一種制備重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白的方法

專利名稱：：一種制備重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白的方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
。具體涉及一種制備重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白的方法。
背景技術：
：干擾素(IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在多種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長和分化、調節免疫功能等多種生物活性。根據干擾素蛋白質的氨基酸結構、抗原性和細胞來源，可將其分為IFNa(白細胞型)、IFN|3(成纖維細胞型)、IFNY(免疫型)。IFNco屬于IFNa家族，其結構和大小與其它IFNa稍有差異，但抗原性有較大的不同。現在公認ifnP和ifny只有一個亞型，而ifna有約二十余個亞型。自80年代以來，許多研究顯示，干擾素(尤其是IFNa及IFNy)除具有抗病毒、免疫調節的作用外，還具有明顯的抗細胞增殖作用。因此，目前干擾素己被用于治療多種人類疾病。人重組干擾素在臨床上都已被廣泛地運用于抗病毒及抗腫瘤。多年來，干擾素是一直被用于治療丙型，乙型肝炎的首選用藥。但干擾素的療效并不太理想，只在較小比例的患者在停止用藥之后仍能維持對病毒的抑制作用。主要的問題在于干擾素的血液半衰期只有僅僅3-6個小時，為達到治療效果一般肝炎病人需要每周至少接受三次注射，給病人帶來巨大的痛苦。針對上述干擾素在人體內半衰期短的缺點，美國的羅氏制藥(Roche)和先靈葆雅(Schering-Plough)將干擾素聚乙二醇化，以保障一個穩定的血漿濃度，聚乙二醇化的干擾素展示出較好的臨床治療效果。目前，聚乙二醇化的干擾素在臨床上已經在很大程度上替代了普通干擾素單體。此外，采用重組人血清白蛋白與干擾素的融合蛋白也可以克服干擾素在人體內半衰期較短的缺點，有研究表明，在克魯維氏酵母中表達的HSA-IFNa融合蛋白(Albuferon)在獼猴體內的半衰期比普通IFNa延長了大約18倍。重組人血清白蛋白與千擾素a融合蛋白的制備涉及到酵母工程菌的發酵過程以及后續的純化過程。重組質粒和酵母染色體基因競爭利用共同的蛋白表達系統、代3謝能量以及生物合成的前體等，從而造成受體細胞生長緩慢和重組質粒的不穩定。而那些丟失了重組質粒的細胞與受體細胞共享培養基和競爭生長，可以導致基因表達的產率降低。故外源基因在宿主細胞中的表達受很多因素的影響，不僅要考慮到工程菌本身的因素，還要顧及工程菌培養過程中外部條件，如發酵過程中每個營養成分的含量，溫度，pH，溶氧濃度等。并且后續的純化過程也非常重要，直接影響最終重組融合蛋白的純度與生物活性。因此，本領域迫切需要提供一種高效制備重組人血清白蛋白與干擾素Ct融合蛋白的方法，并將其運用到重組融合蛋白藥品的生產中。
發明內容本發明的目的是提供一種高效制備重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白的方法。為了實現上述目的，本發明首先提供了一種制備重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白的方法，包括如下步驟a)構建含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因的表達質粒；b)將步驟a)得到的含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因的表達質粒轉化到酵母工程菌中，建立表達重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白的酵母工程菌種子庫；c)將步驟b)得到的酵母工程菌種子庫中的酵母種子菌以5%~30%(v/v)(較佳10%20%(v/v)，最佳10%(v/v))的接種量接種于酵母培養基中，溶氧不小于10。/。的飽和度，25。C37。C(較佳28。C32。C，最佳30。C)培養60卯小時(較佳60~72小時，最佳60小時)；d)收集上清發酵液，分離純化出所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白。在一個優選的實施方案中，所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白中的干擾素a選自干擾素a-2a、干擾素a-lb、或干擾素a-2b。在另一個優選的實施方案中，所述酵母工程菌是釀酒酵母；更優選所述酵母工程菌是釀酒酵母BJ5457。在還有一個優選的實施方案中，所述表達質粒是含有重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白基因，并且可以在酵母工程菌(較佳釀酒酵母，更佳釀酒酵母BJ5457)中組成型表達的載體質粒；更優選所述表達質粒是含有重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白基因的PYES31載體質粒。4在一個優選的實施方案中，所述酵母培養基是由0.5%~1.5%(W/V)的蛋白胨、1.5%~2.5%(w/v)的酵母提取物、2.0%(w/v)的葡萄糖或2.0%(w/V)蔗糖、以及微量金屬元素組成的。在一個更優選的實施方案中，所述微量金屬元素包括亞鐵離子(較佳為2ppm4ppmFe2。、銅離子(較佳為2ppm4ppmCu2+)、錳離子(較佳為2ppm4ppmMn2+)、以及鋅離子(較佳為7ppm14ppmZn2+)。在一個還要優選的實施方案中，所述酵母培養基的起始pH值為5.5~6.5。在一個較佳的實施方案中，在所述步驟c)培養的第1216個小時流加0.5-1.5升20%(w/v)的葡萄糖或0.5~1.5升20%(w/v)蔗糖；在所述步驟c)培養的第3842個小時再流加0.51.5升乙醇。在另一個較佳的實施方案中，在所述步驟c)的整個培養過程中不補加氮源。在還有一個較佳的實施方案中，在所述步驟d)中，所述分離純化的方法是采用層析方法。在一個更佳的實施方案中，所述層析方法選自親和層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、反向層析或其組合。在一個還要佳的實施方案中，所述分離純化的方法為采用陽離子交換層析(較佳采用SP-XL填料)捕獲發酵液中的重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素(i-2b)融合蛋白，先后經過疏水層析(較佳采用ButylsepharoseFF填料)以及陰離子交換層析(較佳采用DEAEsepharoseFF填料)兩步精細純化，最終得到含有所述重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白(純度不低于95.0%)的樣品。本發明還涉及用以上方法制得的重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白。