一種具有增強免疫功能的有機分子肽乳及其制備方法

專利名稱：一種具有增強免疫功能的有機分子肽乳及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有增強免疫功能的有機分子肽乳及其制備方法。
背景技術：
分子免疫佐劑是指本身就具有免疫刺激效應的DNA (即CpGDNA)和可 在體內表達各種免疫相關分子的重組質粒DNA 。這些免疫相關分子包括細胞 因子、免疫共剌激分子、免疫剌激調節分子、及其新型分子佐劑補體C3d等。
CpGDNA,即含CpG基序的DNA或寡核苷酸(ODN)，統稱為CpG 0DN。目前 研兔表明，含CpG基序的細菌DNA和ODN可以激活多種免疫細胞，誘導其分泌 不同的細胞因子及免疫球蛋白。在激發非特異性免疫應答、增強抗原特異性 免疫應答及調控免疫應答類型(Thl及Th2型)等方面發揮重要作用。CpG 0DN能弓i起B細胞分化,直接刺激B細胞分泌IL-6、 IL-10等細胞因子和免疫 球蛋白，誘導B細胞表面共刺激分子的表達，包括MHC II 、 B7-1和B7-2等。CpG 0DN能直接激活抗原提呈細胞(APC),包括單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細 胞，誘導其產生IL-12 、 TNF-a等Thl型為主的細胞因子，并可上調MHC和 共刺激分子的表達。CpG 0DN能與APC分泌的IL-12和IL-18協同剌激NK細 胞分泌IFN- Y ，提高其溶菌活性，IFN- Y反過來又可以激活APC。 CpG 0DN現已 應用于誘導天然保護性免疫,預防感染，作為Thl極化佐劑、核酸疫苗以及 基因治療中。
細胞因子是體內免疫細胞或非免疫細胞產生的一組具有廣泛生物活性 的異質性肽類調節因子，在體內能激活和調節免疫活性細胞，對免疫應答的 產生和調節具有重要作用。近年來人們發現多種細胞因子(如GM-CSF、 IFN-Y、 IL-2、 IL-4和IL-12)具有免疫佐劑作用，可不同程度的增強DNA疫苗 的免疫效果，并可引導機體免疫朝有利的方向轉化。共刺激分子和免疫刺激 調節因子的質粒也能夠加強機體的免疫應答。在天然免疫應答及獲得性免疫 應答過程中，細胞因子表現出重要的功能，可以維持機體的生理平衡，抵抗 病原微生物的侵襲，防止腫瘤發生。
5有機農業包括所有能促進環境、社會和經濟良性發展的農業生產系統。 這些系統將農地土壤肥力作為成功生產的關鍵。通過尊重植物、動物和景觀 的自然能力，達到使農業和環境各方面質量都最完善的目標。有機農業利用 強有力的自然規律來增加農業產量和抗病能力。有機食品是以有機農業生產 體系為前提，在其生產和加工過程中禁止使用農藥、化肥、激素等人工合成 物質。

發明內容
本發明的目的在于提供一種具有增強免疫功能的有機分子肽乳；本發明 的另一 目的在于提供一種有機分子肽乳的制備方法。 本發明目的是通過如下技術方案實現的
本發明具有增強免疫功能的有機分子肽乳，通過接種CpG 0DN-pUC質粒 的免疫奶牛所產牛奶制得，其中構建CpG 0DN-pUC質粒添加的CpG基因序列 如SEQ ID NO: 1所示。
本發明有機分子肽乳的制備還包括如下步聚
1、 構建CpG 0DN-pUC質粒
采用pUC質粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構建成重組CpG ODN-pUC 質粒，CpG基因序列為
5， GCGCAGATCTGACGTTMCGTTMCGTTAGATCTMCGTTMCGTTMCGTTMCGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；
2、 在大腸桿菌中擴增CpG 0DN :
將含有上述方法構建的CpG ODN-pUC質粒轉化到非致病性大腸桿菌(五 cW力中，挑一個單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養基中，其中每 1000ml LB培養基中含有lml氨芐青霉素和15-20g的瓊脂，于37 。C下培養 24-36小時，至飽和狀態；
