一種結(jié)核分支桿菌活菌rna提取方法及其檢測(cè)試劑盒的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一種結(jié)核分支桿菌活菌rna提取方法及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測(cè)結(jié)核分支桿菌活菌的熒光定 量RT-PCR試劑盒，通過(guò)對(duì)從臨床痰液中提取的結(jié)核分支桿菌活菌RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再結(jié) 合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可以精確定量待測(cè)標(biāo)本中的結(jié)核分支桿菌活菌。
背景技術(shù)：
自1882年Koch發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌以來(lái)的IOO余年，人類(lèi)對(duì)結(jié) 核分枝桿菌的生物學(xué)特性、致病機(jī)制、耐藥機(jī)制、診斷方法、抗結(jié)核藥物的研制等方面都取 得了巨大的成就。而如今，結(jié)核病仍然是影響人類(lèi)健康流行性最廣，病死率最高的感染性疾 病之一。尋求快速、準(zhǔn)確的診斷方法一直是結(jié)核病學(xué)首要研究的領(lǐng)域。
近10年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)結(jié)核分支桿菌的DNA研究頗多，它們的高敏 感、高特異和快速性給結(jié)核病的診斷帶來(lái)新的期望。但DNA是穩(wěn)定的核酸分子，但DNA是穩(wěn) 定的核酸分子，半衰期長(zhǎng)，在接受標(biāo)準(zhǔn)有效化療的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰后180天 仍有25%的標(biāo)本DNA檢測(cè)陽(yáng)性?？赡艿慕忉層兴谰癉NA裂解的延滯和L型培養(yǎng)以及持留 菌、休眠菌的存在等。可見(jiàn)，以DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)，存在平臺(tái)效應(yīng)，不能用于結(jié)核分支桿菌的 活菌診斷。 rRNA是核糖體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，在原核生物中有多個(gè)拷貝存在，結(jié)核分支桿菌的 rRNA有近5000個(gè)拷貝。有學(xué)者在觀(guān)察分支桿菌體內(nèi)外死亡降解的過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，核糖體是第 一個(gè)伴隨細(xì)菌活力消失而降解的超微結(jié)構(gòu)，因而認(rèn)為rRNA可作為結(jié)核分支桿菌的活菌標(biāo) 志。Van der Vliet等通過(guò)體外擴(kuò)增16SrRNA進(jìn)行分支桿菌活菌檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該 方法能在3 7天內(nèi)獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可計(jì)算出各藥的藥效學(xué)參數(shù)。但Hellyer等的研 究結(jié)果顯示結(jié)核分支桿菌的rRNA水平在含藥培養(yǎng)基中72h內(nèi)無(wú)明顯變化。Moore等通過(guò)臨 床觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，rRNA也顯示平臺(tái)效應(yīng)。所以，rRNA在用于結(jié)核分支桿菌藥敏試驗(yàn)和化療監(jiān)測(cè) 時(shí)仍存在很大的局限性，也不能用于結(jié)核分支桿菌的活菌診斷。 原核生物的mRNA分子，半衰期很短(僅有3 5min)，僅存在于活的、有代謝活性 的菌體中，一般認(rèn)為mRNA是一活性增殖細(xì)胞的很好的分子標(biāo)記物。所以，以mRNA為靶點(diǎn)的 檢測(cè)只能是活菌，是監(jiān)測(cè)藥物敏感性和化療反應(yīng)的很好的分子指標(biāo)。結(jié)核分支桿菌的85-B mRNA編碼結(jié)核分支桿菌85-B蛋白，85-B蛋白是結(jié)核分支桿菌的主要分泌性蛋白抗原85-B 復(fù)合物的成分之一，85-B復(fù)合物是結(jié)核分支桿菌的特異性分泌蛋白，是在液體培養(yǎng)基和巨 噬細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)最豐富的蛋白之一，所以活菌細(xì)胞內(nèi)存在豐富的85-B mRNA分子。因此， 確定以85-B mRNA為靶點(diǎn)可檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的活菌。 熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為我們提供了一個(gè)定量檢測(cè)85-B mRNA的準(zhǔn)確方法。 1966年美國(guó)Applied Biosystems公司推出了實(shí)量熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)融匯了 PCR高 靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信 號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，完全閉管操作， 一舉克服了常規(guī) PCR技術(shù)的諸多難題。與常規(guī)PCR相比，有以下優(yōu)點(diǎn)1、可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，可用于
