一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的方法

專利名稱：一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高重組蛋白表達水平的技 術方案。
背景技術：
酵母是一類單細胞的低等真核生物，兼有原核和真核細胞的特點既培養 方便，繁殖快，成本低，易于基因操作，又具有分泌途徑，可對真核基因產物進 行翻譯后加工修飾，得到正確折疊、有活性的蛋白質。因此酵母表達系統被譽為 最有商業價值的表達系統(F. R. Schmidt, Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry, Appl Microbiol Biotechnol ，65:363—372， 2004)。除應用廣 泛的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)禾卩巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) 表達系統外，還存在一類以克魯維酵母(Kluyveromyces)為代表的非常規酵母 表達系統。
克魯維酵母主要包括乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克魯維 酵母(Kluyveromyces fragilis )、馬禾斗斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus) 等種類，其中乳酸克魯維酵母是一種能夠以乳酸作為唯一炭源生長的酵母，具有 營養要求極其簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應范圍廣(25°C-46°C)、 分泌蛋白能力強，對人類安全(GRAS， Generally Regarded as Safe)等特點，是 一種較理想的重組蛋白表達宿主細胞，迄今已建立了適于外源基因表達的較完善 的乳酸克魯維酵母表達系統，利用該系統人們己成功表達了人血清白蛋白、a-半乳糖苷酶、牛凝乳酶等多種重組蛋白(Albert J丄van Ooyen et al， Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis, FEMS Yeast Res 6: 381—392, 2006)。
釀酒酵母HAP1基因(ScHAPl)編碼一種轉錄因子，調控一些細胞呼吸代謝途徑必需基因的轉錄表達(Pfeifer， K.， Kim, K.S.， Kogan， S. and Guarente, L. 1989. Functional dissection and sequence of yeast HAPI activator. Cell. 56: 291-301)。作為ScHAPl同源基因，乳酸克魯維酵母HAP1基因(K1HAP1)的功 能目前尚不清楚。

發明內容
本發明的目的在于提供一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達水平的新方法。
本發明提供了一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的方法，該方法包
括如下步驟
(1) 將菊粉酶基因的啟動子、a-信號肽、目的蛋白和菊粉酶基因的終止 子編碼序列依次連接；(菊粉酶基因的啟動子和終止子序列見GenBank登入號 AF178979; a-信號肽的GenBank登入號J01340)
(2) 將(1)得到的序列插入克魯維酵母表達載體pUKD-S或者pUKD;
(3) 用(2)獲得的重組載體轉化克魯維酵母，發酵，取發酵上清液分離即可。
本發明中，(3)中采用的克魯維酵母可以是乳酸克魯維酵母、鷹嘴豆克魯 維酵母、馬科斯克魯維酵母或者脆壁克魯維酵母。
本發明中，所用的乳酸克魯維酵母可以是MW179-1DHAP1基因缺陷菌株。 乳酸克魯維菌株MW179-1D信息見文獻Imrichova D et al. K4W-mediated AWQ7 expression in A7^yverowycej /fl"/s, FEMS Yeast Research, 5 (4-5): 323-329， 2005。
本發明中，(1)中啟動子可以是通過以鷹嘴豆克魯維酵母Y179 (出處見 Zhang J et al. Cloning of the 尺cf/Z ^ Gene and Development of a Transformation System for A7t(yveromyces "'cm'spo陽s ， Appl Microbiol Biotechnol.， 62(4):387-391,. 2003.)的總DNA為模板，以PI和P2為引物，PCR 擴增獲得的；PI的序列如SEQIDN0 2所示，P2的序列如SEQ ID NO 3所示。