3、 用堿裂解法提取CpG ODN-pUC質粒，或采用商用質粒提取試劑盒提
取；
4、 用聚i二醇沉淀法對提取的CpG ODN-pUC質粒進行純化；
5、 電泳檢測CpG ODN-pUC質粒的分子量，大于pUC載體100bp,并采用紫 外分光光度法測定CpG 0DN-pUC質粒的含量，含有CpG ODN-pUC質粒不少于l
6毫克，于-2(TC保存備用；
6、 免疫接種奶牛
選取有機農業系統喂養的奶牛，于分娩前一個月進行免疫注射；注射方 法為取保存備用CpG ODN-pUC質粒，對奶牛進行皮下注射，注射劑量為 0. l-10.0mg/頭，第14天加強一次，劑量為O. l-10.0mg/頭；
7、 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測細胞因子的商用酶 聯免疫試劑盒測定細胞因子IL-2, IL-6， IL-10， IL-12, IFN-y ， TNF-a的含 量，牛奶內各細胞因子的含量是未免疫奶牛所產牛奶的2-IO倍，若細胞因子 含量達不到此水平，則再加強免疫接種一次，劑量為0.1-10.0mg/頭；
8、 上述含有多種細胞因子的牛奶即為本發明有機分子肽乳；或者在有
機分子肽乳中加入常規輔料制備成其他飲品。
本發明通過構建CpG ODN-pUC質粒，在大腸桿菌中大量擴增含CpG ODN基 因的質粒，提取并純化質粒，然后將CpG 0DN-pUC質粒皮下注射入有機農業 系統的高產奶牛體內，激發了非特異性免疫應答、增強抗原特異性免疫應答， 誘導其分泌各種細胞因子，通過對牛奶進行細胞因子的檢測，發現奶牛的乳 汁中也含有各種細胞因子，最后把其乳汁收集包裝生產成"有機分子肽乳"。 飲用有機分子肽乳，就能夠提高機體免疫力，抗腫瘤，預防疾病增強體質的 功效。本發明的創新點在于采用CpG ODN等分子佐劑，對有機農業系統中的 奶牛進行免疫接種，使其牛奶中含有多種對人體有益的細胞因子并制成有機 分子肽乳制品用于人類的保健，同時，免疫奶牛能夠自身提高免疫力，增加 常規免疫疫苗的應答水平，進一步提高奶牛的抗病防病能力，具有重要的理 論意義和應用前景。
下述實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發明。 實驗例l本發明所述CpG ODN質粒對奶牛細胞因子的影響。
用實施例l的方法免疫乳牛，收集乳牛分娩后15天的牛乳5-10ml (每24小 時收集一次)，將收集到的乳樣于4"C 5000rpm離心15min，除去脂肪及沉淀， 于水浴鍋中升溫至35。C，添加O. 02%的凝乳酶(酶效價為50， 000) ， 35。C保溫 凝乳40min，凝乳后于5000rpm 4。C離心20min，收集乳清并分裝，-2(TC保存采用檢測細胞因子的商用酶聯免疫試劑盒，測定采集牛奶IL-2， IL-6， IL-IO， IL-12, IFN-y等含量，掌握免疫后細胞因子分泌的規律。
試驗結果如表1，每頭含CpG ODN質粒lmg和每頭含CpG ODN質粒2mg 的注射奶牛，均可顯著提高奶牛血清、牛奶中細胞因子含量。
表1 CpG ODN質粒對牛奶中細胞因子含量的影響
組別y-IFNIL-2IL-6IL-IOIL-12
CpG ODN注射組290600550630550
普通組140170165172170
結果表明，本發明所述的注射了CpG ODN質粒的奶牛產出的牛奶與普通 牛奶相比，其中IL-2，IL-6， IL-10, IL-12, IFN-y等細胞因子的含量均有 明顯增長。
實驗例2本發明實施例l方法制得的肽奶的功能鑒定實驗
將本發明實施例l所述的免疫牛分泌的牛奶經138t:超高溫滅菌處理2s; 取SPF級昆明小鼠90只，4 6周齡，雌雄各半，隨機分為3組，每組30只；A 組給予有機分子肽乳l.O ml/天灌胃；B組給予純牛奶1.0ml/天灌胃，C組給 予生理鹽水1.0ml/天灌胃；連續灌胃15天后，調整初始細胞數約0.7X 106/ml，以細胞計數法觀察小鼠淋巴細胞轉化試驗；連續灌胃30天后，以MTT 法觀察小鼠淋細胞轉化試驗；連續灌胃90天后，以MTT法觀察小鼠淋巴細胞 轉化試驗，結果如表2。
