);圖3是米氏酮、DMAP、NADH的混合物為混合標樣的HPLC的分析圖；圖4是脫色希瓦氏菌S12-tpmD'-l對結晶紫的糊率中間產物的HPLC的分析圖；圖5是脫色希瓦氏菌S12-1pmD'-l對結晶紫的,產物的HPLC的分析圖；圖6是脫色希瓦氏菌S12書mD'-l菌體四半胱氨酸一雙砷熒光標記顯微鏡照片(1000x);圖7是脫色希瓦氏菌S12菌體四半胱氨酸一雙砷熒光標記顯微鏡照片(1000x);具體實施例方式本實施例是對本發明的進一步解釋，不是對本發明的限制。實施例1(1)常規方法提取脫色希瓦氏菌S12和嗜水氣單胞菌DN322的總DNA。(2)脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子序列5^"的獲取。根據幼ewawe/Zasp.ANA-3基因組序列數據，第0316閱讀框的Promoter序歹i」，設計引物上游引物prcmeterEF:5'TmTCnT丄.丄TATGGGCTA3，；下游引物prometerER:5'nTAGACATAATCTGCTCCG3，；以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板，PCR擴增NAD(P)H脫氫酶基因的Promoter序列，命名為SiVZ)iVowofe/YSiV入PCR反應條件為:95'C變性4min后進入30個循環93'C變性30s，43。C退火30s，72°C延伸45s，最后延伸7min，擴增產物為98bp，電泳圖見圖1。(3)修飾的^mZ)基因片段^wZ)'的獲取根據^mZ)基因序列，設計上下游引物為/p附"EF:CACCTAAGAAGGAGATATACATCCCATGATGTCAATTGCGGTG,"C4ER1:CTTGCAACAACCAGGGCAACATGCAGCCATTTTCAGGGCTTG在上游引物5'端含有SD序列，下游引物含有可結合雙砷熒光染料的兩對半胱氨酸的編碼序列(引物0mDEF中斜體加下劃線的為SD序列，弓|物TpmDC4ERl中斜體加下劃線的為含編碼CCPGCC的序列)。PCR擴增體系總體積為(100pL):超純水73.5pL，10xPCRbufferlO^L，2.0腿ol/LdNTP8pL,TpmDEF引物2pL，TpmDC4ERl引物2pL，1U/nLTaq酶2.5pL，菌株DN322的總DNA稀釋50倍后取2nL，反應為30個循環，94'C預變性5min后進入30個循環:94'C變性45s，52。C退火45s，72。C延伸lmin30s，最后72。C延伸10min。回收擴增出來的919bp的產物，將其命名為^m"'。(4)SiV和/;wZ)'兩片段的融合連接設計引物Bridge:5'GCCCATAAAAAAGAAAAAGGGGGAGGTATTGAGAAG3'，該引物與prometerEF和TpmDC4ERl進行三引物PCR擴增。擴增體系總體積為(50pL):超純水35pL,10xPCRbuffer5pL(whhMgCl2),10.0mmol/LdNTP2pL,引物prometerEF和TpmDC4ERl的終濃度為20pM,而引物bridgel的終濃度則為50nM,10UpfiiTaq酶，模板Promoter和/pwD'各1.0nL(100ng4iL)，PCR反應條件為94°C預變性5min后進入30個循環94。C變性lmin，52。C退火l.Omin，72。C延伸2.0min，最后72°C延伸10min。回收1017bp的PCR產物，將其命名為SiV(pmZ)'，其電泳圖見圖1。將PCR反應擴增獲得的融合基因片段S/V印mZ)'克隆到pMD18Tsimple載體中，轉化大腸桿菌Eco/ZDH5a，獲得的陽性克隆抽提質粒委托上海生工生物工程技術有限公司測序，其序列如SEQ5所示，其中1—98位核苷酸是脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因Promoter序列SiVDPromo"r(SiV);106—123位核苷酸為SD序列；127—987位核苷酸為0mD基因閱讀框終止密碼子之前的序列；988—1014位核苷酸為編碼CCPGCC的堿基序列；TGA為終止密碼子，測序結果完全符合預期,命名為SP邵mZ)',并予以保存。(5)五KWWZ4和五F3S3W2S的獲取￡383142序列是根據希瓦氏菌屬模式菌株5/^>^"6//0o"e/cfe"^sMR-1全基因組序列中8位于基因SO0500和SO0501間的一段1300bp不編碼蛋白的基因間區序列設計引物，然后從S12中PCR擴增出來的，其全長為1012bp，其登陸號EF383142。其中￡/^<^24是EF383142上半部分的555bp的堿基，其序列如SEQ3所示，而EF383142B是EF383142的下半部分的441bp的堿基，其序列如SEQ4所示。