4適用基因診斷的各種疾病。以HBV-DNA為例，它不僅能檢測(cè)出乙肝病毒在病人體內(nèi)的復(fù)制、 傳染的情況，更重要的是能作為一個(gè)量化指標(biāo)，能定量檢測(cè)出病人體內(nèi)的病數(shù)，可以動(dòng)態(tài)地 觀(guān)察病情病程，觀(guān)察治療效果，作為臨床治療的一個(gè)指標(biāo)，可判斷藥物療效，指導(dǎo)臨床醫(yī)師 選擇有效藥物，確定藥劑、藥量和療程以及分析治療效果，確定進(jìn)一步治療方案等方面，有 著重要而現(xiàn)實(shí)的意義。2、特異性極強(qiáng)，克服了假陽(yáng)性的主要來(lái)源。3、定量范圍寬，樣品無(wú)需 梯度稀釋。4、操作迅速，無(wú)需PCR后處理，自動(dòng)化程度高。 所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào) 積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在熒光 定量PCR技術(shù)中，通常以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值 的缺省設(shè)置是6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，而將每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào) 到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)設(shè)為Ct值。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起 始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的參考 品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱橫標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得 未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增過(guò)程中加入一對(duì)引物的同時(shí)也加入一條特異的熒光探針， 目前常用的為T(mén)aqMan熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和 一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，故檢測(cè)不到熒 光；在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq酶的5' _3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和 淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。每個(gè)循環(huán)過(guò)程結(jié)束檢測(cè)一次熒光強(qiáng) 度，反應(yīng)結(jié)束后，便可得一條工作曲線(xiàn)。 由于熒光定量PCR具有重復(fù)性好，靈敏度高，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，所以醫(yī)學(xué) 檢測(cè)方面，一些常規(guī)檢測(cè)方法所不能解決的問(wèn)題得到了解決。例如，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查可直接 觀(guān)測(cè)到腫瘤細(xì)胞，但由于腫瘤脫落至血循環(huán)中的數(shù)目微小，這種檢查的敏感性和特異性均 較差，陽(yáng)性率低。免疫組織化學(xué)方法提高了血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞染色的特異性，特別是單克隆 抗體的應(yīng)用使染色的特異性和敏感性有了較大的改善，可查出104_105個(gè)有核細(xì)胞中的一 個(gè)腫瘤細(xì)胞。但該技術(shù)則需要特異性的抗體，生產(chǎn)相對(duì)復(fù)雜。同時(shí)，假陽(yáng)性限制了此項(xiàng)技術(shù) 的廣泛應(yīng)用。與這些技術(shù)相比，熒光定量PCR技術(shù)有著明顯的優(yōu)點(diǎn)，熒光定量PCR簡(jiǎn)便易 行，只要知道待測(cè)基因序列，即可設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增；該方法具有較高的靈敏 度及可重復(fù)性，也保證了醫(yī)學(xué)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明涉及一種結(jié)核分支桿菌活菌RNA提取方法及其檢測(cè)試劑盒，具體是，本發(fā) 明提供結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)活菌RNA提取方法，以及運(yùn)用該方法 結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)獲得的結(jié)核分支桿菌活菌檢測(cè)試劑盒；該試劑盒能夠準(zhǔn)確、靈敏、快 速鑒別結(jié)核分支桿菌的死活菌，而且能夠降低成本及縮短檢測(cè)時(shí)間，更為重要的是還是結(jié) 核病的診斷、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、化療反應(yīng)監(jiān)測(cè)、新抗結(jié)核藥物篩選及結(jié)核病預(yù)防等研究的基 礎(chǔ)。 技術(shù)方案