采用本發明方法的優點主要有①發酵效率高、而成本相對低廉；②最終經純化獲得的重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白的比活性不低于5.0^105IU/mg，純度不低于95.0%，作為藥物的活性成分，可以安全、有效地應用于人體。圖1顯示了本發明實施例2(四)所述的表達載體質粒圖譜。圖2顯示了本發明實施例5(三)所述的SDS-PAGE電泳圖。其中，M:Marker(從上至下依次分別為116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kDa)，泳道13為HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品的還原型SDS-聚丙烯酰胺電泳圖。圖3顯示了本發明實施例5(四)所述的HPLC峰圖。5具體實施方案具體而言，本發明提供了一種制備重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白的方法，包括如下步驟a)構建含有重組人血清白蛋白與干擾素(x融合蛋白基因的表達質粒；b)將步驟a)得到的含有重組人血清白蛋白與干擾素(x融合蛋白基因的表達質粒轉化到酵母工程菌中，建立表達重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白的酵母工程菌種子庫；c)將步驟b)得到的酵母工程菌種子庫中的酵母種子菌以5%30%(v/v)(較佳10%20%(v/v)，最佳10%(v/v))的接種量接種于酵母培養基中，溶氧不小于10%的飽和度，25°C37°C(較佳28°C~32°C，最佳30°C)培養60~90小時(較佳60~72小時，最佳60小時)；d)收集上清發酵液，分離純化出所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白。在一個優選的實施方案中，所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白中的干擾素a選自干擾素a-2a、干擾素a-lb、或干擾素a-2b，即重組人血清白蛋白與干擾素a-2a融合蛋白、重組人血清白蛋白與干擾素a-lb融合蛋白、或重組人血清白蛋白與干擾素a-2b融合蛋白。在本發明的一個實施方案中，選用了重組人血清白蛋白與干擾素a-2b融合蛋白。在本發明所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白中，所述干擾素a可直接連接在人血清白蛋白的N末端或C末端形成重組融合蛋白(IFNa-HSA、或HSA-IFNa);也可以通過一個連接肽(例如(G4S)n，n宜為3或4)連接兩種蛋白，形成干擾素a-連接肽-人血清白蛋白融合蛋白(IFNa-L-HSA)、或人血清白蛋白-連接肽-干擾素a融合蛋白(HSA-L-IFNa)。考慮到連接肽毒理評價問題(如在體內增加新的免疫原性的可能性)尚存爭議，本發明優選干擾素a(較佳干擾素a-2b)直接連接在人血清白蛋白的N末端或C末端形成的重組融合蛋白。關于干擾素a(如干擾素a-2a、干擾素a-lb、或干擾素a-2b等)或者人血清白蛋白的氨基酸序列是本領域技術人員所熟知的，或者也可以通過搜索網上數據庫(例如GenB肌k)獲得。如無特別說明，本發明所述的各種"干擾素"或"IFN"都是指"人干擾素"。本發明所述"干擾素a"或者"人血清白蛋白"多肽包括與其相同(同源)或基本相同(同源)的多肽，例如，有至少60%、較佳70%、更佳80%、還要佳90%、最佳95%以上的同源性或相同性的多肽，當然，其相同(同源)或基本相同(同源)的多肽與所述蛋白多肽應具有相同或相似的生物活性或功能。所述"干擾素"6或者"人血清白蛋白"多肽還包括與所述蛋白多肽具有相同或相似生物活性或功能的突變形式。這些突變形式包括但并不限于，相對于天然蛋白的氨基酸序列有若干個(通常為1-50個，較佳的l-30個，更佳的l-20個，最佳的l-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代。因此，所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白也包括了上述相同(同源)或基本相同(同源)多肽的重組融合蛋白，以及上述突變形式多肽的重組融合蛋白。在本發明制備方法的步驟a)中，所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因也包括了可以編碼上述多種形式的重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白的基因(核酸序列)。所述基因通常可以用PCR擴增法、或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據相關的基因(核酸序列)，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA文庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，通常可通過重疊擴增(Overl叩-PCR)，例如進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。當然，為了便于后續目的蛋白的分離純化，優選可以在重組融合蛋白基因的3'-端加上一段信號肽(前導肽)序列(優選來源于酵母的信號肽序列)，這樣，重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白可經由信號肽(前導肽)分泌到酵母菌培養液中，簡化了后續對于目的蛋白的分離純化。本發明制備方法所述步驟a)為構建含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因的表達質粒。其中，構建含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因的表達質粒的方法是本領域常規的方法，也是本領域技術人員所熟知的。具體的實施步驟為首先，用常規手段分別克隆獲得編碼人血清白蛋白(HSA)多肽和干擾素a(IFNa)多肽的核酸序列。具體是從適當的組織、細胞提取mRNA，通過RT-PCR獲得相應的cDNA;也可以從適當的cDNA文庫直接獲得相應的cDNA;還可以通過人工合成獲得。獲得的核酸序列可適當進行密碼子的改變，以便在相應的蛋白表達宿主(如酵母工程菌)中達到表達蛋白的最佳效果。然后，將編碼HSA多肽的核酸序列與編碼IFNa多肽的核酸序列連接形成單一編碼IFNa-HSA、或HSA-IFNa多肽的核酸序列。優選的合成方法為Overlap-PCR的方法；也可以通過基因核酸序列末端天然的限制性酶切位點進行連接。然后，上述重組核酸序列被克隆到表達質粒載體中，使該核酸序列與表達調控序列操作性相連，獲得所述含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因的表達質粒。此處術語"表達調控序列"通常指參與控制核酸序列表達的序列。表達調控序列包括與目7標核酸序列操作性相連的啟動子和終止信號等；它們通常還包括核酸序列準確翻譯所需的序列。"