本發明中，(1)中終止子可以是通過以鷹嘴豆克魯維酵母Y179的總DNA 為模板，以P5和P6為引物，PCR擴增獲得的；P5的序列如SEQIDN0 6所示，P6的序列如SEQ ID NO 7所示。
本發明中，(1)中的目的蛋白可以是酶、細胞因子、多肽、抗體或者疫苗 抗原。本發明中的重組蛋白可以是商業上有用的蛋白質，包括酶、細胞因子、多 肽、抗體、疫苗抗原，編碼該蛋白質的基因可以來自微生物、植物、動物或人。
本發明的一個實施例中，(1)中的目的蛋白可以是菊粉酶。
本發明中，a-信號肽和菊粉酶編碼序列通過以鷹嘴豆克魯維酵母Y179的 總DNA為模板，以P3和P4為引物，PCR擴增獲得的；P3的序列如SEQ ID N04 所示，P4的序列如SEQ ID NO 5所示。
菊粉酶(inulinase)是一類水解卩-2,l-D-多聚果糖果糖糖苷鍵的一類水解酶。 菊粉酶根據其酶切多聚果糖糖鏈的方式分為外切酶(EC3.2丄80)和內切酶 (EC3,2丄7)。產生菊粉酶的微生物主要為真菌。鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因 GenBank登入號為AF178979，啟動子和終止子序列包括在內。菊粉酶在以下方面 有重要的應用前景。第一是高果糖漿的制備。高果糖漿是理想的天然甜味劑，果 糖的甜度比蔗糖高出80%;能適合糖尿病人食用。同時還具有營養保健功能，能 調節腸胃、提高免疫力、排毒養顏、降解血糖和抗癌等優越的生理學活性，被稱 為第三代功能食品。第二方面，是生物能源領域的應用。目前，生物乙醇的生產 主要是以玉米淀粉為原料，原料的種植面臨與人用糧食爭奪土地的尷尬。菊芋的 主要成分菊粉，它的生長條件粗狂，種植不占用耕地，不僅能生長鹽堿地，還能 生長在沙漠地區，能防止土地沙化，以菊粉為原料生產生物乙醇可以成為目前淀 粉乙醇的補充和后備方法。菊粉在菊粉酶的作用下，水解成單糖，能直接被酵母 利用，產生乙醇。因此，制備菊粉乙醇是否可行關鍵是成本的高低，這其中生產 菊粉酶成本是關鍵中的關鍵。
本發明的方法具體說明如下
1.菊粉酶基因啟動子、終止子控制的重組蛋白克魯維酵母表達質粒構建。 (1)重組蛋白基因表達盒構建
以克魯維酵母基因組DNA為模板，設計特異性引物，利用PCR技術分別擴 增外切菊粉酶基因啟動子和終止子序列，再通過PCR擴增重組蛋白基因序列，將 菊粉酶基因啟動子、終止子和重組蛋白基因序列分別進行限制性內切酶酶切處
理，經過DNA連接酶的連接反應，將菊粉酶基因啟動子、重組蛋白基因和菊粉 酶基因終止子序列依次克隆于pBS—SK質粒上，獲得由菊粉酶基因啟動子、重組 蛋白基因和菊粉酶基因終止子序列三種元件構成的重組蛋白基因表達盒。采用的 PCR、酶切、連接、大腸桿菌轉化等基因工程技術方法均為常規方法，參照《分 子克隆實驗指南》(J.Sambrook,etal.,第二版，1996)。 (2)重組蛋白克魯維酵母表達質粒構建
pUKD-S是在克魯維酵母中高度穩定的載體，由克魯維酵母質粒pKDl、鷹 嘴豆克魯維酵母KcURA3基因和大腸桿菌pUC19序列構成。將載體pUKD-S用限 制性內切酶Sse3871切開，用Klenow酶填平粘性末端；將克隆PBS-SK質粒上的重 組蛋白表達盒用限制性內切酶切下，表達盒片段經分離后，也用Klenow酶填平 粘性末端。然后，表達盒片段和載體pUKD-S片段用DNA連接酶連接，得到菊粉 酶基因啟動子和終止子控制的重組蛋白基因克魯維酵母表達質粒。 '
2.菊粉酶基因啟動子、終止子控制的重組蛋白克魯維酵母表達質粒導入 HAP1基因缺陷型克魯維酵母菌株，構建重組蛋白表達工程菌。
將菊粉酶基因啟動子和終止子控制的重組蛋白基因克魯維酵母表達質粒用 LiAc完整細胞轉化方法導入HAPl基因缺陷的克魯維酵母菌株(Ura3一)，篩選能 在缺少尿嘧啶的選擇性培養基中生長的酵母菌，即得到重組蛋白克魯維酵母基因 工程菌株。酵母細胞LiAc轉化方法參照《酵母遺傳學方法實驗指南》(A. Adams, etal.,2000)。
另一方面，本發明還提供了一種用于提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量 的載體，該載體由菊粉酶基因的啟動子、a-信號肽、目的蛋白、菊粉酶基因的 終止子編碼序列和載體序列組成；其中菊粉酶基因的啟動子、a-信號肽、目的 蛋白、菊粉酶基因的終止子編碼序列依次連接，載體是pBS一SK、 pUKD-S或者 pUKD，菊粉酶基因的啟動子、a-信號肽、目的蛋白、菊粉酶基因的終止子編碼 序列組成的DNA片段插入載體的多克隆位點。
本發明構建了含有菊粉酶基因啟動子、終止子元件和重組蛋白基因序列的 克魯維酵母表達質粒，并將該質粒導入克魯維酵母菌株中，建成克魯維酵母基因
工程菌生產重組蛋白，明顯促進克魯維酵母表達重組蛋白。本發明可用于提高多 種蛋白的表達量，為降低生產成本、擴大生產規模提供了新的方法。


圖1:菊粉酶基因表達質粒pUKD-S-aF-PinuT結構示意圖。
