專利名稱：無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬靈芝菌株鑒別領(lǐng)域，特別是涉及一種無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體分子標(biāo) 記及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載，靈芝有益心氣、養(yǎng)心生血、助心充脈、安神、 益脾益肺、強(qiáng)筋骨、利關(guān)節(jié)、治耳聾等功效。近代研究發(fā)現(xiàn)靈芝不但對人類三大死因的癌 癥、腦溢血和心臟病有療效，還對胃腸、肝臟、腎臟、白血病、神經(jīng)衰弱、慢性支氣管炎、 哮喘、過敏等疾病有顯著療效。此外靈芝還有強(qiáng)精、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、解毒、利尿、 凈血等多種作用和功效。近年來，國際藥學(xué)界發(fā)現(xiàn)靈芝所含有機(jī)鍺是人參的4一5倍，鍺被 認(rèn)為是"長壽元素"，能促進(jìn)血液循環(huán)，增強(qiáng)血紅蛋白攜氧能力，提高代謝功能、延緩衰 老。因此，靈芝被譽(yù)為"健康食品之冠"(虞和澍，1994)。
隨著對靈芝的生物學(xué)功效的不斷了解，以其為原料開發(fā)的產(chǎn)品越來越多，銷售量也越 來越大，靈芝原料的質(zhì)量越來越受到重視。近年來，隨著靈芝各種產(chǎn)品的商品化，大大帶 動了中國靈芝栽培生產(chǎn)的迅速發(fā)展，同時(shí)靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴(kuò)大，但是由于我國食 藥用菌品種登記制度尚未完善，因此靈芝的生產(chǎn)用菌種比較混亂，同種異名和異名同種的 現(xiàn)象在栽培生產(chǎn)上非常普遍，這不僅給菌種的管理帶來了難度，也給以靈芝為原料的保健 品及藥品等的相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)在因?yàn)榫N問題常常造成我國靈芝產(chǎn)品 質(zhì)量難以穩(wěn)定的局面，也嚴(yán)重地制約了我國靈芝產(chǎn)品走出國門，走向國際市場的步伐。
傳統(tǒng)的分類鑒定主要依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行，包括擔(dān)孢子的大小和子實(shí)體真 皮菌絲的形態(tài)特征，但是子實(shí)體的許多形態(tài)學(xué)特征往往隨著生長條件的不同而發(fā)生變化， 而且許多鑒別性特征經(jīng)常是幾個(gè)種所共有的，這給傳統(tǒng)的分類學(xué)帶來了很大的困難，僅僅 依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定不是很可靠。因此，尋找可靠的鑒定手段，對靈芝產(chǎn)業(yè)的進(jìn) 一步發(fā)展尤為重要。
近年來，國內(nèi)對栽培靈芝菌株的分類研究也越來越多，主要是集中在應(yīng)用拮抗實(shí)驗(yàn)、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)分析及同工酶分析 技術(shù)方面。
張松等(1995)通過對4株靈芝菌株的酯酶同工酶酶譜的分析發(fā)現(xiàn)，供試的四個(gè)菌株 存在5條相同的酶帶，說明它們具有靈芝的某些共同的遺傳特征，在其代謝過程中具有某 些相似的生理活動，但各菌株在酶帶數(shù)目、Rf值及含量百分比上存在差異，均具有自己的
5特征酶帶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征相似的，酯酶同工酶酶譜也相似，親緣關(guān)系比較近， 這些說酯酶同工酶分析對于靈芝的分類鑒定有一定的價(jià)值。
趙明文等(2003)利用RAPD技術(shù)對生產(chǎn)中常用的靈芝屬8個(gè)菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行了 分析。根據(jù)UPGMA構(gòu)建的樹狀圖將8個(gè)菌株在較低的相似水平上分成3個(gè)明顯不同的組 第1鄉(xiāng)且包括黑芝(Gflwoi/^vw" a&ww) 、 ^f^杉靈芝(G""otfermdr Gwgae)、 圓芝(G^"ocfe vwfl ra加"flfa加附)、靈芝0770 (Gawofifemw /wczViww 0770)禾口草韋國靈芝(Gawoc/ewza /wcWww HG); 第2組包括密紋靈芝(Gawocfe/7Wfl cre6mstn,加ww)禾口紫靈芝(Gawocfemja s!'"ewse); 第3 組為樹舌靈芝(G朋Wmw"鄰!p/""a加附)。這一結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果基本相符，表明RAPD 技術(shù)可以用來區(qū)分生產(chǎn)中一些常用的靈芝種，同時(shí)說明靈芝生產(chǎn)用種之間遺傳差異較大， 可能是造成靈芝產(chǎn)品研究比較混亂的重要原因。
1999年我國簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種 知識產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記 制度來真正保護(hù)我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定 基礎(chǔ)。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點(diǎn)，但 目前尚未有對無柄靈芝142的SCAR分子標(biāo)記，以快速鑒定無柄靈芝142。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子 標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，以便對無柄靈芝142菌株進(jìn)行簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定和檢
本發(fā)明的一種無柄靈芝M2菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記，是一種基因SCAR 分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為570bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為 5'GGCGATTGCGCTAATCATAT3'和5'CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3'。
本發(fā)明的一種無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法，包括下 列步驟
I.菌株或子實(shí)體基因組DNA的提取 (1)菌株基因組DNA的提取
將4-6'C保藏的無柄靈芝142菌株轉(zhuǎn)接至ljPDA斜面上，26-28°〇培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28。C振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組 DNA;
(2)子實(shí)體基因組DNA的提取