操作性相連"是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉錄，則它與編碼序列是操作性相連的。本發明選用的表達質粒載體包括任何適合在酵母工程菌(較佳釀酒酵母，更佳釀酒酵母BJ5457)中表達重組融合蛋白的載體質粒，優選的載體是能在酵母工程菌(較佳釀酒酵母，更佳釀酒酵母BJ5457)中組成型表達(一般指該載體擁有組成型啟動子，不需要誘導物的誘導，外源基因在細胞生長的過程中持續表達)的載體質粒，更優選的質粒載體是PYES31。PYES31是由PYES3/CT(Novogen)改造而來，兩者的唯一不同是把04丄/(半乳糖激酶)啟動子變成了尸G《/(磷酸甘油酸激酶)啟動子，PYES31載體上的PGI/是組成型啟動子，不需要誘導物的誘導，外源基因在細胞生長的過程中持續表達。本發明制備方法所述步驟b)為將步驟a)得到的含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因的表達質粒轉化到酵母工程菌中，建立表達重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白的酵母工程菌種子庫。所述轉化的方法是本領域常規的方法，也是本領域技術人員所熟知的。較佳的將步驟a)得到的含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因的表達質粒轉化到酵母工程菌(更佳釀酒酵母，還要佳釀酒酵母BJ5457)中的方法是電轉化方法。所述建立酵母工程菌種子庫的目的是為了得到較為穩定可靠的含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因表達質粒的酵母工程菌，也可以方便后續發酵培養的接種操作。具體的方法為挑取經鑒定為含有重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白基因表達質粒的陽性酵母克隆，置于培養基中培養(為了使酵母菌中的質粒不丟失，較佳的是在相應的缺陷培養基(例如SDA液體培養基)中進行培養)，達到一定密度(較佳OD,值為4.0-5.0)后，加入無菌甘油(較佳的甘油終濃度為15~20%v/v)，分裝，凍存，-80"保存。本發明制備方法所述步驟c)為將步驟b)得到的酵母工程菌種子庫中的酵母種子菌以5%~30%(v/v)(較佳10%~20%(v/v)，最佳10%(v/v))的接種量接種于酵母培養基中，溶氧不小于10%的飽和度，25°C~37°C(較佳28。C32。C，最佳30°C)培養6090小時(較佳6072小時，最佳60小時)。在所述步驟c)中，根據發酵培養的總體積，小試可以使用搖瓶培養，大規模工業生產可以使用發酵罐培養。此外，根據發酵培養的總體積，優選可以事先對所述酵母工程菌種子庫中的酵母種子菌進行一級或者多級種子培養(為了使酵母種子8菌中的質粒不丟失，較佳的是在相應的缺陷培養基(例如SDA液體培養基)中進行種子培養)，達到一定密度(較佳OD6(K)值為4.05.0)后，再以5%30%(v/v)(較佳10%20%(v/v)，最佳10%(Wv))的接種量接種于酵母培養基中。發明人對于酵母培養基的配方、起始pH值、以及發酵過程中補料的摸索嘗試了多種方案，經過不懈的努力，最終確定了若干個優選的實施方案。在一個優選的實施方案中，所述酵母培養基是由0.5%~1.5%(w/v)的蛋白胨、1.5%~2.5%(w/v)的酵母提取物、2.0°/0(w/v)的葡萄糖或2.0%(w/v)蔗糖以及微量金屬元素組成的。在一個更優選的實施方案中，所述微量金屬元素包括亞鐵離子(較佳為'2ppm4ppmFe2+)、銅離子(較佳為2卯m4ppmCu2+)、錳離子(較佳為2ppm4ppmMn2+)、以及鋅離子(較佳為7ppm14ppmZn")。在一個還要優選的實施方案中，所述微量金屬元素是由亞鐵離子(較佳為2ppm4ppmFe2+)、銅離子(較佳為2ppm4ppmCu2+)、錳離子(較佳為2ppm4卯mMn2+)、以及鋅離子(較佳為7ppm~14ppmZn2+)組成的。在另一個還要優選的實施方案中，所述酵母培養基的起始pH值為5.5~6.5。在另一個優選的實施方案中，在所述步驟c)培養的第1216個小時流加0.5~1.5升20%(w/v)的葡萄糖或0.5~1.5升20%(w/v)蔗糖；在所述步驟c)培養的第3842個小時再流加0.51.5升乙醇。在還有一個優選的實施方案中，在所述步驟c)的整個培養過程中不補加氮源。i本發明制備方法所述步驟d)為收集上清發酵液，分離純化出所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白。其中，收集上清發酵液的方法是本領域常規的方法，也是本領域技術人員所熟知的。例如可以采用離心(優選在4"C8"C條件下離心)、過濾、或靜置等方法。優選地，所述分離純化的方法不會使目的蛋白大幅度失活變性。在本發明中，;從發酵液中分離純化出所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白的方法優選采用層析方法，包括但不限于，親和層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、反向層析或其組合。在一個更優選的實施方案中，所述分離純化的方法為采用陽離子交換層析(較佳采用SP-XL填料)捕獲發酵液中的重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白，先后)經過疏水層析(較佳采用ButylsepharoseFF填料)以及陰離子交換層析(較佳采用DEAEsepharoseFF填料)兩步精細純化，最終得到含有所述重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合白(純度不低于95.0%)的樣品。在一個還要優選的實施方案中，所述捕獲的過程是采用了擴張床吸附技術(STREAMLINE),即釆用STREAMLINESP-XL陽離子交換層析捕獲發酵液中的重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白。采用STREAMLINE技術的優點在于可以直接從含有菌體的發酵液中捕獲目的蛋白，將除去菌體、濃縮、初步純化結合為一。而傳統的方法是先將發酵液除去菌體、濃縮然后再用層析柱捕獲蛋白，在此過程中操作時間較長、蛋白易損失，而且步驟繁瑣、儀器昂貴。值得注意的是，本發明在描述所述重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白的制備方法時，采用了"包括如下步驟……"的句式。也就是說，本領域技術人員還可以根據需要，在制備重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白時，增加其它的技術步驟。當然，增加的技術步驟必須確保基本上不會影響最終得到的所述重組人血清白蛋白與干擾素a(較佳干擾素a-2b)融合蛋白的濃度、純度、及生物活性。本發明所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白表達與純化的結果可以采用常規的蛋白分析方法進行鑒定，包括但不限制于SDS-PAGE，Western-blot,蛋白含量的測定，蛋白純度的測定，干擾素生物活性(比活性)的測定等。