表2本發明肽乳對小鼠淋巴細胞增殖活力的影響
細胞培養時15天30天90天
組別間(細胞計數X106)(MTT法OD值)(MTT法OD值)
A組72h5. 525 ±0. 7221,20.268±0.021,20. 389 ±0.0531,2
B組72h1.246 ±0.23930.158 ±0.00730.187 ± 0.00393
C組72h0.837±0.3190.142 ±0.0220.158 ±0.053
結果表明，灌胃15天時給予有機分子肽乳的A組小鼠與其他兩組小鼠相 比，淋巴細胞計數明顯增多，灌胃30天和90天時給予有機分子肽乳的A組小鼠 與其他兩組小鼠相比，以MTT法觀察小鼠淋巴細胞的OD值差異明顯，由此可見， 本發明有機分子肽乳對小鼠淋巴細胞的增值活力有顯著增強的作用。下述實施例均能實現本發明所述實驗例的有益效果。
具體實施例方式
實施例l:本發明有機分子肽乳的制備工藝
1、 構建CpG 0DN-pUC質粒
采用pUC質粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構建成重組CpG 0DN-pUC 質粒，CpG基因序列為
5，GCGCAGATCTGACGTTMCGTTMCGTTAGATCTAACGTTMCGTTMCGTTAACGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；
2、 在大腸桿菌中擴增CpG 0DN :
將含有上述方法構建的CpG ODN-pUC質粒轉化到非致病性大腸桿菌(￡ 7力中，挑一個單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養基中，其中每 1000ml LB培養基中含有lnil氨芐青霉素和19g的瓊脂，于37 。C下培養35 小時，至飽和狀態；
3、 用堿裂解法提取CpG 0DN-pUC質粒；
4、 用聚乙二醇沉淀法對提取的CpG 0DN-pUC質粒進行純化；
5、 電泳檢測CpG ODN-pUC質粒的分子量，大于pUC載體100bp，并采用紫 外分光光度法測定CpG 0DN-pUC質粒的含量，含有CpG 0DN-pUC質粒不少于l 毫克，于-2(TC保存備用；
6、 免疫接種奶牛
選取有機農業系統喂養的奶牛，于分娩前一個月進行免疫注射；注射方 法為取保存備用CpG 0DN-pUC質粒，對奶牛進行皮下注射，注射劑量為 1.0-3.0mg/頭，第14天加強一次，劑量為1.0-3.0mg/頭；
7、 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測細胞因子的商用酶 聯免疫試劑盒測定細胞因子IL-2， IL-6， IL-10， IL-12， IFN-y等含量，牛 奶內各細胞因子的含量是未免疫奶牛所產牛奶的2-10倍，若細胞因子含量達 不到此水平，則再加強免疫接種一次，劑量為1.0-3.0mg/頭；
8、 上述含有多種細胞因子的牛奶即為本發明有機分子肽乳。 實施例2:本發明有機分子肽乳的制備工藝
1、構建CpG ODN-pUC質粒采用pUC質粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構建成重組CpG 0DN-pUC 質粒，CpG基因序列為
5， GCGCAGATCTGACGTTMCGTTMCGTTAGATCTMCGTTMCGTTMCGTTMCGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；
2、 在大腸桿菌中擴增CpG ODN :
將含有上述方法構建的CpG ODN-pUC質粒轉化到非致病性大腸桿菌(￡ ②7力中，挑一個單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養基中，其中每 1000ml LB培養基中含有lml氨節青霉素和16g的瓊脂，于37 'C下培養25
