一種真姬菇工廠化栽培菌株的ssr分子標記鑒別方法

專利名稱：：一種真姬菇工廠化栽培菌株的ssr分子標記鑒別方法
技術領域：
：本發明涉及菌株的分子生物學鑒別方法，具體涉及真姬燕工廠化栽培菌株的SSR分子標記鑒別方法。
背景技術：
：真姬菇[7/^w:2:;^ww"rwc^ew(Peck)Bigelow]，又名蟹味燕、海鮮燕、鴻喜菇、玉蕈、膠玉蘑，隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、離褶菌族、玉蕈屬，是一種質地脆嫩，味道鮮美，營養豐富，具有多種保健功效的珍稀食用菌，深受廣大消費者的喜愛。我國的科研院所和食用菌工廠已研發出適宜工廠化栽培的新菌株，具有高產、優質、抗逆性強的特點。隨著真姬菇在國內、外市場消費的進一步擴大，大量的真姬菇出口到海外，由于食用菌具有無性繁殖的特點，任何企業或個人，只要在市場上購買了真姬菇產品，就可以通過簡單的組織分離獲得菌種。因此，加強對該生產萆種知識產權的保護，防范國外其他企業的不正當競爭，是提高企業核心競爭力的關鍵。同時作為中國的一種重要的菌種資源，通過知識產權進行保護，在國際競爭中也顯得尤為重要。傳統的食用菌菌種的鑒別主要依據子實體形態特征的描述，如子實體的形狀、大小和顏色，表面是否光滑、粗糙或有毛，菌肉的質地和氣味，菌蓋與菌褶或菌管分離的難易程度以及孢子印的色澤等，在屬及以上分類單元中可以區分明顯，但在種及以下分類單元的鑒別中，表現不穩定或常引起分歧，準確性大打折扣。主要因為真菌的某些形態特征和生理生化指標易受外界環境和栽培條件的影響，如空氣濕度、溫度、C02濃度、培養基種類等因素都有可能影響其子實體的形態特征和生理生化指標，許多檢驗結果難以量化，并且難以區分變異來源，影響品種遺傳特性的判斷。因此，急需一種準確可靠，操作簡便，成本低廉的鑒別方法。分子標記法是比較好的選擇。分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎，是DNA水平遺傳物質的直接反應，其優點(1)不受外界環境條件和生長發育階段的影響；(2)標記數量多，可覆蓋整個基因組；(3)存在著許多等位變異，多態性豐富；(4)許多分子標記表現為共顯性，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，可提供完整的遺傳信息。但是現有分子標記都有一定的缺陷。RFLP，這種方法要經過Southern雜交，操作復雜，工作量大，最重要的是它一般選用單拷貝探針，標記數量相對較少，多態性較低，DNA的用量多，相對要求DNA較完整，而且使用酶切反應，要求DNA純度也較高。RAPD，降解了的模板DNA在擴增時對模板濃度很敏感，即不同的濃度會出現不同的擴增式樣。而且，這種方法在擴增反應時要求模板盡量少含雜質，對于材料中多糖與多酚等物質必須盡可能的去除。最重要的是，RAPD使用低溫復性，通常為36'c(溫度在36t:以下，小于rc的變化就會得到完全不同的擴增樣式)，特異性低，引物與模板間有較高的錯配率，而且重復性低，即便同一實驗室也不易重復，不同的實驗室間更是缺乏可比性。AFLP，程序復雜，其實驗程序比RAPD和SSR復雜得多，操作比較麻煩。而且AFLP的第一步就是制備高分子量的基因組DNA，然后酶切。DNA測序，測序成本較高，實驗操作復雜，任何少量的DNA污染(如空氣中的花粉、孢子和細菌，操作人員的頭屑等)都會造成假陽性擴增，致使測序的片段來自DNA污染物，出現鑒定錯誤。因此這種方法對人員素質、儀器設備及經費的要求都較高。相對而言，SSR(Simplesequencer印eat簡單重復序列)分子標記法操作簡單，多態性豐富，重復性較好。但是它最大的不便就是其兩端引物序列的設計。因為SSR序列兩端序列的相對保守和單拷貝性，這種技術要在了解物種的基因背景并設計出相應的引物時應用，目前由于對真姬菇的分子信息知之甚少，國內外還沒有采用SSR方法對真姬菇進行標記和鑒別報道。
發明內容本發明目的在于提供一種真姬燕工廠化栽培菌株的鑒別方法。采用該方法可準確快速經濟的鑒別出真姬菇工廠化栽培菌株。本發明克服了已往真姬菇工廠化菌株的鑒別缺陷，首次利用相近食用菌物種的已知DNA序列，設計篩選SSR引物序列，成功構建了SSR標記圖譜，實現了對真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別。同時，為其他分子信息、遺傳背景知之甚少的食用菌的SSR分子標記開發提供了有效的借鑒和方法。需要說明的是，并不是所有設計出的SSR引物都能夠擴增出條帶，更不要說是特異性條帶；就算可以擴增出特異條帶的引物也不是都可以用來區分工廠化與非工廠化栽培的菌株。為了達到上述目的，本發明的技術方案包括下列步驟-1)樣品總DNA的提取；2)SSR位點兩側引物的篩選，其中SSR位點兩側引物選自與真姬恭//>;/^z_ygimwmo^M親緣關系相近的食用菌物種的SSR標記的兩翼引物；3)PCR擴增；64)PCR產物檢測；5)SSR指紋圖譜分析及判定。