經檢測，用本發明方法制得的重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白，其蛋白含量不低于1.5mg/ml，比活性不低于5.0xl()SlU/mg，純度不低于95.0%,分子量為85.7KD士8.5KD。下面將結合實施例進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發明的范圍。實施例1培養基配置與檢測分析方法(一)培養基配置a)LB液體培養基。蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，ddH20:950ml。搖動容器直至溶質完全溶解，用5mol/LNaOH調節pH直至7.0，加入ddH20至總體積1L，在1.034xl()5pa高壓下滅菌20min。(2)LB固體培養基。LB液體培養基100ml，瓊脂粉1.5g。搖動，在1.034xl05Pa高壓下滅菌20min。(3)山梨醇選擇平板。YNB:6.7g，山梨醇18.2g，瓊脂粉2.0g，ddH20:800ml。待溶解后，加入ddH20至總體積900ml。在1.034xl05Pa高壓下滅菌20min。用時加入滅菌的20%(w/v)的葡萄糖100ml，倒平板。10(4)SDA液體培養基。YNB:6.7g，KH2P04:2.2g，K2HP04'3H20:4.5g，尿素1.5g，ddH20:800ml。待溶解后，加入ddH20至總體積900ml。在1.034x105Pa高壓下滅菌20min。用時加入滅菌的20%(w/v)的葡萄糖100ml。(5)SDA固體培養基。YNB:6.7g，KH2P04:2.2g,K2HP(V3H20:4.5g，尿素1.5g，ddH20:800ml，瓊脂粉20g。待溶解后，加入ddH20至總體積900ml。在1.034xl()Spa高壓下滅菌20min。用時加入滅菌的20%(w/v)的葡萄糖100ml，倒平板。(6)YPD液體培養基。蛋白胨20g，酵母提取物10g，ddH20:800m。待溶解后，加入ddH20至總體積900ml。在1.034xl05Pa高壓下滅菌20min。用時加入滅菌的20%(w/v)的葡萄糖100ml。(7)YPD固體培養基。YPD液體培養基。蛋白胨20g，酵母提取物10g，ddH20:800ml，瓊脂粉20g。待溶解后，加入ddH2O至總體積900ml。在1.034xl05Pa高壓下滅菌20min。用時加入滅菌的20%(w/v)的葡萄糖100ml，倒平板。(二)檢測分析方法(1)干擾素生物活性(比活性)的測定。細胞病變抑制法(WISH/VSV系統)，《中華人民共和國藥典》2005年版三部，附錄XC。(2)酵母菌體濃度的測定。分光光度計測定0D6(K)的值。用沒有接種酵母菌的培養基作為空白對照，樣品用空白對照的培養基稀釋，測定OD6oo的值。釀酒酵母1OD,相當于108個細胞。實施例2HSA-IFNa-2b融合蛋白表達工程酵母菌的構建(一)人血清白蛋白基因的克隆人血清白蛋白基因可以通過RT-PCR獲得。首先獲得正常人肝組織，并從中制備RNA;然而，通過反轉錄方法獲得cDNA;再用PCR分子克隆技術擴增獲得人血清白蛋白基因。具體步驟如下首先制備總RNA。用正常人肝組織適量，加入lmlTrizol試劑裂解細胞，勻漿再以氯仿和異丙醇進行抽提RNA，用乙醇進行洗滌，獲得的RNA便可以進行RT-PCR反轉錄了。RT-PCR使用寶生物公司mRNASelectivePCR試劑盒。反轉錄體系為2xm認ASelectivePCRBufferI，25^1;MgCl2，10^1;dNTP/analogMixture,5^1;RNaseinhibitor,lpl;AMVRNaseXL，1^1;OligodTPrimer,RNA，lplRNaseFreedH20，6pl。根據下列的程序進行反應30°C，lOmin;42°C，30min;5°C，5min。合成的cDNA在-20。C保存。當然，人血清白蛋白基因也可以從商業購得的人胎肝cDNA文庫中獲得。根據文獻設計HSA的引物，用常規的PCR方法擴增HSA基因。HSA1:gtcggtacc(Kpnl)ATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCA(前導肽)GATGCACACAAGAGTGAGGTTGHSA2:TGGGTTTGAGGCAGATCACATAAGCCTAAGGCAGCTTPCR反應體系為前述制得的cDNA，HSA1，2.5^1;HSA2，2.5|Lil;PremixTaq(ExTaq)，25pl;ddH20，，。根據下列的程序進行反應開始，94°C5min;然后，94°Clmin，55°Clmin，72°C2min，一共30個循環；最后，72°C5min。然后使用常用的分子生物學方法，分離獲得HSA基因。具體是用1%的瓊脂糖膠電泳PCR產物，切下1800bp左右的目的條帶，再用博大泰克公司的"PCR產物快速膠回收試劑盒"回收切膠產物，-2(TC保存。(二)干擾素a基因的克隆本實驗說明IFNa-2b基因的克隆方法，本方法也適合其它IFNa基因的克隆。首先，取正常人外周血獲得人白細胞，并從中制備RNA;通過反轉錄方法獲得cDNA;再用PCR分子克隆技術擴增獲得IFNa-2b基因。具體步驟如下首先制備總RNA。從正常人外周血人白細胞，經Sendaivirus誘導培養后，白細胞加入lmlTrizol試劑裂解細胞，再以氯仿和異丙醇進行抽提RNA，用乙醇進行洗滌，獲得的RNA便可以進行RT-PCR反轉錄了。RT-PCR使用寶生物公司mRNASelectivePCR試劑盒。反轉錄體系為2xmRNASelectivePCRBufferI，25^1;MgCl2，lO^il;dNTP/analogMixture,5^1;RNaseinhibitor,lpl;AMV脂aseXL，OligodTPrimer,RNA，lpl;RNaseFreedH20，6pl。根據下列的程序進行反應30°C，lOmin;42°C，30min;5°C，5min。合成的cDNA在-2(TC保存。根據文獻設計IFNa-2b的引物，用常規的PCR方法擴增HSA基因。IFN1:AAGCTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAAACCCAIFN2:gggCTCGAG(Xhol)TTATTCCTTACTTCTTAAACPCR反應體系為前述制得的cDNA，1^1;lOxpfuBuffer,5pl;dNTPMixture,2^1;IFNl，2.5^1;IFN2，2.5^1;pfuDNAPolymerase,0.5[il;ddH20,36.5pl。根據下列的程序進行反應開始，94°C5min;然后，94°Clmin，55°Clmin，72°Clmin，一共30個循環；最后，72°C5min。12然后使用常用的分子生物學方法，分離獲得IFNa-2b基因。具體是用1.5%的瓊脂糖膠電泳PCR產物，切下500bp左右的目的條帶，再用博大泰克公司的"PCR產物快速膠回收試劑盒"回收切膠產物，-2(TC保存。