(a)￡/^<7424的獲得設計引物EF383142AF:5，>AACAACCGATAGCAAGC<3，，；EF383142AR:5，>GGGGGAGGTATTGAGAAG<3，；以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板，EF383142AF,EF383142AR為引物PCR擴增￡F3W"24序列，擴增的555bp序列命名為￡E4。PCR反應條件為:95'C預變性3min后進入30個循環93"變性lmin，48。C退火45s，72。C延伸lmin;最后延伸10min，電泳圖見圖1。(b)五F3W742S的獲得設計引物EF383142BF:5>GTTGGTAGCGGGTGTAAG<3;EF383142BR:5>ATCAAAGTAATCGGCGGG<3;以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板，EF383142BF，EF383142BR為引物PCR擴增EF3W"25序列，命名為^7W。PCR反應條件為:94'C預變性5min后進入30個循環93。C變性lmin，50。C退火45s，72。C延伸lmin;最后延伸10min，電泳圖見圖l。(6)五E4SPW;wD'五F5的構建。p腿eterEF:5>TTTTTCTTTTTTATGGGCTA<3,根據5F3WW24,SiV0wZ)'，Ei^W7425序列，設計引物bridge1:5〉GCCCATAAAAAAGAAAAAGGGGGAGGTATTGAGAAG〈3;bridge2:5〉CTTACACCCGCTACCAACTTACTTGCAACAACCAGGGCAAC〈3;(a)五E4SiV/pmiT的構建提取從步驟(4)獲得的已轉入5尸^;^^'片段的大腸桿菌￡0^011501中的質粒。以質粒pSPrtpmD'為模板，prometerEF，TpmDC4ER為引物PCR擴增S尸nf;wD'序列。PCR反應條件為:95。C預變性3min后進入30個循環93"C變性lmin，5rC退火60s，72。C延伸90s;最后延伸10min。以五E4和S尸W;7wZ)'為模板，EF383142AF，TpmDC4ER，bridgel為引物，進行三弓I物PCR擴增EE4Si^pmD'序列。PCR反應條件為:95'C預變性4min后進入30個循環93'C變性lmin，52。C退火60s，72。C延伸120s;最后延伸10min。回收1572bp的五E4S/W/7附D'序列。(b)五E4S尸n^w"'五F5的構建以五E4S尸W;wjD鄰五F5為模板，EF383142AF，bridge2，EF383142BR為引物PCR擴增五E4S尸W/w2Z)'M^B序列。PCR反應條件為:95。C預變性4min后進入30個循環93°C變性lmin，52。C退火60s，72'C延伸120s;最后延伸10min。將PCR反應擴增獲得的1.9kb左右的重組片段五化SPWpmZ)'五FB克隆到T載體pMD18Tsimplevector中，轉化大腸桿菌￡co//DH5a，予以保存。獲得的質粒測序驗證完全符合預期，命名為p五E4SPr/pmD'EF5。(7)重組五E4S/V^n/)'五FB片段的獲得以質粒p五MS尸W;mD'五F5為模板，PCR擴增獲得1.9kb左右重組片段五E4Si^pwD'五F5;引物為EF383142AF,EF383142BR，PCR反應條件為:95°C預變性4min后進入30個循環93°C變性lmin，52。C退火60s,72。C延伸120s;最后延伸10min，電泳圖見圖1。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后回收目標片段，回收產物使用超純水溶解，調整濃度為lpg/nl。(8)電擊轉化:將由步驟(7)獲得的重組DNA片段五F^S尸W/wD'五F5加入到100nLS12片段電擊轉化入S12電轉感受態細胞中，用加樣器輕微吹打混勻DNA和細胞；快速加入到預冷的轉化杯(lmmgap)中,60S后電擊，注意電擊杯應保持干燥，2400伏特電擊轉化。轉化后的S12感受態細胞迅速轉移到預熱到3(TC的800plSOC培養基中，放于3(TC搖床緩慢震蕩培養(90rpm)2小時，然后取適量涂LB+Amp營養瓊脂平板，30'C倒置培養過夜。(9)重組子篩選和鑒定用PCR制備的線狀單操縱子片段Efi4SP/t^nD'五FS經電穿孔轉化S12，重組的線形片段5E4Si^;7m/)'五F5進入到S12菌體以后，會發生同源重組。該線形片段雖然沒有采用抗生素作為選擇標記，但是可高效降解三苯基甲垸染料的特點為篩選提供了方便；在沒有抗生素的選擇壓力下，所有的細胞都將獲得生長，使菌體在平板上以單個菌落的形式生長。