上述步驟l中，樣品總DNA的提取可以是樣品菌絲體或子實體的任一部分的總DNA的提取。上述步驟2中，與真姬菇/fy;wiz少g^mfl/wow^親緣關系相近的食用菌物種包括香燕(Z^對/w"/aecfod&s)、糙皮偵U耳(P/ewra/iwos/reo^s)、灰蓋鬼傘(Co/r/"w上述與真姬菇/Z;^^j^wmarmo"w親緣關系相近的食用菌物種的SSR標記通過在與真姬菇親緣關系相近的食用菌物種己公布的DNA序列中識別SSR獲得。較佳的，上述PCR引物選自下列引物對中的一組或多組:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述PCR引物的兩端可以添加不定數的堿基保護、酶切位點或接頭。也可以在合成引物時使引物帶上熒光標記或是同位素標記。例如，添加不定數的堿基可根據PCR引物設計原則，在上述引物基礎上，以上述引物為核心，兩端添加115個堿基，使擴增條帶更專一。上述步驟3以樣品總DNA為模板進行PCR擴增，其中，PCR引物即為步驟2篩選獲得；上述步驟4中，PCR的檢測方法可采用常規的電泳及染色的方法，其中，染色方法可以采用溴乙啶(EB)、銀染、熒光技術和同位素法。如果PCR引物帶有熒光標記或同位素標記，也可直接進行熒光檢測或同位素檢測。上述步驟5中，SSR指紋圖譜結果分析及判定可以采用軟件進行分析，也可以目測。具體的，SSR指紋圖譜結果可采用聚類分析后進行判定。本發明的有益效果是提供了鑒別真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，利用本方法可以在一個工作日內準確鑒定出真姬燕工廠化栽培菌株的真偽。采用本方法能夠快速、準確、經濟的鑒別真姬菇工廠化栽培菌株，這對建立工廠化栽培真姬菇品種的分子標記系統，保護菌種的知識產權，提升國內食用菌企業在國際市場的競爭力，都有重要的意義。同時，也為其他遺傳背景薄弱食用菌的SSR分子標記的開發提供了方法。圖l為本發明一具體實施的技術路線圖。圖2為引物HSSR1擴增結果圖3為引物HSSR2擴增結果圖4為引物HSSR3擴增結果圖5為引物HSSR4擴增結果圖6為引物HSSR5擴增結果圖7為引物HSSR10擴增結果圖8為引物HSSR11擴增結果圖9為引物HSSR14擴增結果圖10為引物HSSR16擴增結果圖11為引物HSSR17擴增結果圖12為引物HSSR20擴增結果圖13為引物HSSR29擴增結果圖14為27個菌株的聚類分析圖圖2-13中，M為marker，127為27個菌株，其中1419為6個工廠栽培菌株，CK為陰性對照。注部分圖中CK中有微弱的100bp左右的帶為引物二聚體，扣除陰性對照中的結果。具體實施例方式本發明首先從真菌基因組計劃網站FGP(http:〃fUngalgenomics.concordia.ca)禾口NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)下載與真姬燕親緣關系相近的食用菌物種已公布的DNA序列，利用軟件從下載的序列中查找SSR，選擇合適的SSR序列，利用軟件設計SSR兩翼引物；接著，利用CTAB法提取真姬菇工廠化栽培菌株及其他非工廠化栽培菌株的總DNA;然后利用上述引物和總DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物進行電泳；最后，對電泳結果進行目測或軟件分析，判定結果。下面結合圖l和實施例對本發明進一步說明，應理解，實施例并非用于限制本發明的保護范圍。實施例l1、相近物種的DNA序列數據收集從真菌基因組計劃網站FGP(http:〃fUngalgenomics.concordia.ca)和NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.goV)下載香菇等真姬菇相近物種的長度大于150bp、5，和3'末端50bp堿基內不包含(T)5或(A)5的香燕(i:^^m/to^/^fey)、糙皮偵U耳(P/ewrart^osrea^y)、灰蓋鬼傘(Cop"Vmsc/wewws)等親纟彖關系較近的DNA序列。2、DNA序列中發掘SSR用GRAMENE網站提供的SSR鑒定工具SSRIT(SimpleSequenceRepeatIdentificationTool)對下載的EST序列進行SSR鑒定(http:〃www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，或4吏用SSRHunter1.3軟寸牛結合人工進行SSR查找。識別標準為單、二、三、四、五和六核苷酸重復基序最小長度分別為15、8、5、4、3和3次。3、PCR引物設計選取符合條件的SSR禾!j用Primer3軟件(http:〃redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/primer3.php)或DNAstar軟件包中的Editseq禾卩Primerselect軟件或其他引物設計軟件設計引物。