本發(fā)明提供一種結(jié)核分支桿菌活菌檢測(cè)方法，其特征在于，它具有快速、高質(zhì)量提 取RNA的方法和檢測(cè)試劑盒。 本發(fā)明提供RNA提取方法，其操作步驟包括 ①在痰液標(biāo)本中加入2倍體積的4% NaOH溶液(自備)，吹打均勻后室溫放置30 分鐘使之液化。取約lml液化痰液，15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留50 左右沉 淀，在沉淀中加入1XTE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留 50iU左右沉淀，在沉淀中加入1XTE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心lOmin，吸 棄上清，保留5iU左右沉淀。 ②在沉淀中加入0. 5ml Trizol試劑，旋渦振蕩10sec，室溫放置5min。③加入0. lml氯仿，振蕩混勻充分乳化、不分層，4t: 15， OOOrmp離心10min。吸取
上清到另一無(wú)RNA酶的1. 5ml離子管。 ④加入等體積的異丙醇，振蕩混勻后室溫放置10min，4°C 15， OOOrmp離心lOmin后 小心棄去上清。 ⑤加入75 %冰乙醇500 ill ，振蕩懸起沉淀后于4°C 、 15， OOOrmp離心10min，小心棄 去上清。干燥5 lOmin后使乙醇揮發(fā)。 ⑥沉淀中加入10ii1 DNase I處理緩沖液(1 P 1 lOXDNase I Buffer、2U 的DNase I (RNase-free)禾P DEPC水)，室溫(37 °C )孵育15min后；加入1 yl的20mM EDTA(RNase-free) ，7(TC放置5min，4。C 13， OOOrmp離心lmin即可進(jìn)行RT-PCR，或-70。C保 存l周左右。 本發(fā)明提供檢測(cè)試劑盒的特異性引物探針，包括如下序列 上游引物SEQ ID N01 :5' -CGC GCC CAA GAC GAC TAC A -3' 下游引物SEQ ID N02 :5' -AGG CCG GGC TGTACC AGT-3'檢測(cè)探針SEQ ID N03 :5' -MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCT TCT_MAR-3， 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長(zhǎng)的序列； 或者與上述序列同源性大于85 %的序列； 或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。 上述的一組結(jié)核分支桿菌(MTB)活菌熒光定量RT-PCR引物和探針的優(yōu)選技術(shù)方案。 本發(fā)明提供檢測(cè)試劑盒組成包括細(xì)胞裂解液、水、含有權(quán)利要求3所述引物序列 SEQ ID N01-2的RT-PCR反應(yīng)液、含有權(quán)利要求3所述探針序列SEQID N03的檢測(cè)探針、逆 轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、參考品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。 所說(shuō)的RT-PCR反應(yīng)液組成為RT-PCR緩沖液、MgCl2、特異弓|物對(duì)、dNTPs、無(wú)RNA酶 的水。 上述檢測(cè)試劑盒的參考品為如下DNA序列SEQ ID N04 : 5' -CGCGCCCAAG ACGACTACAA CGGCTGGGAT ATCAACACCCCGGCGTTCGA GTGGTACTAC CAGTCGGGAC TGTCGATAGTCATGCCGGTC GGCGGGCAGT CCAGCTTCTA CAGCGACTGGTACAGCCCGG CCT_3，。 作為特例，參考品是含有插入結(jié)核分支桿菌(MTB)特異性保守序列的T載體，該載體可在大腸桿菌DH5a中增殖。 上述檢測(cè)試劑盒所說(shuō)的水為無(wú)RNA酶的水。 —般，無(wú)RNA酶的水獲得方法為向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃 度為0.01% (V/V)，室溫(22-25°C)放置10-12小時(shí)后，121°C， 20分鐘高壓，室溫放置備 用； 上述檢測(cè)試劑盒所說(shuō)的陰性對(duì)照為無(wú)結(jié)核分支桿菌(MTB)活菌的正常人痰液樣 本。 上述檢測(cè)試劑盒所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照為含有結(jié)核分支桿菌(MTB)活菌的患者痰液樣 本。 上述檢測(cè)試劑盒所說(shuō)的細(xì)胞裂解液由細(xì)胞裂解液I和細(xì)胞裂解液II組成。
作為特例，細(xì)胞裂解液I組成為320mM蔗糖、5mM MgC12、l% TritonX-100， 10mM Tris-HCl[pH7. 5]、水； 作為特例，細(xì)胞裂解液II組成為4M硫氰酸胍、0. 75M檸檬酸鈉(pH7. 0)和10% 月桂?；“彼徕c(Sarcosyl lg/10mL) 、14. 3M P -巰基乙醇JM醋酸鈉(pH4. 0)和水飽和 酚； 上述各方案中所說(shuō)的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶在試劑盒中的形式可以為混合兩種 酶的混合液。 一般而言，DNA聚合酶選用耐熱T叫DNA聚合酶。 上述檢測(cè)試劑盒各組分的量為細(xì)胞裂解液I 1瓶24mL、細(xì)胞裂解液II 1瓶6mL、 無(wú)RNA酶的水1瓶2mL、RT-PCR反應(yīng)液1管210 y 1、檢測(cè)探針1管30 y L、參考品1管10 y L、 和陰性對(duì)照品l管10iiL。 本試劑盒中的細(xì)胞裂解液(即RNA總提取試劑)應(yīng)于fC保存，RT-PCR試劑保存 于-2(TC，盡量減少反復(fù)凍融。 本發(fā)明還提供所說(shuō)的試劑盒的使用方法如下
首先，每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
樣品要求
1 2ml結(jié)核病患者痰液樣本。 采集結(jié)核病患者痰液1 2ml，倒入15ml刻度離心管(血痰加等量細(xì)胞裂解液I 混勻靜置3 5min)，加入等量lg/dl胰酶Hanks液，置37。C水浴消化，直至痰液被完全消 化為止，混勻，分別吸500 ii 1到1. 5ml離心管中，再加入4g/dlNaOH處理3 5min離心留 沉淀。樣本處理后應(yīng)立即使用，若不能立即使用，可以4t:保存1-2小時(shí)，但時(shí)間不宜再過(guò) 長(zhǎng)，否則將影響檢測(cè)結(jié)果。