菌落長到12mm時，挑取單菌落接種于含100mg/L的三苯基甲烷類染料的LB培養基中檢測脫色能力，初步篩選后，選取脫色能力強的克隆子，得到有脫色功能的S12重組子克隆；由于獲得的重組子生長在密集的菌苔上，首要要將其純化。先挑出重組子在平板上培養，然后在液體LB中培養，獲得菌液經過稀釋以后涂平板以獲得純化菌落。重復上述純化步驟至獲得一致形態菌落。經過4次連續純化后仍對三苯基甲烷和偶氮染料高效脫色能力以及可熒光示蹤的重組子，命名為脫色希瓦氏菌S12-tpmD'。(10)重組子的驗證以篩選到的重組子一脫色希瓦氏菌S12-tpmD'的基因組DNA作為模板，分別使用引物對EF383142AF，EF383142BR和TpmDEF，TpmDC4ERl以及根據插入位點上下游設計驗證弓l物(S.V.up:caagtcacggttgagaatg;S.V.down:gcctgaagacagtaataagca)用相應的PCR程序進行擴增，并對擴增產物進行電泳分析，以確認同源重組是否成功。提取重組子的總DNA做為模板，分別擴增重組后的SPW/w^'基因，用于同源重組的1.9kb左右的DNA序列以及根據插入位點上下游設計上下游驗證引物S.Vup，S.Vdown理論上可擴出2.5K左右的片段。理論上PCR可以檢測到一個模板的存在，靈敏度不弱于southernblot。從圖2PCR產物電泳圖分析的結果顯示在S12啟動子控制下的^m/)'基因即^51S7^/7W"片段已經重組到脫色希瓦氏菌染色體上。經過驗證，本發明人獲得了將片段五iiMS/W/^D'五F5己整合進入脫色希瓦氏菌S12染色體DNA中的重組子，將這些細菌分別命名為脫色希瓦氏菌S12-tpmD'-l，S12-tpmD'-79,S12陽tpmD，-91。(11)基因工程菌染料脫色能力的測定。(a)菌懸液的制備經過純化的脫色希瓦氏菌S12-tpmD，-l，S12-tpmD'l-79，S12-tpmD'一91菌株與供體菌株嗜水氣單胞菌DN322及受體菌株脫色希瓦氏菌S12分別在LB培養基中培養過夜，取相同OD值的菌液于6000r/min下離心10min收集菌體，用PBS(pI^8.0)洗菌體2次，重懸于PBS(pH二8.0)中。(b)脫色實驗將各菌懸液分別接種于30mL染料培養基中，3(TC下靜置培養。每隔lh取樣測定上清的吸光值。染料培養基酵母抽提物0.2gKH2P042.66gNaCl2.5g(NH4)2S040.5gNa2HP04-7H204.32gH20200mL12rC蒸汽滅菌20min，按需加入滅過菌染料貯備液。(C)脫色率的測定培養液用8000xg離心去除菌體，用紫外一可見分光光度計分別在各染料的最大吸收峰處測定各上清液的吸光值，并以不加菌的染料培養基為對照，按以下公式計算脫色率;;。1177="xl00%(1)式中，^為不加菌的染料培養上清液的吸光值，S為加菌的染料培養上清液的吸光值。三苯基甲垸類染料脫色率測定結果見表l，2，3，4。表l.3種細菌對結晶紫的脫色率-123456789細野生型DN3220.54350.89360"0240.9U10.96130鄰560.9910.99170.993S12-tpmD，-l0.68330.96660.98720.99170.99510.99530.99540.99620.9964S12-tpmD，-790.72140.97360鄰340.99320.99350.99420.99480.99550.9968S12-tpmD'-910.63580.98650.99030.99400,99430.99560.99590.99660.9974野生型S120.22450.22710.22890.23040.23230.240.24270.24650.2702表23種細菌對孔雀石綠的脫色率146789細\野生型DN3220.00560.64350.790.86420.91940.93880.96150.96830.9774S12-tpmD,-l謹040.70390.7438O,,0.900.93560,96740.97250.9757S12-tpmD，-790.45780.78230.84710.92140.93830.95590.97130.97760.9785S12-tpmD，-910.43410.81320.87970.93220.93850-96330.97550.97770.9898野生型S120.15840.20570.22910.24980.26380.27150.27780.31790.4099表33種細菌對燦爛綠的脫色率12345678910野生型DN3220.36010.59060.61170.68630.71580.71830.73540.7460.85880.878S12-tpmD'-l0.45250.7060.71230.75730.78350.79570細70.80680.