圖2:乳酸克魯維酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT發酵分泌表達菊粉 酶聚丙烯酰氨凝膠電泳圖。
圖3:乳酸克魯維酵母工程菌klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT發酵分泌表達菊粉 酶聚丙烯酰氨凝膠電泳圖。與圖2相比，菊粉酶蛋白條帶的濃度大大加深，說 明其表達產量大大增加。
圖4 : 乳酸克魯維酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT發酵樣品單位體積菊粉酶活性分析。其中，用黑色三 角表示的是乳酸克魯維酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT發酵樣品，用黑色 方塊表示的是klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT發酵樣品。
圖5:乳酸克魯維酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-ccF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT發酵樣品單位菌體生產菊粉酶活性分析。
具體實施例方式
實施例1鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達質粒pUKD-S-aF-PinuT構建 ①.鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達盒構建
首先，以鷹嘴豆克魯維酵母Y179的總DNA為模板，分別以P1和P2、 P5 和P6為引物，通過PCR技術擴增出鷹嘴豆克魯維酵母外切菊粉酶基因的啟動子 區DNA片段、菊粉酶基因編碼區與終止子區DNA片段，再以pPIC9K質粒為 模板，以P3和P4為引物，通過PCR技術擴增出a -Factor信號肽DNA片段。 按照各個片段設計的酶切位點進行相應的限制性內切酶處理，所得3個酶切片段 與經過限制性內切酶EcoRl、 HindIII雙酶切處理的質粒pBS—SK連接，獲得質 粒pBS—SK-aF-PinuT，即由菊粉酶基因啟動子、a-Factor信號肽、菊粉酶基因 編碼區和終止子構成的菊粉酶基因表達盒克隆在質粒pBS_SK上。
所用的6條引物的核苷酸序列如下
克隆菊粉酶基因啟動子片段兩條引物序列是
PI: 5，AG GAATTC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA3，(見SEQ ID NO 2，下劃線部分為BamHl酶切位點)
P2: 5， ACACTAGT ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3，(見SEQ ID NO 3，下劃線部分為Spel 1酶切位點)
克隆a -Factor片段兩條引物序列是
P3: 5" ACACTAGT TGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA3，(見SEQ ID N04，下劃線部分為Spell酶切位點)
P4: 5' ACAGATCT TCTTTTATCCAAAGATACCCCTTCTTC 3，(見SEQ IDN05，下劃線部分為BglII酶切位點)
克隆菊粉酶基因編碼區與終止子區片段兩條引物序列是
P5: 5， ACAGATC GATGGTGACAGCAAGGCCATCAC3，(見SEQ ID NO 6，下劃線部分為BglII酶切位點)
P6: 5， ATAAGCTT TAGGCAGGGCTGTGATACACCTGT3'(見SEQ ID NO 7，下劃線部分為HindIII酶切位點)
②鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達質粒pUKD-S-aF-PinuT構建
將①中質粒pBS—SK-aF-PinuT用限制性內切酶BamHl 、 HindIII切出菊粉 酶基因表達盒DNA片段，片段分離后用Klenow酶填平粘性末端；將酵母載體 pUKD-S用限制性內切酶Sse3871切開，也用Klenow酶填平粘性末端。然后兩 者用DNA連接酶連接，得到鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達質粒 pUKD-S-aF-PinuT，圖譜見圖1。
實施例2表達菊粉酶基因的乳酸克魯維酵母工程菌 Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和工程菌klhaplA/pUKD-S-ccF國PinuT構建。
質粒pUKD-S-aF-PinuT分別轉化乳酸克魯維酵母MW179-1D菌株和HAPl 基因缺陷菌株MW179-1D h叩lA,采用LiAc轉化法。乳酸克魯維酵母HAPl基 因序列為SEQ1.ID.NO 1。