操作步驟
—、總RNA提取 1.在處理好的痰液標(biāo)本(沉淀)中加入500 ii L細(xì)胞裂解液II，用移液器反復(fù)吹 打混勻，室溫放置5分鐘。 2.加200iiL三氯甲烷，用手來(lái)回振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘，4°C 15， OOOrpm 離心10分鐘，將上清移入新的離心管。 3.加入等體積異丙醇，旋渦振蕩5秒，室溫沉淀10分鐘，4°C 15， OOOrpm離心5分
鐘，棄上清。
7
4.加入500ii L預(yù)冷的75X乙醇洗滌，上下顛倒10次，4。C 10， OOOrpm離心5分鐘， 吸干上清，沉淀室溫干燥10-20分鐘，加入20 ii L無(wú)RNA酶水稀釋混勻，立即使用或-7(TC保 存。 二、RT-PCR 將裝有RT-PCR反應(yīng)液、MTB檢測(cè)探針、混合酶、參考品、對(duì)照品的離心管從_20°C中 取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，低速離心，用移液器將上述試劑RT-PCR反應(yīng)液，混勻， 低速離心，置于冰盒上備有。 按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)體系(30 ii L體系)
RT-PCR反應(yīng)體系
RT-PCR反應(yīng)液 21iiL MTB檢測(cè)探針 3 PL
混合酶 2 u L
RNA模板 4 ii L RT-PCR反應(yīng)條件37。C 30分鐘；95。C 5分鐘;(95°C 10秒，60°C 45秒，40個(gè)循環(huán))。
三、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 將參考品貯存液(6X107copies/ii L)梯度稀釋為6X 106， 6X 105， 6X 104， 6X 103， 6X 102，6X 10、取4ii L為模板，同待測(cè)樣品一同進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)定量曲線(xiàn)。
結(jié)果判斷
1.使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件進(jìn)行文件保存及閾值的設(shè)定。
2.選中不同濃度參考品，應(yīng)用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)信息。
3.選中所有樣品檢測(cè)測(cè)孔，應(yīng)用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析，得出待測(cè)樣品的起始模板數(shù) (M)。 有益效果 本發(fā)明建立了利用TaqMan技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分支桿菌活菌的方法，并且經(jīng)過(guò)對(duì)結(jié)核 病患者痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，表明該法切實(shí)可行。由于本方法采用了熒光定量PCR，使得結(jié)核 分支桿菌活菌的檢測(cè)敏感性和特異性大大的提高，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽(yáng)性率，從而 使得本發(fā)明可以在極少量的標(biāo)本中獲得足夠的信息。 在本檢測(cè)項(xiàng)目中，本發(fā)明采用了目前最為先進(jìn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，在 保持高敏感性的前提下，盡量減少假陽(yáng)性的干擾。在實(shí)量熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)出現(xiàn)之前， 人們對(duì)PCR模板的定量都要通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理，根據(jù)電泳 條帶的高度來(lái)確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)?biāo)記的PCR產(chǎn)物以ELISA的方式進(jìn)行檢 測(cè)，再由此推測(cè)出起始模板的量，但這些方法實(shí)際上都有屬于半定量水平，因?yàn)榧词筆CR條 件已最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會(huì)給結(jié)果的分析帶來(lái)影響，從而影響定 量這一 目的。隨著本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，可以真正地做到對(duì)PCR模板的精 確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高敏靈性，而且由于特異性熒光探針雜交技術(shù)的
8應(yīng)用，使得被子檢測(cè)基因的特異性大大提高。 本發(fā)明的引物、探針和試劑盒采用熒光定量RT-PCR方法，該方法靈敏、特異、重復(fù)性好，結(jié)果用拷貝數(shù)表示，準(zhǔn)確可靠，利于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。方法靈敏，重組質(zhì)粒定量模板，按io倍梯度稀釋?zhuān)蓹z出IO個(gè)拷貝，并由此制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性范圍寬(0 107拷貝)，方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)為0.997。熒光定量RT-PCR方法是結(jié)核分支桿活菌的診斷、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、化療反應(yīng)監(jiān)測(cè)、新抗結(jié)核藥物篩選及結(jié)核病預(yù)防等研究基礎(chǔ)。結(jié)核分支桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)，特別是化療療效的評(píng)價(jià)對(duì)活菌的存在有嚴(yán)格的依賴(lài)性。因此，結(jié)核分支桿菌活菌的檢測(cè)具有臨床意義及廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為樣本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)圖。
