專利名稱：一種玻璃化冷凍承載器及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種保存生物物質的冷凍承載器及其使用方法，具體涉及一種保存生物物質的玻璃化冷凍承載器及其^f吏用方法。
背景技術：
目前，用于保存生物物質的玻璃化冷凍承載器有多種，如Cryoloop，Cryoleaf, Cryotip, electron microscopic grid等，其應用效果相似,{旦是都有一個共同的缺點，就是不能隔離液氮。將細胞裝入承載器后，細胞直接與液氮接觸，容易造成液氮污染以及液氮與樣品之間的交叉污染。目前，本領域技術人員對玻璃化承載器作了很多嘗試，如用拉長的脈管或玻璃毛細管用作細胞或胚胎的承載器，雖然取得了一定的成功，但還是不能完全解決冷凍速率以及液氮污染等問題。
發明內容
針對以上技術缺陷，本發明涉及一種新的保存生物物質的玻璃化冷凍承載器，所述玻璃化冷凍承載器包括內微管3、內帽1、內環4、薄膜2、外管7、外管孔6和外帽5;其中，所述內微管3其上端開口與內帽1相連并穿過內帽1使其開口與外界相通且由外帽5封閉，內微管3下端開口與內環4相連。
本發明玻璃化冷凍承載器，所述薄膜2密閉內環4或密閉內微管3和內環4，或者與內環4為統一整體，其中本發明優選薄膜2密閉內微管3和內環4; 薄膜2與內帽1可以相連也可以不相連。
其中，所述薄膜2為透明、高韌性、高熱傳導性的薄膜，具體如聚乙烯、聚丙烯薄膜，聚氟乙烯薄膜。本發明玻璃化冷凍承載器中，所
4述內微管3的內徑為140_450|im,內微管3的長度為2cm-4cm。
本發明玻璃化冷凍承載器中，所述內環4的形狀為密閉型的圓形、密閉型的橢圓形、密閉型的水滴形或者半開口弓形。密閉型內環即內環正好與內管形成統一的整體，沒有斷口；半開口弓形即其中一端與內管相連，另外一端與內管不相連，利用弓形材料的韌性使薄膜撐開。
本發明玻璃化冷凍承載器中，所述內帽1的直徑大于外管7的內徑且小于外管7的外徑。
本發明玻璃化冷凍承載器中，所述外管7上端開有外管孔6，用以滲入液氮。
本發明玻璃化冷凍承載器中，所述內微管3、內帽1、外管7及外帽5由透明、耐超低溫或具有高熱傳導性的材料制成，如聚氟管、聚碳酸酯管。
內環4由金屬絲制成，例如銅絲、鋼絲或者鉑金絲等；本發明內環4也可以由其它的具有 一定強度的絲狀材料諸如塑料絲或者尼龍絲等制成。
本發明還提供一種玻璃化冷凍承載器的使用方法，所述方法包括如下步驟
1 )用拉細的巴斯德滴管或毛細管將生物物質8連帶少量冷凍液通過內微管3放置于內環4內，然后用蓋上內帽l;
2)將帶有生物物質的內微管3、內環4、內帽1浸入液氮容器中的液氮中，其中內帽1的上端部分不完全浸入液氮，之后將外管7也浸入該液氮中，在該液氮中將帶有生物物質的內微管3、內環4、內帽l裝入外管7中，蓋上外帽5，并于液氮中保存。
本發明中，所述生物物質為各種類型的細胞或者胚胎，或者直徑大小為100-300(xm的組織塊。
本發明方法中，由于液體和薄膜之間的表面張力使得生物物質被緊夾于兩層薄膜之間，并使得生物物質周圍所含的液體量達到最少。
本發明玻璃化冷凍承載器避免了生物物質與液氮直接接觸，減少了液氮污染，且操作迅速、安全和便捷；另外，采用本發明方法保存生物物質，由于液體與膜之間的表面張力，使得玻璃化冷凍時生物物質周圍含有最少量的冷凍液，無需精確控制置于環上液體的量，提高了冷凍效果。
圖1為玻璃化冷凍承載器的結構示意圖；圖2為玻璃化冷凍承載器的局部示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和優選實施例對本實用新型作進 一 步的說明，但本發明并不僅受其限制
如圖1和圖2所示的一種玻璃化冷凍承載器，圖2為玻璃化冷凍承載器的局部結構示意圖。該承載器包括內微管3、內帽1、內環4、薄膜2、外管7及外帽5。其中，內微管3上端開口與內帽1相連并穿過內帽1使其開口與外界相通且由外帽5封閉，內微管3下端開口與內環4相連，環內中央為生物物質8;薄膜2封閉內微管3和內環4，外管7中充滿液氮9,并在外管7的上部開有外管孔6。
實施例1:將人卵母細胞置于玻璃化承載器中的冷凍