① 接種單菌落到3 ml液體YEPD培養基中3(TC振蕩培養16-18小時。
② 將培養物稀釋到50ml液體YEPD中，使起始OD6QQ=0.2,置30。C振蕩
培養3-5小時，OD600=0.4-0.6。
③ 5K， 5分鐘離心收集細胞。
④ 棄培養液，用25ml無菌水懸浮細胞，再同上離心。
⑤ 棄水，用1 ml 0.1 mol/L LiAc懸浮細胞，轉移到一個無菌1.5 ml離心管中。
⑥ 高速離心5秒鐘沉淀細胞，去除上清，然后加入500 nl 0.1 mol/L LiAc 充分懸浮細胞。
⑦ 取50 ^細胞加到標記的離心管中，高速離心5秒鐘沉淀細胞，去除上清， 然后依次
加入240 pi PEG (50%w/v) ， 36 1.0 mol/L LiAc, 10 |il ssDNA (5 mg/ml), 50 pi水和質粒DNA (0.1-1嗎)。
⑧ 充分混勻細胞，置3(TC保溫30分鐘，然后置42℃水浴熱激20分鐘。
⑨ 高速離心15秒，去除上清，加入150pl無菌水懸浮細胞，然后涂布選擇 性SD培養基平板，置3(TC培養。選擇性SD培養基成分為0.67% YNB， 2% 葡萄糖，0.002%尿嘧啶，0.002%甲硫氨酸和2%瓊脂。
實施例3乳酸克魯維酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT發酵培養及菊粉酶表達分析
① 將乳酸克魯維酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT和 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT分別接入3 ml選擇性SD液體培養基中，在30℃ ， 250 rpm轉速搖床中培養過夜后作為種子液。選擇性SD液體培養基成分為0.67% YNB， 2%葡萄糖，0.002%尿嘧啶和0.002%甲硫氨酸。 ，
② 將種子液以1: 25的比例接入裝有25 ml液體YEPD培養基的150 ml 三角瓶中，在30℃， 250rpm轉速搖床中培養120小時。液體YEPD培養基成分 為1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。
③ 每隔24小時吸取發酵液樣品，5000rpm離心5min沉淀菌體，取上清液 進行表達產物菊粉酶聚丙烯酰胺凝膠電泳分析及菊粉酶活性分析。
圖2和圖3為120小時發酵周期中，不同時間點發酵樣品聚丙烯酰胺凝 膠電泳結果，與乳酸克魯維酵母工程菌Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT相比，
klhapl A/pUKD-S-aF-PinuT菌株產酶量明顯提高。
⑤發酵液菊粉酶活性測定結果表明(圖4、圖5):無論單位體積酶活，還 是單位菌體酶活，HAP1基因缺陷株klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT均明顯高于非缺 陷株Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT ，發酵120小時時，HAP1基因缺陷株 klhaplA/pUKD-S-aF-PinuT產酶量達到391.2單位/毫升，而非缺陷株 Kl-WT/pUKD-S-aF-PinuT產酶量只有178.2單位/毫升，HAPl基因缺陷株產菊粉 酶量是非缺陷株的2.2倍。
序 列 表
<110〉復旦大學
<120〉 一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的方法
<130> 52
<160> 7
<170> Patentln version 3. 1
<210> 1
<211> 5079
〈212〉 廳
<213> 酵母
<400〉 1
cgagagaatatcgctaatgcccctcgatgttgtagcttatgttatggcttctaaaaactg60
tcatctgccattgcatactctttcctttttcttgcgggcttcccaccttctatactgtcc120
aacatcgaaagagagaeicctttaaaataaat3cga肌g3g3cggactgsg180
atg肌tcaggtgttgttattgtacagctcaacagaaagcc240
gt肌ttctggaataatttacctggaagt3catatatttaccg犯tttaac300
tttctttctttcatggttgttg卿g卿ctgtttaagtgattagttttcaatctattcc360
ttaacattcattcttgatagcgaaagggc￡iataggaaa肌柳gstcgggiccttgagttt420
gagataccaeigtgscgcgttgaagttcacgtatatttcgtcaattttttt480
