專利名稱：一種海藻糖載入紅細胞內的方法
技術領域：
本發明涉及一種海藻糖載入紅細胞內的方法，特別是用電脈沖滲 透將海藻糖載入紅細胞內的方法。
背景技術：
海藻糖是一種優良的凍干保護劑，當適當提高細胞內海藻糖濃度 時，可以提高細胞凍干后的存活率，因此人們希望提高細胞內海藻糖 的濃度。但由于細胞膜是一種非滲透性膜，對于海藻糖這種非滲透性 的物質很難進入細胞內部，即使能夠用一般的方法載入，效果也不是 太理想。目前常用的方法主要有
1 、利用內吞作用(endocytosis)分別將海藻糖弓I入人間葉干細胞 (MSCs， mesenchymal stem cells)禾口血小板中。此方法載入量較少。
2、 利用轉基因的葡萄狀球菌a-溶血素，它是一種可打孔的蛋 白質，通過它產生橫跨膜孔(transmembrane pores)來使細胞膜有可 逆的滲透性。此方法操作復雜且得到的樣品量較少。
3、 Gyana提出一種有效的、方便的將海藻糖引入紅細胞的方法， 我們稱此法為"Gyana孵育法"。該方法利用紅細胞膜的熱力學特性 (thermal properties),在37。C條件下孵育7h可以將足量的海藻糖 載入紅細胞內。在胞外海藻糖濃度為800mM時，胞內海藻糖濃度可以 達到34mM，溶血率為15%。此方法的載入效果比以前的方法都好，但 是耗時長，溶血率較大，并且載入效果有待進一步提高。
發明內容
為了解決上述方法中存在的操作煩瑣、耗時長、實驗樣品量少、
載入效果不太明顯等問題，本發明提出了一種通過電滲透的方法將海 藻糖載入紅細胞內，通過選擇合適的細胞外海藻糖濃度和控制電滲透 的參數，可以達到理想的載入效果。 本發明采用的技術方案
電脈沖滲透將海藻糖載入紅細胞內的方法
(1) 電滲透前細胞的處理
先將新鮮血液以2500r/min離心5min，棄去血漿及白膜，將紅 細胞用等滲pH=7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以2500r/min離心5min，反復 洗滌3次，棄去上清液，得洗滌紅細胞。將得到的洗滌紅細胞與800mM 的海藻糖溶液以1:1. 5的比例混合均勻，得到紅細胞溶液。
(2) 紅細胞溶液的電脈沖滲透 將得到的加入了海藻糖的紅細胞溶液取400微升放入間距為2mm
的電擊杯中，將此電擊杯放入電擊池中，并將電脈沖滲透的參數設置 如下電壓300v、脈寬lms、頻率為1次/分鐘，共四次。在此參數 下進行紅細胞的電脈沖實驗。
(3) 細胞內海藻糖濃度的提取 將經過電滲透的紅細胞溶液用pH=7.4的等滲磷酸鹽緩沖液以
2500r/min離心5min，反復洗滌3次，棄去上清液，得到電脈沖滲透 紅細胞溶液。取電脈沖滲透過的紅細胞溶液lml加入10%的三氯乙酸 3ml混合均勻，在8(TC恒溫水浴箱中用生膠帶密封加熱lh后再以 3500r/min離心5min，收集上清液，如此提取3次，得到細胞內的海 藻糖的提取液。 本發明的技術效果
本發明的一種電滲透的載糖方法在紅細胞中的使用，通過三氯 乙酸提取后，經過硫酸蒽酮法測定，細胞內的海藻糖濃度最高可高達
63. 68mM，與目前現有技術中報道的紅細胞在細胞外海藻糖濃度為 800mM的"Gyana孵育法"的載糖濃度為34mM相比(測定方法同樣是 硫酸蒽酮法)，得到了很大的提高，且此方法還具有操作方便，省時 省力的特點。
圖1，海藻糖濃度與吸光度對應關系圖；
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進一步詳細描述，但不限制本發明。 實施例
電脈沖儀美國BTX公司BCM-830脈沖儀(電穿孔儀) 胞內海藻糖濃度的計算
(1) 海藻糖濃度與吸光度的關系圖標準曲線的制作 取已知各濃度海藻糖的溶液lml加入2g/L硫酸蒽酮溶液4ml，
在冰水浴中搖勻冷卻，沸水精確煮沸10min，再用流水冷卻10min。 在625nm處以空白管調零，用lcm光徑的比色皿測定各管吸光度值， 繪制海藻糖濃度與吸光度的關系，見附圖l。
(2) 細胞內的海藻糖濃度計算 用標準曲線方法測定出提取液中的海藻糖濃度，按照如下公式計
算出細胞內的海藻糖濃度