圖2為樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊(cè)，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。所有無(wú)機(jī)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠(chǎng)，Trizol試劑購(gòu)自上海生工公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自上海申能博彩生物公司，匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶、T叫DNA聚合酶、01igo(dT)15—18均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，引物和探針均由上海生工公司合成。E卯endorf梯度式PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)E卯endorf公司，PE7500熒光PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。
實(shí)施例1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)結(jié)核分支桿菌活及其應(yīng)用
—、引物及探針設(shè)計(jì)與合成 以結(jié)核分支桿菌全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank登錄號(hào)NC_000962)為模板，使用Oligo軟件分析TaqMan引物和探針的位點(diǎn)，并根據(jù)同時(shí)考慮結(jié)核分支桿菌基因組DNA序列的情況，從中選擇最佳組合。 參考品PCR上游引物序列為5' -CTG CGG TTT ATC TGC TCG AC-3';下游引物序列為5' —GAC AGC GAG CCG GCG TAG A—3'; 檢測(cè)用PCR上游引物序列為5' -CGC GCC CAA GAC GAC TAC A-3';下游引物序列為5' -AGG CCG GGC TGT ACC AGT-3'; 熒光探針序列為5' -MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCT TCT_MAR-3，；
二、檢測(cè)參考品制備 采集結(jié)核病患者痰液1 2ml，倒入15ml刻度離心管(血痰加等量細(xì)胞裂解液I混勻靜置3 5min)，加入等量lg/dl胰酶Hanks液，置37。C水浴消化，直至痰液被完全消化為止，混勻，分別吸500 ii 1到1. 5ml離心管中，再加入4g/dlNaOH處理3 5min離心留
9沉淀。采用TRIzol試劑提取總RNA，取1 ii gRNA，在25 y L總反應(yīng)體系中用Oligo (dT)15—18為引物對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用參考品上、下游引物在Eppendorf梯度式PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95。C變性5分鐘，再按95°C 20秒、56。C 20秒、72。C 45秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，最后于72t:延伸7分鐘后置于4°C。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送上海超世生物公司進(jìn)行克隆(質(zhì)粒由應(yīng)公司提供)，并將陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證(由上海英駿公司測(cè)序)。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，即為參考品，測(cè)定其濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。
三、標(biāo)本檢測(cè) 取5例經(jīng)確定的結(jié)核病患者和2例正常人痰液標(biāo)本1. 5ml，加入等量lg/dl胰酶Hanks液，置37t:水浴消化，直至痰液被完全消化為止，混勻，分別吸500 y 1到1. 5ml離心管中，再加入4g/dlNaOH處理3 5min離心留沉淀，用TRIzol試劑提取總RNA，取4 y L RNA提取液，在30 ii L總反應(yīng)體系中，用檢測(cè)用上、下游引物在PE7500熒光PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件均為37。C保溫30分鐘，95。C變性5分鐘，再按95°C 10秒、6(TC 45秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，同時(shí)加入?yún)⒖计窓z測(cè)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出
檢測(cè)標(biāo)本的拷貝數(shù)。 五、結(jié)果( — )參考品的制備 經(jīng)測(cè)序，上述設(shè)計(jì)的參考品完全與預(yù)期相符，回收的參考品片段序列如下