(三)融合基因克隆本實驗以HSA基因和IFNa-2b基因形成HSA-IFNa-2b融合基因為例，說明融合基因的克隆方法，本方法也適合HSA基因與其它IFNa基因形成融合基因的克隆。融合蛋白基因的克隆使用Overlap-PCR的方法獲得。具體步驟如下Overlap-PCR的反應體系為IFNa-2bPCR回收產物，2^1;HSAPCR回收產物，2nhPremixTaq(ExTaq)，50|il;ddH20，36^1。PCR條件為開始，94°C5min;然后，94°Clmin，55°Clmin，72°C2min，一共5個循環；接著，加入引物HSA15^1和IFN25pl，進入下個程序94°Clmin，55°Clmin，72°C2min，一共30個循環；最后，72。C5min。使用常用的分子生物學方法，分離獲得HSA-IFNa-2b融合基因。具體是用1.5%的瓊脂糖膠電泳PCR產物，然后切下2300bp左右的目的條帶，再用博大泰克公司的"PCR產物快速膠回收試劑盒"回收切膠產物。(四)含有HSA-IFNa-2b融合基因的表達載體質粒的構建以下以HSA-IFNa-2b融合基因為例，說明表達載體質粒的構建方法。本實驗采用PYES31為表達載體質粒，其制備方法為常用分子生物學方法，即通過培養含有表達載體的菌種，提取獲得該質粒。制備好的質粒-2(TC保存待用。為了將HSA-IFNa-2b融合基因克隆到PYES31表達載體質粒中，先對表達載體質粒PYES31和HSA-IFNa-2b融合基因DNA用Kpnl和Xhol雙酶切。酶切體系表達載體質粒或HSA-IFNa-2b融合基因DNA，10pl;Kpnl，Xhol，lpl;10xMBuffer,2|il;ddH20，6|al。在37。C恒溫水浴鍋內反應23小時。然后用常用的分子生物學方法，分離獲得酶切后的DNA。具體是用1%的瓊脂糖膠電泳酶切產物，切下目的條帶，再用博大泰克公司的"PCR產物快速膠回收試劑盒"回收切膠產物。接著對酶切產物進行連接，獲得HSA-IFNa-2b融合基因表達載體(圖l)。連接體系一般為lO(il，solutionI連接酶占體系的一半，剩下一半體系中雙酶切的表達載體與雙酶切的HSA-IFNa-2bDNA的摩爾比為1:21:10，不足補加無菌水。16。C恒溫水浴鍋內反應2小時。13最后連接產物轉化感受態DH5a細胞。轉化使用博大泰克公司的高效DH5a感受態細胞及附帶的試劑操作。轉化體系為連接產物，lO)il;無菌水，30W;酶A，10^1。取一管感受態DH5a細胞加入上述混合液中，輕柔混勻后冰上放置30分鐘，再37。C放置10分鐘，加入50(Hi1LB液體培養基37。C，180r.p.m.培養30分鐘，取lOO)il轉化液涂于有氨芐青霉素抗性的LB固體培養板，37'C倒置培養1216小時。陽性克隆的鑒定是通過挑選陽性克隆抽提質粒，進行酶切和測序確定。(五)HSA-IFNa-2b融合蛋白表達工程酵母菌的構建本實驗利用電轉化方法為例，說明HSA-IFNa-2b融合蛋白表達工程酵母菌的構建方法。具體步驟如下首先挑選含有HSA-IFNa-2b融合基因的表達載體質粒的細菌克隆，提取表達載體質粒。然后，用電轉化的方法把質粒轉入釀酒酵母BJ5457中。質粒提取方法為常用的分子生物學方法，即通過培養含有表達載體的菌種，提取獲得該質粒。電轉化方法轉化釀酒酵母BJ5457。具體步驟如下(1)酵母菌體的準備。挑取酵母單菌落，接種至含有5mlYPD液體培養基的50ml三角瓶中，3(TC，250~300r.p.m.培養過夜。然后取100~500^1的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的2L三角搖瓶中，2830°C，250300r.p,m.培養過夜，至OD纖達到1.31.5。再將細胞培養物于4"C，1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸。離心后，再用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸。再離心，用20ml的冰預冷的lmol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。再離心，用lml的冰預冷的lmol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，使其終體積約為1.5ml。(2)電擊轉化。將520pg含有HSA-IFNa-2b融合基因的表達載體質粒DNA線性化，再溶解在510iilTE溶液中，與8(Hil的上述步驟(l)所得的酵母菌體混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中。將電轉化杯冰浴5min，然后根據相應的電轉化儀，采用優化的電壓、電流、電容等參數，進行電擊。電擊完畢后，加入lml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉至1.5ml的EP管中，將菌體懸液涂布于山梨醇選擇平板上，每200600W涂布一塊平板。將平板置于3(TC培養，直至單個菌落出現。本實驗推薦電擊參數為電壓1.5kV;電容25pF;電阻200Q。電擊時間為410毫秒。(3)酵母工程菌種子庫的建立。(所有操作均在無菌條件下進行)從轉化的山梨醇選擇平板上挑取810個克隆于放有5ml的SDA液體培養基的1415ml的玻璃試管中，30°C，250r.p.m.培養46天，使0D6G。大于1.0。取2^1菌液，加入20nl0.25%SDS，劇烈振蕩，90。C加熱3min。12000r.p.m.離心1分鐘，取上清。鑒定PCR反應體系為前述上清液，2^1;HSA1，2.5nl;HSA2，2.5W;PremixTaq(ExTaq)，25^1;ddH20，18pl。根據下列的程序進行反應開始，94°C2min;然后，94°Clmin，55°Clmin，72°C2min，一共30個循環；最后，72°C5min。用1.5。/。的瓊脂糖膠電泳PCR產物，如有1800bp左右的電泳條帶即為陽性克隆。(當然也可以使用引物IFN1與IFN2驗證IFN的PCR信號。)將陽性克隆剩余的培養液中取出200nl，用于SDS-PAGE電泳檢測。剩余的轉接于100ml的SDA液體培養基中，繼續培養。30°C，200r.p.m.培養3~5天，測定OD,值在4.0~5.0之間，轉接到200mlYPD液體培養基中繼續培養3h。在培養液中取出200^1，用于SDS-PAGE電泳檢測。選出有蛋白表達，并且表達量大于0.05mg/ml的克隆，室溫靜置lh，使菌體沉降，倒去部分上清，轉移到一無菌離心管測量體積，加入無菌甘油使甘油終濃度為1520%(v/v)，分裝，凍存，-8(TC保存。實施例3發酵工藝及參數的確定(一)接種量的控制從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于200mlSDA液體培養基中，置于30°C的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養24小時，測定OD6oo值在4.05.0之間。分別用5%~30%(v/v)的接種量接種于100mlYPD液體培養基的三角瓶中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養48小時。