小時，至飽和狀態；
3、 采用商用質粒提取試劑盒提取CpG ODN-pUC質粒；
4、 用聚乙二醇沉淀法對提取的CpG ODN-pUC質粒進行純化；
5、 電泳檢領!!CpG ODN-pUC質粒的分子量，大于pUC載體100bp，并采用紫 外分光光度法測定CpG ODN-pUC質粒的含量，含有CpG ODN-pUC質粒不少于l 毫克，于-2(TC保存備用；
6、 免疫接種奶牛
選取有機農業系統喂養的奶牛，于分娩前一個月進行免疫注射；注射方 法為取保存備用CpG ODN-pUC質粒，對奶牛進行皮下注射，注射劑量為 6.0-9.0mg/頭，第14天加強一次，劑量為6.0-9.0mg/頭；
7、 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測細胞因子的商用酶 聯免疫試劑盒測定細胞因子IL-2， IL-6， IL-10， IL-12， IFN-Y等含量，牛 奶內各細胞因子的含量是未免疫奶牛所產牛奶的2-10倍，若細胞因子含量達 不到此水平，則再加強免疫接種一次，劑量為6.0-9.0mg/頭；
8、 在上述含有多種細胞因子的牛奶中加入常規輔料制備成其他飲品。
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SEQUENCE LISTING
<110〉皇東震j大地乳業有限公司
〈120〉 一種具有增強免疫功能的有機分子肽乳及其 制備方法
〈130〉 000
〈160〉 1
〈170> Patentln version 3. 3
〈210> 1
〈211〉 80
〈212〉 腿 <213〉人工序列
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gcgcagatct gacgttaacg ttaacgttag atctaacgtt aacgttaacg ttaax)gtta^ 60
cgttgacgtt agatctccgg
80
權利要求
1、一種含CpG基因序列的寡核苷酸CpG ODN，其中含有的CpG基因序列如SEQID NO1所示。
2、 一種具有增強免疫功能的有機分子肽乳，通過接種CpG ODN-PUC質 粒的免疫奶牛所產牛奶制得，其特征在于構建CpG ODN-pUC質粒添加的CpG 基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
3、 如權利要求2所述的有機分子肽乳，其特征在于該肽乳由如下方法制成(1) 構建CpG ODN-PUC質粒采用pUC質粒，將CpG基因克隆到PUC載體，構建成重組CpG ODN-pUC 質粒，CpG基因序列為5，GCAGATCTGACGTTAACGTTAACGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；(2) 在大腸桿菌中擴增CpG ODN :將含有上述方法構建的CpG ODN-pUC質粒轉化到非致病性大腸桿菌(￡ "h')中，挑一個單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養基中，其中每 1000ml LB培養基中含有lml氨芐青霉素和15-20g的瓊脂，于37 'C下培養 24-36小時，至飽和狀態；(3) 用堿裂解法提取CpG ODN-pUC質粒，或采用商用質粒提取試劑盒提取；(4) 用聚乙二醇沉淀法對提取的CpG ODN-pUC質粒進行純化；(5) 電泳檢測CpGODN-pUC質粒的分子量，大于pUC載體100bp，并采用 紫外分光光度法測定CpG ODN-pUC質粒的含量，含有CpG ODN-pUC質粒不少于 l毫克，于-20。C保存備用；(6) 免疫接種奶牛選取有機農業系統喂養的奶牛，于分娩前一個月進行免疫注射；注射方 法為取保存備用CpG ODN-pUC質粒，對奶牛進行皮下注射，注射劑量為 0. 1-10.0mg/頭，第14天加強一次，劑量為O. 1-10.0mg/頭；(7) 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測細胞因子的商用 酶聯免疫試劑盒測定細胞因子IL-2， IL-6， IL-IO， IL-12， IFN-Y，TNF-a的 含量，牛奶內各細胞因子的含量是未免疫奶牛所產牛奶的2-10倍，若細胞因 子含量達不到此水平，則再加強免疫接種一次，劑量為O. l-10.0mg/頭；(8) 上述含有多種細胞因子的牛奶即為有機分子肽乳；或者在有機分 子肽乳中加入常規輔料制備成其他飲品。