5' -CTGCGGTTTA TCTGCTCGAC GGCCTGCGCG CCCAAGACGACTACAACGGCTGGGATATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGGTACTACCAGT CGGGACTGTC GATAGTCATGCCGGTCGGCGGGCAGTCCAG CTTCTACAGC GACTGGTACA GCCCGGCCTGCGGTAAGGCT GGCTGCCAGACTTACAAGTG GGAAACCTTCCTGACCAGCG AGCTGCCGCA ATGGTTGTCC GCCAACAGGGCCGTGMGCCCACCGGCAGC GCTGCAATCG GCTTGTCGATGGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCA TCTACGCCGG CTCGCTGTCG-3'
(二)樣品檢測(cè) 參考品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖l，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。 5例患者(其中一例已治愈)和5例正常人痰液標(biāo)本熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如下編號(hào)性別年齡標(biāo)本拷貝數(shù)(copies/mL)1男64痰液2. 11X1022女40痰液5. 18X1053女33痰液1. 90X1034男56痰液5. 44X1025女49痰液6男52痰液7男46痰液8女29痰液9女58痰液10男66痰液 同樣的10例樣本，采用以DNA為檢測(cè)模板的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。么、司的結(jié)核分支桿菌(TB)核酸擴(kuò)增
性別 年齡 標(biāo)本
女
女男女
女女
3356495246295866
6440
痰液痰液痰液痰液痰液痰液痰液痰液
痰液痰液
拷貝數(shù)(copies/mL)4. 38X1047. 417X106
3. 88X1043. 75X1046. 620 X103 實(shí)驗(yàn)方案如下 試劑盒采用上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒(檢測(cè)方法詳見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū))。 5例患者(其中一例已治愈)和5例正常人外周血標(biāo)本原位RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如下編號(hào)[O川]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 可見(jiàn)，結(jié)核分支桿菌熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果拷貝數(shù)高于以mRNA為模板的結(jié)核分支桿菌活菌熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，但其中一例已治愈患者仍然被檢測(cè)出為陽(yáng)性，說(shuō)明可能有死菌及DNA裂解的延滯和L型培養(yǎng)以及持留菌、休眠菌的存在等，因此不能為結(jié)核分支桿活菌的診斷、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、化療反應(yīng)監(jiān)測(cè)、新抗結(jié)核藥物篩選及結(jié)核病預(yù)防等提供基礎(chǔ)性研究。0123] 核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING
〈110〉上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司
上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司〈120〉 一種結(jié)核分支桿菌活菌RNA提取方法及其檢測(cè)試劑盒〈130>081010〈140>CN
〈141>2008-10-10〈160>4
〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>19〈212>DNA
〈213>Mycobacterium tuberculosis〈220〉
〈221>SEQ ID N01〈222〉 (1) (19)〈400>1
cgcgcccaag acgactaca 19
0124]0125]0126]0127]0128]0129]0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]0137]0138]0139]0140]0141]:0142] 〈210>2
:0143] <211>18
:0144] 〈212>DNA
:0145] 〈213〉Mycobacterium tuberculosis
:0146] 〈220〉
:0147] <221>SEQ ID N02
:0148] 〈222〉 (1) (18)
:0149] 〈400>2
:0150] aggccgggct gtaccagt 18
:0151] <210>3
:0152] 〈211>23
:0153] 〈212>DNA
:0154] 〈213>Mycobacterium tuberculosis
:0155] <220>
:0156] 〈221>SEQ ID N03
:0157] 〈222>(1). . (21)
:0158] 〈223> "n =廳"，"y =應(yīng)"
:0159] <220>
:0160] 〈221>misc_feature
:0161] 〈222>(1). . (1)
:0162] 〈400>3
:0163] ntcggcgggc agtccagctt cty 23
:0164] 〈210>4
:0165] 〈211>133 〈212>DNA <213>Mycobacterium tuberculosis 〈220〉 〈221>SEQ ID N04 〈222>(1). (133) 〈400>4 cgcgcccaag acgactacaa cggctgggat atcaacaccc cggcgttcga gtggtactac 60 cagtcgggac tgtcgatagt catgccggtc ggcgggcagt ccagcttcta cagcgactgg 120 tacagcccgg cct 13權(quán)利要求