各個組的OD6oo與干擾素生物活性(比活性)如表1所示。結果顯示，在三角瓶中培養48小時，5%~30%(Wv)的接種量OD6oo與干擾素生物活性(比活性)相差不大，都可以接受。綜合考慮到成本因素，優選10%20%(v/v)的接種量。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(二)培養基配方的確定(1)蛋白胨、酵母提取物含量的確定在YPD液體培養基的基礎上，保持碳源為2%的葡萄糖，調整蛋白胨、酵母提取物的含量，以提高表達量和降低成本。從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于200mlSDA液體培養基中，置于30°C的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養24小時，測定OD,值在4.05.0之間。用10%(v/v)的接種量分別接種于100ml表2的液體培養基的三角瓶中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養72小時。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>每個配方培養72小時的OD6。。值和干擾素生物活性(比活性)如表3所示。結果顯示，在三角瓶中培養72小時，8號、9號、10號培養基配方活性最高，而且培養基的成本相對較低。所以培養基中較佳的蛋白胨、酵母提取物含量為0.5%~1.5%(w/v)的蛋白胨、1.5%~2.5%(w/v)的酵母提取物。(2)碳源的選擇在酵母培養基中常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇等。從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于200mlSDA液體培養基中，置于30°C的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養24小時，測定OD6oo值在4.0-5.0之間。用10%(v/v)的接種量分別接種于100ml表4的液體培養基的三角瓶中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養72小時。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注"％"表示％(w/v)，即100ml液體中含有溶質的質量(g)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>每個配方培養72小時的OD6加值和千擾素生物活性(比活性)如表5所示。結果顯示，用甘油作為碳源嚴重抑制了酵母的生長過程，從而也大大降低了蛋白的表達；而用蔗糖和葡萄糖作為碳源則較為合適。(3)微量元素的添加大多數的微生物發酵需要添加微量的金屬離子，這些金屬離子在代謝過程中發揮作用。從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于200mlSDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養24小時，測定OD,值在4.05.0之間。用10%(v/v)的接種量分別接種于100ml表6的液體培養基的三角瓶中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養72小時。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注"％"表示％(w/v)，即100ml液體中含有溶質的質量(g)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>每個配方培養72小時的OD6。。值和干擾素生物活性(比活性)如表7所示。結果顯示，在發酵培養基中添加微量的鐵(Fe2+)、銅(Cu2+)、錳(Mn2+)、鋅(Zn2+)等離子，既可以增加酵母菌的生長，又可以使目的蛋白的表達量增加。(4)pH值的確定在發酵的過程中，pH的變化取決于酵母細胞代謝特征、培養基配比和發酵環境條件。當然，細胞自身具有有限的調節pH的能力，當外界條件變化過于激烈時，細胞則失去自身的調節能力而受到外界環境的強烈干預，影響細胞的正常生長及表達。所以在酵母發酵的過程中，pH的控制是很重要的條件。從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于200mlSDA液體培養基中，置于30°C的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養24小時，測定OD,值在4.05.0之間。用10%(v/v)的接種量分別接種于100ml表8、表9不同pH值的液體培養基的三角瓶中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養72小時。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注"自然"表示配置好培養基后不調節pH值。經測定培養基自然pH值大于7.0。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注"自然"表示配置好培養基后不調節pH值。經測定培養基自然pH值大于7.0。表IO(對應表8液體培養基)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表ll(對應表9液體培養基)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>每個配方培養72小時的OD60()值和干擾素生物活性(比活性)如表10、表11所示。結果顯示，發酵培養基優選的pH值為5.56.5。(三)發酵過程中的補料(1)碳源的補加補糖控制在酵母工程菌的表達起重要作用，為此發明人考察了不同的補糖方式對蛋白表達的影響。從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于100mlSDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養。24小時后轉接入1升的SDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養約24小時，測定OD,值在4.0-5.0之間。以10%(v/v)的接種量接入BI0TECH-JS15L發酵罐的10升酵母培養基(1%(w/v)蛋白提取物，2%(w八O酵母粉，2%(w/v)蔗糖，調節pH6.0)中，溶氧不小于10%的飽和度，于30。C培養72小時。并在其過程中，發酵10個小時后，每4個小時取樣，測定糖的含量。在發酵的過程中，考察不同的補糖方式的影響。補糖方式①在發酵第14個小時流加1L20。/。(W/V)的蔗糖，在發酵第40個小時再流加1L乙醇。補糖方式②在發酵第12個小時流加0.5L20。/。(w/v)的蔗糖，在發酵第38個小時再流加0.5L乙醇。補糖方式③在發酵第16個小時流加1.5L20%(w/v)的蔗糖，在發酵第42個小時再流加1.5L乙醇。