卯50細6S12-tpmD'-790.37210.67960.72420.72890.76490.79070.79780.8096O.柳0.9077S12-tpmD'-910.41670.70670.72450.77120.78160.79350.79730.80480.91710.9209野生型S120.1050.10610.13630.18560.19560.24160.27710.28470.31330.3251表43種細菌對堿性品紅的脫色率、l2345678910細<DN3220.16720.18230.20510.23080.2780.3340.43990.6340.75870.849712<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表l，2，3，4可以看出，工程菌株對三苯基甲垸染料脫色速率和脫色效率都明顯高于野生型脫色希瓦氏菌S12，達到了野生型脫色希瓦氏菌DN322相似的水平。對偶氮染料莧菜紅脫色率測定結果見表5,表5.3種細菌對偶氮染料莧菜紅脫色率12345678910S12-中mD'-910.17240.23150.43890.54230.70670.82880.85680.9050.93220.9777S12-tpmD'-790.18310.23870,43990.54620.71230.84970.8780.90010.93210.9785S12-tpmD'-l0.20210.24980.45780.54350.72420.8550.88880.90860.93850.9834野生型S120.19870.24790.43410.59750.72890.8730.93490.95580.97360.9968由表5可以看出工程菌與野生型脫色希瓦氏菌S12對莧菜紅的脫色速率與效率沒有明顯差別，說明插入序列對脫色希瓦氏菌S12沒有造成影響。由此可見本發明構建的工程菌對偶氮、蒽醌和三苯基甲垸類染料都具有脫色能力，其對上述三種染料的脫色能力與嗜水氣單胞菌DN322對三苯基甲烷染料和脫色希瓦氏菌S12對偶氮和蒽醌類染料的的脫色能力相當。(d)重組子結晶紫脫色產物HPLC分析以甲醇水(90:IO)為流動相時，進樣量為10pL，以米氏酮、DMAP、NADH的混合物為混合標樣，對酶催化的脫色反應產物以及中間產物進行HPLC分析，結果如圖3，4，5的所示。反應產物色譜圖(圖5)中的第三個峰與標樣米氏酮的保留時間和光譜圖一致，表明結晶紫脫色產物之一為四甲基米氏酮，這說明通過同源重組使S12中獲得的三苯基甲烷染料脫色降解機理與DN322是一致的，脫色希瓦氏菌S12-tpmD，-79，S12-tpmD'-91結果同脫色希瓦氏菌S12-tpmD'-l。(12)基因工程菌熒光示蹤性的檢測。脫色希瓦氏菌S12-tpmD'菌株和脫色希瓦氏菌S12菌株于30°C,LB液體培養基分別振蕩培養過夜，取lmL菌液離心收集菌體，將菌體重懸于約20pL的LB液體培養基中。取各菌懸液12pL接種至200nL含有5pMEDT和2jxMReAsH—EDT2的LB液體培養基中，30°C避光振蕩培養過夜；離心收集菌體，用lmL含有50nM的EDT的LB液體培養基重懸，避光旋轉振蕩約10min，再用lmL不含EDT的LB液體培養基洗漆，重懸菌體，取樣顯微鏡鏡檢(激發波長593nm，發射波長608nrn)。其菌體的四半胱氨酸一雙砷標記顯微鏡照片見圖6，7，由圖6，7可以看出在黑背景下觀察到脫色希瓦氏菌S12-tpmD，-l菌體發出紅色熒光，而在同樣條件下觀察不到S12菌體發熒光，脫色希瓦氏菌S12-tpmD'-79,S12-tpmD，-91結果同脫色希瓦氏菌S12-tpmD'-l。通過上述實驗證明本發明構建的基因工程菌，對偶氮、蒽醌和三苯基甲垸類染料三大類染料都具有高效脫色能力，并且能發熒光。14序列表<110>廣東省微生物研究所<120>熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏工程菌及其構建方法<160>7<210>1<211>864<212>DNA<213>嗜水氣單胞菌DN322(^eramowas/^drapW/asubsp.DN322)<220><221>CDS<400>1ATGTCAATTGCGGTGACGGGTGGTACTGGTCCACTCGGTGGGCTTGTGATTCAACATTTG60CTCAAAAAAGTTCCCGCCAGTCAAATCATTGCCATCGTGCGTAATGTTGAAAAAGCCTCT120ACTCTTGCCGATCAAGGCGTGGAAGTTCGCCATGGCGACTATAATCAACCGGAATCTCTT180CAAAAGGCTTTTGCAGGTGTCTCCAAGCTGCTCTTTATCTCAGGTCCGCATTATGATAAT240ACGCTTCTTATCGTTCAACATGCAAATGTCGTAAAAGCTGCCAGAGATGCGGGAGTCAAA300CATATTGCTTACACAGGATATGCCTTTGCTGAGGAATCAATAATTCCCCTTGCACACGTA360CATTTAGCAACGGAATATGCCATCCGTACGACCAATATCCCGTATACTTTCCTGCGTAAT420GCCTTATATACGGACTTTTTTGTAAATGAGGGGCTGCGCGCATCCATAGAGTCTGGAGCA480ATTGTTACGAATGCGGGAAGCGGGATCGTTAATTCAGTAACACGCAATGAACTTGCTTTG540GCTGCCGCAACGGTTCTTACAGAGGAAGGGCATGAAAACAAAACGTATAACCTTGTTTCC600AATCAACCGTGGACCTTTGATGAACTTGCCCAAATTCTCTCCGAGGTTTCCGGCAAAAAA660GTCGTGCATCAGCCTGTCTCATTCGAAGAAGAG磁AATTTCCTCGTAAACGCTGGTGTC720CCTGAGCCGTTTGCTGAAATTACGGCAGCGATCTATGACGCGATTTCCAAAGGAGAAGCG780TCCAAAACATCAGATGGTCTGCAAAAACTGATCGGATCCTTGACCCCTCTGAAGGAAACC840GTAAAACAAGCCCTGAAAATGTAA864<210>2<211>98<212>DNA〈213〉脫色希瓦氏斷572e而we〃aafeco/ora"'om力S12<400>2TTTTTCTTTTTTATGGGCTAATAAACTAAGCCCATAGAGTCGAGAGCAAGTTGAAAGACT60CTCAAGAATTTCAATTTTCGGAGCAGATTATGTCTAAA98<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>CATTTGCTCAAAAAAGTTCCCGCCAGTCAAGCCTCTACTCTTGCCGATCAAGGCGTGGAATCTCTTCAAAAGGCTTTTGCAGGTGTCTCCGATAATACGCTTCTTATCGTTCAACATGCAGTCAAACATATTGCTCACACAGGATATGCCCACGTACATTTAGCAACGGAATATGCCATCCGTAATGCCTTATATACGGACTTTTTTGTAGGAGCTATTGTTACGAATGCGGGAAGCGGGGCTTTGGCTGCCGCAACGGTTCTTACAGAGGTTTCCAATCAACCGTGGACCTTTGATGAAAAAAAAGTCGTGCATCAGCCTGTCTCATTCAGTGTCCCTGAGCCGTTTGCTGAAATTACGGAAGCGTCCAAAACATCAGATGATCTGCAAGAAACCGTAAAACAAGCCCTGAAAATGGCTATCATTGCCATCGTGCGTAATGTTGAAAAA240GTTCGCCATGGCGACTATAATCAACCGGAA300AAGCTGCTCTTCATCTCAGGTCCGCATTAT360AATGTCGTAAAAGCTGCCAGAGATGCGGGA420TTTGCTGAGGAATCAATAATTCCCCTTGCA480CGTACGACCAATATCCCGTATACTTTCCTG540AATGAGGGGCTGCGCGCATCCATAGAGTCT600ATCGTTAATTCAGTAACACGCAATGAACTT660GAAGGGCATGAAAACAAAACGTATAACCTT720CTTGCCCAAATTCTCTCCGAGGTTTCCGGC780GAAGGAGAGAAAAATTTCCTCGTAAACGCT840GCAGCGATCTATGACGCAATTTCCAAAGGA■AAACTGATCGGATCCTTGACCCCTCTGAAG960GCATGTTGCCCTGGTTGTTGCAAGTAA1017<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>6GCTGCATGTTGCCCTGGTTGTTGCAAG27<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>7GAAGGAGATATACATCCC18權利要求1.