引物設計的主要參數為弓l物長度為1724bp;PCR產物大小為90400bp;弓I物退火溫度為45。C65匸，上下引物之間退火溫度相差不超過2。C;(G+C)含量為40。/。60。/。，最適為50%。引物由生物工程公司合成。共設計出引物30對。4、材料及CTAB法提取總DNA材料為上海農業科學院食用菌所菌種保藏中心提供的真姬菇非工廠化栽培菌株21株和6個工廠化栽培菌株。用CTAB法提取基因組DNA略有改進。一20。C冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65。C預熱的2XCTAB抽提液[2e/。(W/V)CTAB;100mmol/LTris'HCI，pH8.0;20mmol/LEDTA，pH8.0;1.4mol/LNaCl]，65。C保溫45min以上，間或輕搖混勻，然后12000r/min室溫離心20min;取上清加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，輕輕混勻30min以上，12000r/min室溫離心20min;上清夜移入新離心管中，加入2/3體積的一20。C預冷10的異丙醇，輕輕搖動5min，8000r/min室溫離心10min;去掉上清，用75%乙醇1Ommol/LKAC抽提23次，每次8000r/min室溫離心10min，再加入預冷的95%的乙醇，輕輕上下顛倒，12000r/min室溫離心20min;棄去乙醇，真空抽干或自然晾干，加入200pLTEbuffer,輕輕敲打使沉淀溶解加入l^iL10mg/mLRNase(由Boudder公司提供)37'C水浴，保溫lh，去除RNA。DNA提取物一20。C冰箱貯藏備用。5、PCR擴增及其產物電泳PCR擴增反應體系為25pL:25ng/nLDNA(可以是濃度為2030ng/(iL)l(iL，0.4jimol/L上游引物，0.4pmol/L下游引物，10><PCRbuffer2.5pL，25mmol/LMgCl22pL，1Ommol/LdNTP0.25)liL，以及5U/jaLTaqpolymerase0.2(iL。PCR擴增反應程序為94。C變性3min，然后是35個循環(94匸變性30s，48"復性40s，72。C延伸30s)，最后72。C延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，溴乙啶(EB)染色，G:BOXSYNGENE凝膠成像系統成像拍照。設計的30對引物中，有12對引物成功擴增，并表現出菌株特異性條帶，這12對引物序列如下引物名稱上游引物(5，-3，)下游引物(5'-3')HSSR1ATGCCGTTCCAAAGATACTTGAAGCCTGACAGAGTGHSSR2GCGGTTGTTGTGGTGGTCAGTCGGAGGGTCTTGGHSSR3CGTGAATCCAACCCTCGAAACAGTCGGCTCCTHSSR4AGCAACCAAGGGAAAGAATGAAGCAGTGGCTACAAAGGAGHSSR5AAAGATGCTGCTACTGCTTCCAACCTTGCGATAHSSR10GAACCTCGCTCGCCACACGCCGAAGGGAAATACGHSSR11CTGCCACCAACCACTCTTTATGCGACCTCATCTCCC11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6、SSR指紋圖譜分析及判定將有帶或無帶分布記錄為l或0。利用NTSYS-pc2.10e軟件(RohlfF丄(2000)NTSYS-pc:NumericalTaxonomyandMultivariateAnalysisSystem,Version2.1,UserGuide.ExeterSoftware,NewYork)進行聚類分析。對SSR標記獲得的原始0、l矩陣用SimQual程序求SM相似系數，并獲得相似系數矩陣。用SHAN程序中的不加權成對群算術平均數方法UPCJMA進行系統聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類圖。電泳結果顯示設計的SSR引物可以擴增出條帶，通過電泳圖能夠將工廠化生產的菌株與非工廠化生產用菌株加以區分。有些一對引物就可以將它們區分，如引物HSSR5，18號生產用菌株不能擴增出條帶，而其他菌株都可以擴增出l條或多條。有些通過多對引物的組合，可以將另外幾個工廠化生產的菌株加以區分，如引物HSSR1+HSSR10組合引物，就可以將16號生產用菌株區分開——在引物HSSR1擴增中，16號菌株除引物二聚體條帶外，無擴增條帶，14號、19號也一樣；在引物HSSR10中，16號擴增出2條，而14號、19號分別擴增出3條、4條。如果在這些引物的兩端加上熒光信號，就可以不需要經過電泳，PCR結束直接進行熒光檢測，通過熒光的有無與強弱將菌株加以區分，將進一步縮短菌株鑒別的時間。