將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡處理20-30小時(shí)，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000^LpH8.0CNETS 溶液分裝于2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時(shí)，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實(shí)體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 mmol/LTris-Cl、 l%(m/V)SDS;
II. 無柄靈芝142菌株或子實(shí)體特異DNA片段的獲得
采用SRAP-PCR法，其中SRAP引物是me-3: 5'TGAGTCCAAACCGGAAT 3',em-13: 5'GACTGCGTACGAATTGGT 3'，得無柄靈芝142菌株或子實(shí)體特異DNA片段；
III. 特異性PCR引物的獲得
以得到的特異性DNA片段的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對的序列 5'GGCGATTGCGCTAATCATAT 3'禾口 5'CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3';
IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對無柄靈芝142菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增
V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測
上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5pL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝 膠成像儀上照相。 所述步驟I (1)中，LETS法
① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個(gè)1.5ml的離心管中；
② 向每個(gè)管中加入600-80(VL的苯酚:氯仿異:戊醇(縮寫為PCI)(比例為25:24:1)上下 顛倒，充分混勻，4-10°C 16000g離心8-15分鐘；
③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500pL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；
④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；
⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-2(TC預(yù)冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-20'C冰箱中靜置5-10分鐘；
⑥ 取出，4。C16000g離心10-15分鐘；
7⑦ 倒去上清，再向管中加入500nL預(yù)冷的70Q/。 (V/V)乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4匸16000g離心IO分鐘；
⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；
⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；
⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0e/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括
① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實(shí)體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個(gè)2.0 ml的離心管中；
② 向每個(gè)離心管中加入600-800nL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；
④ 取上清，加入600-800piL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600^L49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；
⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確
定其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。 所述步驟II中，SRAP-PCR法擴(kuò)增反應(yīng)體系(25^L): 10XPCRbuffer (Promega) 2.5pL， 25mmol/L MgC12 ( Promega ) 1.8pL ， 10mmol/L dNTPs 0.5pL ，引物(me-3 : 5'TGAGTCCAAACCGGAAT3'， em-13: 5'GACTGCGTACGAATTGGT 3') (20umol/L) 各0.38^L， Taq酶(5U/nL) (Promega) 0單，模板(10-20ng/yL) 2單，加無菌雙 蒸水補(bǔ)足25pL， PCR反應(yīng)條件94。C 5min，前5個(gè)循環(huán)，94°C lmin， 37°C lmin， 72°C lmin，后35個(gè)循環(huán)94°C lmin， 52°C lmin， 72°C lmin，最后72°C 10min，無柄靈芝 142菌株或子實(shí)體特異DNA片段，分子量為631bp，其序列如下所述步驟IV中，擴(kuò)增反應(yīng)體系(25pL): 10XPCRbuffer(Promega)2.5nL， 25mmol/LMgC12 (Promega ) 1.5&L ， 弓l物對 (5'GGCGATTGCGCTAATCATAT 3'和 5'CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3') (20ymol/L)各0.5pL， 10mmol/LdNTPs 0.5pL， Taq酶(5U/uL) (Promega) 0.2pL，模板(10-20ng/uL) 2攀，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL。 PCR反應(yīng)條件為94。C 3min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min， 30個(gè)循環(huán)；72。C 10
min。
本發(fā)明的無柄靈芝142菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測無柄 靈芝142菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?有益效果
(1) 只有無柄靈芝142能PCR擴(kuò)增出分子量為570bp的專一擴(kuò)增條帶，而靈芝屬的其 它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷；
(2) 采用這種特異性分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比， 具有檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，該檢測所需時(shí)間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所 需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要5-6個(gè)月的時(shí)間。