補糖方式④在發酵第14個小時流加1L20%(w/v)的蔗糖，在發酵第40個小時再流加1L20%(w/v)的蔗糖。補糖方式⑤在第14小時，開始流加250ml20X(w/v)的蔗糖，待糖基本消耗完全后每次流加250ml20%(wAO的蔗糖。不同補糖方式發酵的OD6oo值和干擾素生物活性(比活性)如表12所示。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于100mlSDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養。24小時后轉接入1升的SDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養約24小時，測定OD6oo值在4.0-5.0之間。以10%(v/v)的接種量接入BIOTECH-JS15L發酵罐的10升酵母培養基(1%(w/v)蛋白提取物，2%(w/v)酵母粉，2%(w/v)葡萄糖，調節pH6.0)中，溶氧不小于10%的飽和度，于3(TC培養72小時。并在其過程中，發酵10個小時后，每4個小時取樣，測定糖的含量。在發酵的過程中，考察不同的補糖方式的影響。補糖方式⑥在發酵第14個小時流加1L20。/。(w/v)的葡萄糖，在發酵第40個小時再流加1L乙醇。補糖方式⑦在發酵第12個小時流加0.5L20%(w/v)的葡萄糖，在發酵第38個小時再流加1.5L乙醇。補糖方式⑧在發酵第16個小時流加1.5L20%(w/v)的葡萄糖，在發酵第42個小時再流加0.5L乙醇。補糖方式(D:在發酵第14個小時流加1L20%(w/v)的葡萄糖，在發酵第40個小時再流加1L20%(w/v)的葡萄糖。補糖方式⑩在第14小時，開始流加250ml20%(w/v)的葡萄糖，待糖基本消耗完全后每次流加250ml20%(w/v)的葡萄糖。不同補糖方式發酵的OD,值和干擾素生物活性(比活性)如表13所示。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結果顯示，補糖方式①③、補糖方式⑥⑧的效果較好。因此優選在培養的第1216個小時流加0.51.5升20%(w/v)的葡萄糖或蔗糖，在培養的第38-42個小時再流加0.51.5升乙醇。在發酵的中后期維持低糖水平，適當增加乙醇的含量，使更多的碳源流向產物，有利于表達。(2)氮源的補加豐富的天然氮源是目的產物表達分泌所必需的，在本發明所述發酵培養基中，選擇酵母提取物和蛋白胨為發酵的天然氮源。從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于100mlSDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養。24小時后轉接入1升的SDA液體培養基中，置于30。C的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養約24小時，測定OD纖值在4.05.0之間。以10%(v/v)的接種量接入BI0TECH-JS15L發酵罐的10升酵母培養基(1%(w/v)蛋白提取物，2%(w/v)酵母粉，2%(w/v)蔗糖，調節pH6.0)中，溶氧不小于10%的飽和度，于30。C培養72小時。補加氮源方式發酵第12小時補加1L10xYP母液(酵母提取物與蛋白胨的混合物)。不同補加氮源方式發酵的OD,值和干擾素生物活性(比活性)如表14所示。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>的氮源已經足夠用于細胞的生長和目的蛋白的表達。(四)發酵時間的確定在發酵的過程中，要求達到的目標不同，因而對決定發酵時間的發酵終點的判斷有所不同。本發明的目的是得到高生物活性的目的重組融合蛋白，而不是得到高濃度的菌體或次生代謝物，因此發酵時間的長短非常重要，發酵時間過長，菌體發生自溶，影響蛋白的活性，發酵時間過短，表達量降低。從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于100mlSDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養。24小時后轉接入1升的SDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養約24小時，測定OD纖值在4.0-5.0之間。以10%(v/v)的接種量接入BIOTECH-JS15L發酵罐的10升酵母培養基(1%(w/v)蛋白提取物，2%(w/v)酵母粉，2%(w/v)蔗糖，調節pH6.0)中，溶氧不小于10%的飽和度，于30。C分別培養42~90小時。在發酵第14個小時流加1L20%的蔗糖，在發酵第40個小時再流加1L乙醇。不同發酵時間的OD6oo值和干擾素生物活性(比活性)如表15所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結果顯示，隨著培養時間的延長，酵母菌濃度增加，并且目的蛋白的生物活性在60小時達到最高峰。這可能是隨著培養時間的增加，菌體代謝物或菌體破裂釋放的蛋白酶降解了部分目的蛋白。因此，本發明發酵(培養)時間優選6090小時，更優選6072小時，最優選60小時。(五)最佳發酵方案從酵母工程菌種子庫中取出冷凍甘油種子管，用移液管吸lml種子液接種于100mlSDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養。24小時后轉接入1升的SDA液體培養基中，置于3(TC的恒溫旋轉式振蕩器上200轉/分培養約24小時，測定OD,值在4.0~5.0之間。以10%(v/v)的接種量接入BIOTECH-JS15L發酵罐的10升酵母培養基(1%(w/v)蛋白提取物，2%(wZv)酵母粉，2%(w/v)蔗糖，調節pH6.0)中，溶氧不小于10%的飽和度，于3(TC分別培養60小時。在發酵第14個小時流加1L20%的蔗糖，在發酵第40個小時再流加1L乙醇。實施例4HSA-IFNa-2b融合蛋白的捕獲與純化(1)重組融合蛋白的捕獲采用STREAMLINESP-XL柱捕獲重組融合蛋白。具體步驟為收集上述發酵結束后的發酵液(實施例3(五))，調節電導小于5.0ms/cm，用醋酸調節pH至5.0;掛經50mMpH5.0NaAc緩沖液平衡的STREAMLINESP-XL柱；上樣結束后，用25mMNaAc(pH5.0)緩沖液淋洗柱子，洗去雜蛋白及未吸附的蛋白，至UV檢測儀讀數到基線；用50mMNaAc，200mMNaCl(pH5.0)的緩沖液洗脫，UV檢測儀讀數收集目的峰。(2)精細純化1將STREAMLINESP-XL柱層析中收集的巨的洗脫峰用1倍體積的5MNaCl，50mMPB(pH6.5)緩沖液稀釋，調pH6.5。采用ButylSepharoseFF柱精細純化1。具體步驟為將上述稀釋處理的樣品掛經50mMPB，2.5MNaCl(pH6.5)緩沖液平衡的ButylSepharoseFF柱；上樣結束后，用2.5MNaCl，50mMPB(pH6.5)緩沖液淋洗柱子，洗去雜蛋白及未吸附的蛋白，至UV檢測儀讀數到基線；用50mMPB，0.8MNaCl(pH6.5)的緩沖液洗脫，UV檢測儀讀數為20左右時收集洗脫峰。