一種熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏工程菌，其特征在于所述的工程菌是將外源基因整合進入染色體中，所述的外源基因是融合基因SPrtpmD’，所述的融合基因SPrtpmD’是在脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子序列SPr之后連接三苯基甲烷染料脫色酶修飾基因tpmD’構成，所述的三苯基甲烷染料脫色酶修飾基因tpmD’，是在三苯基甲烷染料脫色酶基因tpmD的5’端起始密碼子ATG前加有SD序列，在3’端終止密碼子之前加有能螯合雙砷熒光染料的編碼6個氨基酸(CCPGCC)的小標簽，所述的tpmD序列如SEQ1所示，所述的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子序列如SEQ2所示，所述的SD序列如SEQ7所示，所述的螯合雙砷熒光染料編碼CCPGCC六個氨基酸的堿基序列如SEQ6所示，所述的工程菌能分泌能螯合雙砷熒光染料的三苯基甲烷染料脫色酶。2.如權利要求l所述的脫色希瓦氏工程菌的構建方法，其特征在于包括下列步驟a)^wZ)'序列的獲取應用PCR技術，以嗜水氣單胞菌DN322的DNA為模板，擴增出三苯基甲垸染料脫色酶基因^附Z)，在其5'端的起始密碼子前加有SD序列，在其在3'端終止密碼子之前加螯合雙砷熒光染料的編碼CCPGCC六個氨基酸的堿基序列，將此序列命名為^w/)';b)脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子SiV的獲取以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板PCR擴增NAD(P)H脫氫酶基因的啟動子序列；c)片段五E4的獲取以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板，PCR擴增而得片段5E4，該片段的序列如SEQ3所示；d)片段的獲取以脫色希瓦氏菌S12基因組DNA為模板，PCR擴增而得片段五F凡該片段的序列如SEQ4所示；e)S尸邵mD'的構建利用TP-PCR技術，在伊mD'序列5'端前加脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子SiV，從而構建成SiV^wD';f)五E4SiM;/nD'的構建利用TP-PCR技術，在SiV/pmD'的5'端前加片段￡F」而構建成；g)五E4S/V^wD'五F5的構建，利用TP-PCR技術，在五E4S尸W;wtD'的3'端加片段五iW;h)將構建好的五E4SPn^wD'五7W電擊轉化到脫色希瓦氏菌S12中；i)利用同源重組使五E4S尸W;7wZ)'jE:F5整合到脫色希瓦氏菌S12基因組染色體；j)通過序列，脫色能力，熒光篩選，獲得脫色希瓦氏菌S12基因工程菌。3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于所述的序列篩選是通過以脫色希瓦氏菌S12基因工程菌的基因組DNA為模板PCR擴增五i^SPn^mZ)'5FS,5TV^w"、^mD'片段測定分析的，選取能擴增出五FASiV伊mD'五i^,SPnf;wZ)'，^mD'片段為目的菌株。4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于所述的脫色能力篩選是通過將脫色希瓦氏菌S12基因工程菌對偶氮、蒽醌和三苯基甲烷類染料進行脫色能力鑒定，選取對偶氮、蒽醌和三苯基甲垸類染料具有脫色作用的為目的菌株。5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于所述的熒光篩選是通過熒光顯微鏡對脫色希瓦氏菌S12基因工程菌進行分析的，選取具有熒光四半胱氨酸一雙砷標記的菌株為目的菌株。全文摘要本發明公開了一種熒光示蹤多功能脫色的脫色希瓦氏工程菌及其構建方法，旨在提供一種對偶氮、蒽醌和三苯基甲烷三大類染料都具有高效脫色能力，并且具有熒光示蹤功能的基因工程菌。本發明的技術方案是將外源融合基因SPrtpmD’整合進入脫色希瓦氏菌S12，所述的融合基因SPrtpmD’是在脫色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脫氫酶基因啟動子序列之后連接三苯基甲烷染料脫色酶修飾基因tpmD’構成，所述的三苯基甲烷染料脫色酶修飾基因tpmD’，是在三苯基甲烷染料脫色酶基因tpmD的5’端起始密碼子前加有SD序列，在3’端終止密碼子之前加有能螯合雙砷熒光染料的編碼6個氨基酸的小標簽。本發明用于環境修復和治理中。文檔編號C12N1/21GK101486989SQ20081022062公開日2009年7月22日申請日期2008年12月30日優先權日2008年12月30日發明者任隨周,衛晉波,孫國萍,許玫英申請人:廣東省微生物研究所