其中 <formula>formula see original document page 5</formula>
Ci——細胞內海藻糖濃度，mmol/L, C一萃取液中海藻糖的濃度，m——海藻糖的分子量，取378. 33g/mol， n——紅細胞的計數，xl0(12)/L, V——紅細胞的平均體積，fL，
Vb——紅細胞不可滲透體積，fL，根據文獻報道取值為55. 21%V
利用電脈沖滲透將海藻糖載入紅細胞內的方法
(1) 電滲透前細胞的處理
先將健康人新鮮血液以2500r/min離心5min,棄去血漿及白膜， 將紅細胞用等滲pH=7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以2500r/min離心5min， 反復洗滌3次，棄去上清液，得洗滌紅細胞。將得到的洗滌紅細胞與 800mM的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均勻，得到紅細胞溶液。
(2) 紅細胞溶液的電滲透 將得到的加入了海藻糖的紅細胞溶液取400微升，放入間距為
2mm的電擊杯中，將此電擊杯放入電擊池中，并將電脈沖滲透的參數 設置如下電壓300v、脈寬lms、頻率為1次/1分鐘，共4次。在 此參數下進行紅細胞的電脈沖實驗。
(3) 細胞內海藻糖濃度的提取 將經過電滲透的紅細胞溶液用PH=7. 4的等滲磷酸鹽緩沖液溶液
以2500r/min離心5min，反復洗滌3次，棄去上清液，得到電滲透 紅細胞溶液。取電滲透過的紅細胞溶液lml加入10%的三氯乙酸3ml 混合均勻，在8(TC恒溫水浴箱中用生膠帶密封加熱lh后再以 3500r/min離心5min，收集上清液，如此提取3次，得到細胞內的海 藻糖的提取液，細胞內海藻糖濃度的最大值為63. 68mM。
本發明的電脈沖滲透將海藻糖載入紅細胞內的方法與目前現有 技術中報道的紅細胞在細胞外海藻糖濃度為800mM的"Gyana孵育 法"的載糖濃度為34raM相比，載入效果得到了很大的提高，且此方 法還具有操作方便，省時省力的特點。
權利要求
1、一種利用電脈沖滲透將海藻糖載入紅細胞內的方法，其特征在于含有如下操作步驟(1)電脈沖滲透前細胞的處理將新鮮血液以2500r/min離心5min，棄去血漿及白膜，將紅細胞用pH＝7.4的等滲磷酸鹽緩沖溶液在離心機中以2500r/min離心5min，反復洗滌3次，棄去上清液，得紅細胞，將此紅細胞與配置好的海藻糖濃度為800mM、KCl為5mM的溶液以1:1.5的體積比混合均勻，得到紅細胞溶液；(2)電脈沖滲透控制參數的選擇取上述步驟(1)中所得的紅細胞溶液400微升，放入間距為2mm的電擊杯中，將此電擊杯放入電擊池中，并設定電脈沖滲透時的控制參數為電壓300v、脈寬1ms、頻率1次/1分鐘，共四次；(3)電脈沖滲透后紅細胞的處理將上述步驟(2)中經過電脈沖滲透過的紅細胞溶液，用pH＝7.4的等滲磷酸鹽緩沖液以2500r/min離心5min，反復洗滌3次，棄去上清液，得到載入海藻糖的紅細胞懸濁液。
全文摘要
本發明涉及一種電脈沖滲透將海藻糖載入紅細胞內的方法。包括電脈沖滲透前細胞的處理，即將新鮮血液離心，棄去血漿及白膜，用pH＝7.4的等滲磷酸鹽緩沖溶液在離心機中離心，洗滌，棄上清液，再與配置好的海藻糖以一定的體積比混合均勻，得到紅細胞溶液，取一定量，放入電脈沖儀的電擊杯中，進行電脈沖滲透，控制電壓300v、脈寬1ms、頻率1次/1分鐘，共四次，經過電脈沖滲透過的紅細胞溶液，用pH＝7.4磷酸鹽緩沖液洗滌三次得到電脈沖載糖溶液，并測得細胞內的海藻糖濃度達到63.68mM。與目前較好方法為高滲法(細胞外的海藻糖濃度為800mM時，載入的效果為34mM)相比，本發明方法的海藻糖載入濃度明顯的提高了，從而有利于紅細胞的凍干保存。
文檔編號C12N5/078GK101381705SQ20081020142
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月21日 優先權日2008年10月21日
發明者劉寶林, 劉建峰, 周國燕, 周新麗, 晨 宋, 驥 袁, 煥 黃 申請人:上海理工大學