(3)精細純化2將ButyleSepharoseFF柱層析中收集的目的洗脫峰經透濾(Diafiltration)的方法脫鹽，調節樣品的緩沖系統為30mMNaCl，25mMPB(pH7.2)。采用DEAEsepharoseFF柱精細純化2。具體步驟為將上述透濾處理的樣品掛經30mMNaCl，25mMPB(pH7.2)緩沖液平衡的DEAEsepharoseFF柱；上樣結束后，用30mMNaCl，25mMPB(pH7.2)淋洗柱子，至UV檢測儀讀數到基線；用200mMNaCl，25mMPB(pH7.2)的緩沖液洗脫，并收集洗脫峰。精細純化2的洗脫峰即為HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品，用實施例5的方法對其進行質量檢測。實施例5HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品的質量檢測(一)BCA法測樣品蛋白含量使用Pierce公司的BCA蛋白測定試劑盒測定實施例4得到的HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品的蛋白含量。結果顯示，實施例4得到的HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品的蛋白含量為1.8mg/ml。(二)干擾素生物活性(比活性)的測定按照《中華人民共和國藥典》2005年版三部，附錄XC的方法將實施例4得到的HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品進行干擾素生物活性(比活性)的測定。結果顯示，實施例4得到的HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品的比活性為5.23><105IU/mg。(三)SDS-PAGE電泳按照《中華人民共和國藥典》2005年版三部，附錄IVC的方法將實施例4得到的HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺電泳法，分離膠膠濃度為10%，上樣量為IO嗎(考馬氏亮藍R250染色法)，結果經掃描儀掃描，軟件計算得出樣品純度大于95.0%。用還原型SDS-聚丙烯酰胺電泳法，分離膠膠濃度為10%，上樣量為2.0嗎，結果計算得出樣品的分子量為85.7KD±10%(圖2)。(四)高效液相色譜法測定蛋白純度按照《中華人民共和國藥典》2005年版三部，附錄IIIB的方法將實施例4得到的HSA-IFNa-2b融合蛋白樣品使用高效液相色譜法測定蛋白純度。用面積歸一化法測量各雜質峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各雜質峰面積及其之和占總峰面積的百分率。實驗結果見圖3。根據樣品的HPLC峰圖，流動相為0.05mol/L磷酸鹽，O.lmol/L氯化鈉緩沖液(pH7.0)，上樣量不低于20嗎，用波長280mn檢測。結果純度高于95.0%。盡管本發明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。權利要求1.一種制備重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟a)構建含有重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白基因的表達質粒；b)將步驟a)得到的含有重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白基因的表達質粒轉化到酵母工程菌中，建立表達重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白的酵母工程菌種子庫；c)將步驟b)得到的酵母工程菌種子庫中的酵母種子菌以5％～30％v/v的接種量接種于酵母培養基中，溶氧不小于10％的飽和度，25℃～37℃培養60～90小時；d)收集上清發酵液，分離純化出所述重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白中的干擾素a選自干擾素a-2a、干擾素a-lb、或干擾素a-2b。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達質粒可以在酵母工程菌中組成型表達。4.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述酵母工程菌是釀酒酵母。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母培養基是由0.5%1.5%w/v的蛋白胨、1.5%2.5%w/v的酵母提取物、2.0%w/v的葡萄糖或2.0%w/v蔗糖、以及微量金屬元素組成的。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述微量金屬元素包括亞鐵離子、銅離子、錳離子、以及鋅離子。7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母培養基的起始pH值為5.5~6.5。8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟d)中，所述分離純化的方法是采用層析方法。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述層析方法選自親和層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、反向層析或其組合。10.用權利要求1-9任一項所述方法制得的重組人血清白蛋白與干擾素a融合蛋白。全文摘要本發明公開了一種制備重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白的方法，包括如下步驟a)構建含有重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白基因的表達質粒；b)將步驟a)得到的含有重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白基因的表達質粒轉化到酵母工程菌中，建立表達重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白的酵母工程菌種子庫；c)將步驟b)得到的酵母工程菌種子庫中的酵母種子菌以5％～30％(v/v)的接種量接種于酵母培養基中，溶氧不小于10％的飽和度，25℃～37℃培養60～90小時；d)收集上清發酵液，分離純化出所述重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白。本發明還涉及一種用上述方法制得的重組人血清白蛋白與干擾素α融合蛋白，該種重組融合蛋白的純度高、生物活性強，作為藥物的活性成分，可以安全、有效地應用于人體。文檔編號C12N15/62GK101665798SQ20081021577公開日2010年3月10日申請日期2008年9月6日優先權日2008年9月6日發明者萍楊申請人:浙江德清安平生物制藥有限公司