(1) 將2 - 3枚人卵母細胞在成分為改良人輸卵管液(mHTF ) +20%血清替代物(sss) +7.5%乙二醇(EG) +7.5%二曱基亞砜(DMSO )的液體中處理4-5分鐘后，轉移至最終冷凍液(mHTF+20%sss+15 % EG +15%DMSO+0.5M蔗糖(Sucrose)中；
(2) 將卵母細胞連帶少量的冷凍液一起吸入外徑180士20jxm、內徑160±20|im的巴斯德滴管內；
(3) 將拉細的巴斯德滴管頭部沿著內徑為220pm內微管3插入密閉內環4內，并將卵母細胞及少量的冷凍液置于環內聚乙烯薄膜2上;
6(4)將帶有卵母細胞的內環4、內微管3及內帽1部分浸入液氮 容器中的液氮中，其中內帽1的上端部分不完全浸入液氮，之后將外管7 也浸入該液氮中，在該液氮中將帶有生物物質的內^f斂管3、內環4、 內帽1裝入外管7中，蓋上外帽5，液氮中進行保存。
實施例2:人8-細胞胚胎半開口弓形內環內玻璃化冷凍 (1)將2-3枚人8-細胞胚胎在成分為mHTF+20%sss+7.5%EG + 7.5%PROH (1,2丙二醇)的液體中處理4-5分鐘后，轉移至最終 冷凍液(mHTF+20%sss+15Q/。EG + 15%PROH+0.5M Sucrose)中；
(2 )將胚胎連帶少量的冷凍液 一 起吸入外徑180±20|im 、 內徑160土20(im的巴斯德滴管內；
(3) 將拉細的巴斯德滴管頭部沿著內徑為220pm的內微管3插入 半開口弓形內環4內，并將胚胎及少量的冷凍液置于環內聚丙烯薄膜2 上；
(4) 將帶有胚胎的內環4、內微管3及內帽1部分浸入液氮容器中的 液氮中，之后將外管7也浸入該液氮中，在該液氮中將帶有生物物質的 內孩i管3、內環4、內帽1裝入外管7中，蓋上外帽5，液氮中進行保存。
權利要求
1.一種玻璃化冷凍承載器，其特征在于，所述承載器包括內微管(3)、內帽(1)、內環(4)、薄膜(2)、外管(7)、外管孔(6)和外帽(5)。
2. 根據權利要求1所述的承載器，其特征在于，所述內微管(3)上端開口與內帽(i )相連并穿過內帽(1 )使其開口與外界相通且由外帽(5)封閉，內微管(3)下端開口與內環(4)相連。
3. 根據權利要求2所述的承載器，其特征在于，所述薄膜(2)密閉內環(4)、或密閉內微管(3)和內環(4),或者與內環(4)為統一整體。
4. 根據權利要求3所述的承載器，其特征在于，所述內微管(3)的長度為2 - 4cm;內微管(3 )的內徑為140 - 450(im。
5. 根據權利要求4所述的承載器，其特征在于，所述內環(4)的形狀為密閉型的圓形、密閉型的橢圓形、密閉型的水滴形或者半開口弓形。
6. 根據權利要求5所述的承載器，其特征在于，所述內帽(1)的直徑大于外管(7)的內徑且小于外管(7)的外徑。
7. 根據權利要求6所述的承載器，其特征在于，所述外管(7)上端開有外管孔(6)。
8. 根據權利要求7所述的承載器，其特征在于，所述薄膜(2)為具有透明、高韌性、高熱傳導性的薄膜。
9. 根據權利要求8所述的承載器，其特征在于，所述內微管(3)、內帽(1)、外管(7)及外帽(5)由透明、耐超低溫或具有高熱傳導性的材料制成；內環(4)由金屬絲、塑料絲或者尼龍絲制成。
10. 權利要求l-9任一項所述玻璃化冷凍承載器的使用方法，其特征在于，包括如下步驟1) 用拉細的巴斯德滴管或毛細管將生物物質連帶少量冷凍液通過內微管(3)放置于內環(4)內，然后用蓋上內帽Q);2) 將帶有生物物質的內微管(3)、內環(4)、內帽(1)浸入液氮，之后將外管(7)浸入液氮中，在液氮中將帶有生物物質的內微管(3)、內環(4)、內帽(1)裝入外管(7)中，蓋上外帽(5),并于液氮中保存。
全文摘要
本發明涉及一種保存生物物質的玻璃化冷凍承載器及其使用方法，所述玻璃化冷凍承載器包括內微管(3)、內帽(1)、內環(4)、薄膜(2)、外管(7)、外管孔(6)和外帽(5)，其中，所述內微管(3)上端開口與內帽(1)相連并穿過內帽(1)使其開口與外界相通且由外帽(5)封閉，內微管(3)下端開口與內環(4)相連。本發明承載器避免了生物物質與液氮的直接接觸，減少液氮污染；且操作迅速、安全和便捷。
文檔編號C12M1/24GK101671627SQ20081021568
公開日2010年3月17日 申請日期2008年9月12日 優先權日2008年9月12日
發明者吳克良, 媛 李, 陳子江 申請人:陳子江