一種結(jié)核分支桿菌活菌檢測(cè)方法，其特征在于，它具有快速、高質(zhì)量提取RNA的方法和檢測(cè)試劑盒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA提取方法，其操作步驟包括① 在痰液標(biāo)本中加入2倍體積的4% NaOH溶液(自備)，吹打均勻后室溫放置30分鐘 使之液化。取約lml液化痰液，15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留50 y 1左右沉淀，在沉 淀中加入1 X TE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心10min，吸棄上清，保留50 左 右沉淀，在沉淀中加入1XTE溶液lml，旋渦振蕩lOsec， 15， OOOrpm離心lOmin，吸棄上清， 保留5iU左右沉淀。② 在沉淀中加入0. 5ml Trizol試劑，旋渦振蕩10sec，室溫放置5min。③ 加入0. lml氯仿，振蕩混勻充分乳化、不分層，4t: 15， OOOrmp離心10min。吸取上清 到另一無(wú)RNA酶的1. 5ml離子管。④ 加入等體積的異丙醇，振蕩混勻后室溫放置10min，4。C 15， OOOrmp離心10min后小心 棄去上清。⑤ 加入75 %冰乙醇500 ill ，振蕩懸起沉淀后于4°C 、 15， OOOrmp離心10min，小心棄去上 清。干燥5 lOmin后使乙醇揮發(fā)。 沉淀中加入10 ii 1 DNase I處理緩沖液(1 ii 1 lOXDNase I Buffer、2U的 DNase I (RNase-free)和DEPC水)，室溫(37 °C )孵育15min后；力Q入1 ii 1的20mM EDTA(RNase-free) ，7(TC放置5min，4。C 13， OOOrmp離心lmin即可進(jìn)行RT-PCR，或-70。C保 存1周左右。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它具有特異性引物和探針，包括如 下序列上游引物SEQ ID NOl :5' -CGC GCC CAA GAC GAC TAC A -3， 下游引物SEQ ID N02 :5' -AGG CCG GGC TGT ACC AGT-3' 檢測(cè)探針SEQ ID N03 :5'-廳-TCG GCG GGC AGT CCA GCTTCT-廳-3， 或者包含有上述序列的向5'端或/和3'端延長(zhǎng)的序列； 或者與上述序列同源性大于85%的序列； 或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其組成包括細(xì)胞裂解液、水、含有 權(quán)利要求3所述引物序列SEQ ID N01-2的RT-PCR反應(yīng)液、含有權(quán)利要求3所述探針序列 SEQ ID N03的檢測(cè)探針、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、參考品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒的組成，其特征在于，所說(shuō)的參考品為如下DNA序 列SEQ ID N04 :5' -CGCGCCCAAG ACGACTACAA CGGCTGGGAT ATCAACACCCCGGCGTTCGA GTGGTACTAC CAGTCGGGAC TGTCGATAGTCATGCCGGTC GGCGGGCAGT CCAGCTTCTA CAGCGACTGGTACAGCCCGG CCT-3，。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的水為無(wú)RNA酶的水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的陰性對(duì)照為無(wú)結(jié)核分支桿 菌活菌的正常人痰液樣本。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照為含有結(jié)核分支 桿菌活菌的患者痰液樣本。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的細(xì)胞裂解液由細(xì)胞裂解液I 和細(xì)胞裂解液II組成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，每盒中各組分的量為細(xì)胞裂解 液I l瓶24mL、細(xì)胞裂解液I1 1瓶6mL、無(wú)RNA酶的水l瓶2mL、RT-PCR反應(yīng)液l管210iiL、 檢測(cè)探針1管30 ii L、參考品1管10 ii L、和陰性對(duì)照品1管10 ii L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)核分支桿菌活菌RNA提取方法及其檢測(cè)試劑盒，具體是，本發(fā)明提供結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)活菌RNA提取方法，以及運(yùn)用該方法結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)獲得的結(jié)核分支桿菌活菌檢測(cè)試劑盒；該試劑盒能夠準(zhǔn)確、靈敏、快速鑒別結(jié)核分支桿菌的死活菌，而且能夠降低成本及縮短檢測(cè)時(shí)間，更為重要的是還是結(jié)核病的診斷、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、化療反應(yīng)監(jiān)測(cè)、新抗結(jié)核藥物篩選及結(jié)核病預(yù)防等研究的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101760518SQ20081020163
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者吳大治, 夏懿, 沈維祥 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司