犯ctagtttattatcacacacacagtgatagatatacaaaggtt卿ggtggatattttt540
tgaactatgagctctattacctcacctggaacaggcaccccgcagcagaagcgga卿ga600
aacagagtacccctgagctgtacaatatgtcgaa卿gga犯gttaagtgtgeic犯agga660
cggcctcagtgccagcaatgtgtcaagactggtgttggtcatctatgccattat8tgg朋720
c卿cgtgggctgaagaagccgaga卿agctgtcg犯gg3ttCggElgttgaeigcagctt780
卿g咖gtgtg犯gtctttggaaga犯ctttcatgccactacgacgaat840
cctatgaccagtgCt犯CC3gagtccgLgcgtcagatggtttgaatgtcggttgtcctcat900
gc鄉tggcagtactc肌cggctgttatccggatcc肌tggaaattcacctattctaagt960
acggaaca犯cgccatcc肌tgagaataagt3tg3t肌Cg8tg3gttgg8tttg3caaga1020
C3gttCg3t3tgttacatttggtactgtgcatcttggagctacccattgg1080
ttggcaataatgaaaggtgatccttacttaaaatttctctggggtcatatcttcacatta1140
ag卿g卿ctcacgg肌tggtattctcagaaacgga犯tatagtaccgtctccgctggt1200
gcaggtacatgtcccgtcattcatggctcacc肌atgtccagttgcac8t1260
gc犯ctaggaacgttgcagag卿ccg卿agctctg兆tcacgttgccctgtagcacat1320
gctcctaggcCtCC3C3C肌3犯tgCCCtgttgaccatagtgctttcatc1380
ggttctgctagctcgggtcaatgccccgtggcacat3ccgttgtC幼gg8卿agttgsc1440
gcaactacttctggatgtccaatagaccacac肌agttttcctttatggaaggttctcct1500
gatcctgcagct幼ggg肌agcttccggctttgccgtctttcca犯atttgscagcgaaa1560
tgtccaatgcttcgcg鄉g幼ctccaaiccccaacgttgaacagccaggaatctgggcat1620
aattcg犯acgcactagtgt3gtgCCgg3g 8tgtC3tC8gagcaggccactg8tgccata1680
agcaaggccttgccaccaaaaaaaatcgta ttccttttcatggat肌ftttctttaatcac1740
atttacccaatcgtacctatacttgatgag cagaccttcaaactacaggtaaatc犯att1800
ttgcaaacaaataataacca幼caactgtcaaeittgacgaagccgttagatgcttgtgtt1860
ttggggatsttattgattattttgag犯ta acatggctttccttgactccc幼cgcatgc1920
aatatcaagttaggaccagagtgcgaatcg ttaaaattagaacctaca/tactccgctact1980
atcacacaggctaaagaggaagccatgcta ttaaaatacgaaacacctat2040
gsg3ttgta^ggaaatttttgatc犯gtttgatgaaatcagtagtttcgc犯actccaat2100
gttaacatcaccacagttcaatttgccattttctac犯3ttgtatctcatgtcctctccg2160
gata卿cggattatacacatttacctcaaCgggtC3卿taatgagacc2220
caccaagttcttatgtccagtattgtgcaa3tggCtttC3gctgtggsttgcaccgtgat2280
cctgataatttccctcaactgtcaatggttccaagttgacga犯gaagct2340
ttgtcg犯taCCg3g3g3ttg犯acatacacctggttctttattgtctca2400
cttgatgttcaacagtctctatcactaggtacacccagattattacgtaa2460
ttcagtgacactaaacttccctgtgcatcgaagatcgattatgtgaacaat3"tcaaggaa2520
ctcatcctggtcaagaatttcacattgttcttcceifiattgacttatgtatcatctctgtt2580