圖1是SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖2是無柄靈芝142特異引物對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳其中，生產(chǎn)用種(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62， 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 來自ATCC (24支)121-126， 128-145;
標(biāo)號中間有斷開的，這是因?yàn)樵诰N保藏過程中失去活力了，但并未因此改變其他菌株的 編號。
圖3是無柄靈芝142在SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中39即是無柄靈芝142在SRAP擴(kuò)增圖譜中的特異性條帶(M:D2000 marker, CK:對照，1-48: DNA池的編號，箭頭所指:SRAP特 異性標(biāo)記)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
實(shí)施例1
菌種收集到來自國內(nèi)的140支靈芝屬生產(chǎn)用菌種以及來自ATCC24支共計(jì)164支菌 株，它們分屬于赤芝、紫芝、樹舌、松杉靈芝、樹舌、密紋薄芝、紫光靈芝、近擬鹿角靈 芝、黃靈芝以及無柄靈芝等10余個(gè)種。對它們的基因組DNA和無柄靈芝142號的子實(shí)體 基因組(編號190) DNA共計(jì)165個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 一、基因組DNA的提取
1. 菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取
將4-6。C保藏的無柄靈芝142轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-2纊C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬 鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA; DNA 稀釋至10-20ng/iiL， -201:保存。
2. 子實(shí)體基因組DNA的提取
① 將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡處理20-30小時(shí)，過濾；
② 過濾后用滅過菌的雙蒸水沖洗，放在滅過菌的研缽中用液氮處理并進(jìn)行研磨；
③ 向每個(gè)離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
④ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次
⑤ 取上清，加入600-80(HiL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600(xL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37°。溫浴1-2個(gè)小時(shí)；
⑨ DNA稀釋至10-20 ng^L， .2(TC保存。
10二、 特異性PCR擴(kuò)增
10XPCR buffer ( Promega) 2單，25mmol/L MgC12 ( P腿ega) l單，引物 (5'GGCGATTGCGCTAATCATAT 3'和5'CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3') (20u mol/L)各0.5nL， 10mmol/L dNTPs 0.5nL， Taq酶(5U/ix L) (Promega)0.2pL，模板(10-20ng/ yL) 2攀，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL。
PCR反應(yīng)條件為94°C 3 min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min， 30個(gè)循環(huán)；72 °C 10min。
三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測
取特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5pL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2-1.5%的瓊脂糖 凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色 5-10min，自來水沖洗后在凝膠成像儀上照相。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些樣品中只有無柄靈芝142能擴(kuò)增出分子量為570bp的專一擴(kuò)增條帶， 而靈芝屬的其它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷。
權(quán)利要求
1.一種無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記，其特征在于該標(biāo)記是一種基因SCAR分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為570bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為5′GGCGATTGCGCTAATCATAT 3′和5′CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3′。
2. —種無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法，包括下列步驟(1) 菌株基因組DNA的提取將4-6'C的菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28。C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培 養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;(2) 子實(shí)體基因組DNA的提取將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡處理20-30小時(shí)，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000pL pH 8.0 CNETS溶 液分裝于2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時(shí)，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實(shí)體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是1% m/V CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 無柄靈芝142菌株或子實(shí)體特異DNA片段的獲得采用SRAP-PCR法，其中SRAP引物是me-3: 5'TGAGTCCAAACCGGAAT 3',em-13: 5'GACTGCGTACGAATTGGT 3'，得無柄靈芝142菌株或子實(shí)體特異DNA片段；III. 