聚類分析結果(見附圖)顯示工廠化栽培菌株14、15和16號菌株關系較近，聚為一支；18與19號菌株關系較近；17號則與其它生產用菌株有一定距離；同時，11號與12號為分離自同一子實體的不同部位，它們相似系數為100%，完全聚在一起，驗證了本方法的真實有效性。序歹'J表〈110〉上海市農業科學院食用菌研究所<120>—種真姬菇工廠化栽培菌株的SSR分子標記鑒別方法〈130〉080910〈160〉24〈170〉Patentlnversion3.1<210>1〈211〉18<212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉1atgccgttccaaagatac18〈210〉2<211〉18〈212〉DNA<213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉2ttgaagcctgacagagtg18〈210〉3〈211〉17〈212〉薩〈213>artificialsequence〈223〉引物〈400〉3gcggttgttgtggtggt17<210>4<211>17〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400〉4c觀tcgg3gggtcttgg17〈210〉5〈211>16〈212>DNA<213〉artificialsequence〈220〉<223>引物〈400〉5cgtgaatccaaccctc16〈210〉6〈211〉16<212〉腿〈213〉artificialsequence〈220>〈223〉引物〈400〉6gaaacagtcggctcct16〈210〉7〈211〉20〈212〉腿<213〉artificialsequence<220〉〈223〉引物〈400〉7agc朋cc33ggg3朋gaMg20<210〉8〈211〉20〈212〉DNA<213〉artificialsequence〈220>〈223〉引物<400>8aagcagtggctaca朋ggag20〈210〉9〈211〉17<212>DNA<213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400>9aaagatgctgctactgc17<210〉1016〈211〉16<212〉畫<213〉artificialsequence〈220〉〈223>引物〈400〉10ttccaaccttgcgata16〈210〉11〈211〉17〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉<223〉引物〈400〉11gaacctcgctcgccaca17〈210〉12〈211〉17<212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉12cgccgaagggaaatacg17〈210〉13〈211〉18<212〉DNA<213〉artificialsequence<220〉〈223〉引物<400〉13ctgccaccaaccactctt18〈210>14〈211〉18<212〉DNA<213〉artificialsequence〈220>〈223〉引物<400〉14tatgcgacctcatctccc18〈210〉15〈211〉19<212>腿<213>artificialsequence<220>〈223〉引物<400〉15cctctgtatcctcgttgtc19<210>16〈211〉16〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220><223>引物<400>1618ttgaagcgtttgtggc16〈210〉17〈211〉17<212>DNA〈213〉artificialsequence<220>〈223〉引物<400>17cgtcctacatagttccg17<210〉18<211>18〈212〉DNA<213〉artificialsequence<220〉〈223〉引物<400>18gagtgagggtctgagttg18〈210〉19〈211>17〈212>DNA〈213〉artificialsequence〈220〉<223>引物〈400〉19gatgggatgaagg咖t17<210〉20<211>16<212〉腿〈213>artificialsequence〈220〉<223〉引物<400〉20tggcttattagggtgg16〈210〉21<211>16〈212〉DNA<213〉artificialsequence〈220><223>引物〈400>21tgacgggtgctgttta16<210>22<211〉19<212>DNA〈213〉artificialsequence<220>〈223〉引物〈400〉22ga卿ggctgaatgtagtg19〈210>23〈211〉16〈212〉DNA<213〉artificialsequence20〈220〉〈223>引物<400>23tcccgaagaggaaggt16〈210〉24〈211>16〈212〉DNA<213〉artificialsequence<220><223>引物<400〉24tctgcccagtcccaac1權利要求1.