ttgaatcatattttgaatgtttctcttgcaagg8C3gtteigaa犯tttgagcttgacc幼2640
c taatacaaagcttaggtaaEictacgtgatggtgttactccgacg犯tgatgttgtcaat2700
g3tCttgtt3ata肌ggcctattatttacc3cag肌ggaactgtgcttttggacca犯ac2760
CC3g3gC3ttcctattcgttaccatccttaacatccgttctttc幼cagtagata肌agc2820
tCttC2Lg33gaa犯ggaa肌gaaactcagtctcgcccacgaagagctttg2880
tttttctcaaaac3tgtc3caatt3gcatgctacaatatttgtt犯actacatcttattc2940
3CgC3tt3Cgaaccgttsggt犯cgaagaccccggcac犯g幼ttttagctaaagattat3000
gCELCELgLgaELgccctcaactatgcagtgg幼ggcttc犯aaactgcatactcttctataac3060
agcaccggt3tgaacaacatgttcagttatatggatgtgcttttgtcgcccacctgcttg3120
gacgtcggacatcgtgctttacagtttatcgtttgcct肌ttttgcgggctaaatgtggc3180
cctttaacaggtatgggtg3atccccagctaaaataacactgtt8Ct3gC3240
atgaaacagaccaaatgaagag€Lg￡LttC￡ltccccatctccagg肌acgtc3300
cttacagatgtC3gtCtgg3tgcaggtgaa肌cttagccgaagttctcctcgcaag幼tg3360
atcttatttcaaaac aaa t ctctgccaaat6Ltaactatgccgtaagaatg3420
caggtttctttatcactttacttaagaaaccttcctcgaaatccaaaact3480
aactctaaaaacaaaaacctaccacgtttgcatcaacatccaaatattgcaaatatgscg3540
agtttcttcaaaaacgttccatcattggtactttcagcagg鄉ggatca肌ttagacgt3600
tgcccggtttatcaggacgcagttgggtttttgccttcgaaagt犯caagcggaaccttc3660
aactcgatttttcactccactgctcctccttctttcaactctgccgttacac犯caattg3720
cccccactgatcaaccaatc3Ctttt3gggacactttaagacgcacatca3780
gatgtg卿ggtactcctga幼ctgcg犯atagacaccac3840
ttctctgagcaaaaagttga3gt幼3ggtggaa犯tcctcaaatatctttaccaccttct3900
CC3gCgC8g3tttctgcggtaactccctttgagcctttgcttccaactttggaca卿tg3960
cctgcagttccac肌ggaaaggttccatatcaagtttgtctgg犯cacsg4020
cctcctattgttgcaccttct犯cttacagcaattaaatttcaactctccagtacccccEi4080
tcagatttatctaacatcactgattcccctgactttgaggacttcctatccg犯cacaca4140
tcacttaatggattaatgata犯cccgtcatccatagtggaagctgttggatttgatggt4200
tattctggga ggcttg肌cg ttagatcgtt catcacttct
gg￡Lt￡Lg3Cgt
catattaata ctgcatagcfi ctg3tt犯eig atattacctc gagaccgaca aggaagtt犯 c犯gagatga cag肌tgttc a幼tgtC3tt caac3csgcc
atggtgggct aaatggcacc ttatttcaaa ttctaattgt caaattcttt tcgactgtaa eittca^gagca aaagcctgct cgctttcact actattatca gaacgtcaga ctatatataa gtgtttgtgc caacgccagt cttagcaagt
tcgcttacaa catcacagaa ca犯tca犯g ggtagttacg ttttctgttc ataccttaat tcagtatagc tcttttctat tacacatcat
3Cggg3tgCg
aatgcagcca ggttatctgt aaattgtttg agaagatccg gcagccggaa