4、 如權利要求2或3所述的有機分子肽乳的制備方法，該有機分子肽 乳是由免疫了 CpG ODN-pUC質粒的奶牛所產牛奶制得，其特征在于該方法中 免疫過程中構建CpG ODN-pUC質粒添加的CpG基因序列如SEQ ID NO: 1所 示。
5、 如權利要求2或3所述的有機分子肽乳的制備方法，其特征在于該 方法包括如下步驟(1) 構建CpG ODN-pUC質粒采用pUC質粒，將CpG基因克隆到pUC載體，構建成重組CpG ODN-pUC 質粒，CpG基因序列為 5' GCGCAGATCTGACGTTAACGTTMCGTTAGATCTAACGTTAACGTTAACGTTAACGTTA ACGTTGACGTTAGATCTCCGG 3，，如SEQ ID NO: 1所示；(2) 在大腸桿菌中擴增CpG ODN :將含有上述方法構建的CpG ODN-pUC質粒轉化到非致病性大腸桿菌(￡ cW力中，挑一個單菌落接種于含瓊脂、氨芐青霉素的LB培養基中，其中每 1000ml LB培養基中含有1ml氨芐青霉素和15-20g的瓊脂，于37 'C下培養 24-36小時，至飽和狀態；(3) 用堿裂解法提取CpG ODN-pUC質粒，或采用商用質粒提取試劑盒提取；(4) 用聚乙二醇沉淀法對提取的CpG ODN-pUC質粒進行純化；(5) 電泳檢測CpG ODN-pUC質粒的分子量，大于pUC載體100bp,并采用 紫外分光光度法測定CpG ODN-pUC質粒的含量，含有CpG ODN-pUC質粒不少于 l毫克，于-2(TC保存備用；(6) 免疫接種奶牛選取有機農業系統喂養的奶牛，于分娩前一個月進行免疫注射；注射方 法為取保存備用CpG 0DN-pUC質粒，對奶牛進行皮下注射，注射劑量為 0. 1-10.0mg/頭，第14天加強一次，劑量為O. l-10.0mg/頭;(7) 每周收集一次免疫奶牛的血清、牛奶，采用檢測細胞因子的商用 酶聯免疫試劑盒測定細胞因子IL-2，IL-6， IL-10， IL-12， IFN-Y，TNF-a的 含量，牛奶內各細胞因子的含量是未免疫奶牛所產牛奶的2-IO倍，若細胞因 子含量達不到此水平，則再加強免疫接種一次，劑量為O. l-10.0mg/頭；(8) 上述含有多種細胞因子的牛奶即為有機分子肽乳；或者在有機分 子肽乳中加入常規輔料制備成其他飲品。
6、如權利要求2或3所述的有機分子肽乳在制備具有增強免疫功能飲 品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有增強免疫功能的有機分子肽乳及其制備方法，本發明通過構建CpG ODN-pUC質粒，在大腸桿菌中大量擴增含CpG ODN基因的質粒，提取并純化質粒，然后將CpG ODN-pUC質粒皮下注射入有機農業系統的高產奶牛體內，激發了非特異性免疫應答、增強抗原特異性免疫應答，誘導其分泌各種細胞因子，通過對牛奶進行細胞因子的檢測，發現奶牛的乳汁中也含有各種細胞因子，并且經過免疫后牛奶中各細胞因子的含量是普通牛奶中的2-10倍，最后把其乳汁收集包裝生產成“有機分子肽乳”。飲用有機分子肽乳，就能夠提高機體免疫力，抗腫瘤，預防疾病增強體質的功效。
文檔編號C12N15/63GK101684465SQ20081021169
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月23日 優先權日2008年9月23日
發明者于忠波, 杜啟科, 王銀香, 谷登峰, 陸家海 申請人:山東銀香大地乳業有限公司;王銀香