特異性PCR引物的獲得以得到的特異性DNA片段的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異PCR擴(kuò)增引物，引物對的序列 為5'GGCGATTGCGCTAATCATAT 3'禾口 5'CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3';IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對無柄靈芝142菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟I (l)中所述的LETS提取法① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個(gè)1.5ml的離心管中；② 向每個(gè)管中加入600-800pL的苯酚:氯仿異:戊醇PCI比例為25:24:1上下 顛倒，充分混勻，4-10。C 16000g離心8-15分鐘；③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500nL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-20。C預(yù)冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；⑥ 取出，4。Cl6000g離心10-15分鐘；⑦ 倒去上清，再向管中加入50(HiL預(yù)冷的70。/()V/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4T)16000g離心10分鐘；⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；(D倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；⑩將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝142菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其 特征在于所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實(shí)體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個(gè)2.0 ml的離心管中；② 向每個(gè)離心管中加入600-800nL飽和苯船混勻，12000-14000g離心10-15 min; (D取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；④ 取上清，加入600-800nL 1:1 V/V苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-600pL49:l V/V氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70。/。V/V的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30|aL的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟II中，SRAP-PCR法擴(kuò)增反應(yīng)體系25pL: 10 X PCR buffer Promega 2.5^L, 25mmol/L MgC12 Promega 1.8pL ， 10mmol/L dNTPs 0.5pL ，引物me-3: 5'TGAGTCCAAACCGGAAT3', em-13: 5'GACTGCGTACGAATTGGT 3' 20umol/L各 0.38pL， Taq酶5U/uL Promega 0.3pL，模板10-20ng/u L 2.(^L,加無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL， PCR反應(yīng)條件94°C 5min，前5個(gè)循環(huán)，94°C lmin， 37°C lmin， 72°C lmin，后35個(gè) 循環(huán)94°C lmin， 52°C lmin， 72°C lmin,最后72°C 10min，無柄靈芝142菌株或子實(shí)體特異DNA片段，分子量為631bp，其序列如下:
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟IV中，擴(kuò)增反應(yīng)體系25pL: 10 X PCR buffer Promega 2.5^L， 25mmol/L MgC12Promega 1.5pL ， 弓| 物 5'GGCGATTGCGCTAATCATAT 3'禾口 5'CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3' 20 U mol/L各0.5pL， 10mmol/L dNTPs 0攀， Taq酶5U/ U L Promega 0.2pL，模板10-20ng/ ix L 2.0pL，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL。 PCR反應(yīng)條件為94°C 3min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min, 30個(gè)循環(huán)；72°C 10 min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5pL 加樣緩沖液混勻，于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，在1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電 泳后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
8. 無柄靈芝142菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測無柄靈芝142 菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br>
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無柄靈芝142菌株或其子實(shí)體分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，該標(biāo)記是PCR擴(kuò)增后為570bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為5′GGCGATTGCGCTAATCATAT 3′和5′CCTACATCTACCAGCAGCACTTC 3′；獲得方法1)菌株或子實(shí)體基因組DNA的提??；2)獲得特異DNA片段；3)獲得特異PCR擴(kuò)增引物；4)用特異PCR擴(kuò)增引物對無柄靈芝142菌株或子實(shí)體基因組DNA擴(kuò)增；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測；應(yīng)用用于快速鑒定和檢測無柄靈芝142菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)?。本方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK101514360SQ20081020454
公開日2009年8月26日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者娜 馮, 方 劉, 劉艷芳, 帥 周, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 焱 楊, 許美燕, 薇 賈, 郝瑞霞 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院