一種真姬菇Hypsizygusmarmoreus工廠化栽培菌株的鑒別方法，包括下列步驟a.樣品總DNA的提取；b.SSR位點兩側引物的篩選，其中，SSR位點兩側引物選自與真姬菇Hypsizygusmarmoreus親緣關系相近的食用菌物種的SSR標記的兩翼引物；c.PCR擴增；d.PCR產物檢測；e.SSR指紋圖譜分析及判定。2.如權利要求l所述真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述步驟a中，樣品總DNA的提取為樣品菌絲體或子實體的任一部分的總DNA的提取。3.如權利要求l所述真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述與真姬菇/^/wizyguswam2W^w親緣關系相近的食用菌物種選自香菇丄ewf/ww/aet/ofifes、糙皮側耳尸/ewo^sos^e"^s禾口灰蓋鬼傘CopnV2^c/werew。4.如權利要求l所述真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述步驟b中，篩選獲得的SSR位點兩側引物選自下列引物對中的一組或多組1)上游引物5'.-3，ATGCCGTTCCAAAGATAC下游引物5'--3，TTGAAGCCTGACAGAGTG2)上游引物5'.-3，GCGGTTGTTGTGGTGGT下游引物5'國3，CAGTCGGAGGGTCTTGG3)上游引物5'.-3，CGTGAATCCAACCCTC下游引物5'-3，GAAACAGTCGGCTCCT4)上游引物5，-3，AGCAACCAAGGGAAAGAATG下游引物5'國3，AAGCAGTGGCTACAAAGGAG5)上游引物5'.-3,:AAAGATGCTGCTACTGC下游引物5'畫3,:TTCCAACCTTGCGATA6)上游引物5，.-3，GAACCTCGCTCGCCACA下游引物5'-3，CGCCGAAGGGAAATACG7)上游引物5，.-3，CTGCCACCAACCACTCTT下游引物5'畫3,:TATGCGACCTCATCTCCC8)上游引物5，.-3，CCTCTGTATCCTCGTTGTC下游引物5'-3,:TTGAAGCGTTTGTGGC9)上游引物5，--3,:CGTCCTACATAGTTCCG下游引物5'-3，GAGTGAGGGTCTGAGTTG10)上游引物5，-3，GATGGGATGAAGGAACT下游引物5'-3，TGGCTTATTAGGGTGG11)上游引物5，-■3，TGACGGGTGCTGTTTA下游引物5'畫3,:GAAGAGGCTGAATGTAGTG12)上游引物5，-■3，TCCCGAAGAGGAAGGT下游引物5'-3，TCTGCCCAGTCCCAAC。5.如權利要求1或4所述真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述引物的兩端添加堿基保護、酶切位點或接頭。6.如權利要求1或4所述真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述引物帶有熒光標記或同位素標記。7.如權利要求l所述真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述步驟d中，PCR的檢測方法為電泳及染色的方法，或者，對帶有熒光標記或同位素標記的引物，電泳后直接進行熒光或同位素檢測。8.如權利要求7所述真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述染色方法選自溴乙啶、銀染、熒光技術或同位素法。9.如權利要求l所述真姬燕工廠化栽培菌株的鑒別方法，其特征在于，所述步驟e中，SSR指紋圖譜結果分析及判定采用軟件分析或目測。全文摘要本發明公開了一種鑒別真姬菇工廠化栽培菌株的方法，即采用分子標記法中的SSR標記對真姬菇工廠化栽培菌株進行鑒別。本發明利用真姬菇相近食用菌物種的已知DNA序列，設計篩選SSR引物序列，成功構建了SSR標記圖譜，實現了對真姬菇工廠化栽培菌株的鑒別。采用本方法能夠快速、準確、經濟的鑒別真姬菇工廠化栽培菌株。文檔編號C12N15/11GK101684487SQ20081020039公開日2010年3月31日申請日期2008年9月24日優先權日2008年9月24日發明者馮志勇,巖董,輝陳,陳明杰,高君輝申請人:上海市農業科學院