gccgatttct ttttcgatgt ggcgtattac tgccacttat tgcttttcag taaatcatga atcgttagaa acgtatatat tttcatgcat
cttaacctta atcgaagcca catgaaccac tcgtatactc taag犯ttc
taccgataga gggaatgagt aaaagcattt agtttgcctt agttcattaa taaattgtta atcttccact taccttatat gctaatattt
aatagagaaa gaagggttca cagcgacttc tacccaaggt
taataatgat tcattgttac tcaaaattaa gtcactatcc ttaatggeict ataactgcaa ttcatgaact attaccttat 犯gtt犯tct
tcggatattt tcagtccttc tgtcgaatat gttgttgcgt
4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5079
〈210〉 2
〈211〉 32
〈212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈400〉 2
aggaattcaa aacgac冊ga gaagc幼aca ca
32
<210> 3
〈211〉 35
〈212〉 隱 〈213〉人工合成
<400〉 3
acactagtat ct犯ca^aa aaa犯ttaaa tgtgt
35
〈210〉 4
〈211〉 34
<212〉 DNA 〈213〉人工合成
〈400〉 4
acactagttg agatttcctt caatttttac tgca
34
〈210〉 5
<211〉 35
〈212〉 DNA 〈213>人工合成
<400> 5
acagatcttc ttttatccaa agatacccct tcttc 35
<210> 6
<211> 30
<212〉 腿 <213>人工合成
〈400〉 6
acagatcgat ggtgacagca aggccatcac 30
<210> 7
〈211> 32
<212> DNA <213>人工合成
<400> 7
ataagcttta ggcagggctg tgatacacct gt 3權利要求
1. 一種提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將菊粉酶基因的啟動子、α-信號肽、目的蛋白和菊粉酶基因的終止子編碼序列依次連接；(2)將(1)得到的序列插入克魯維酵母表達載體pUKD-S或者pUKD；(3)用(2)獲得的重組載體轉化克魯維酵母，發酵，取發酵上清液分離即可。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中采用的克魯維酵母是乳 酸克魯維酵母、鷹嘴豆克魯維酵母、馬科斯克魯維酵母或者脆壁克魯維酵母。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所用的乳酸克魯維酵母是 MW179-1D HAP1基因缺陷菌株。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中啟動子是通過以鷹嘴豆 克魯維酵母Y179的總DNA為模板，以P1和P2為引物，PCR擴增獲得的；Pl 的序列如SEQ ID NO 2所示，P2的序列如SEQ ID NO 3所示。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中終止子是通過以鷹嘴豆 克魯維酵母Y179的總DNA為模板，以P5和P6為引物，PCR擴增獲得的；P5 的序列如SEQ ID NO 6所示，P6的序列如SEQ ID NO 7所示。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是酶、細胞 因子、多肽、抗體或者疫苗抗原。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是菊粉酶。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，a-信號肽和菊粉酶編碼序列通 過以鷹嘴豆克魯維酵母Y179的總DNA為模板，以P3和P4為引物，PCR擴增 獲得的；P3的序列如SEQ ID N04所示，P4的序列如SEQ ID NO 5所示。
9. 一種用于提高重組蛋白在克魯維酵母中表達量的載體，其特征在于，該 載體由菊粉酶基因的啟動子、a-信號肽、目的蛋白、菊粉酶基因的終止子編碼 序列和載體序列組成；其中，菊粉酶基因的啟動子、a-信號肽、目的蛋白、菊 粉酶基因的終止子編碼序列依次連接；載體是pBS—SK、 pUKD-S或者pUKD; 菊粉酶基因的啟動子、a-信號肽、目的蛋白、菊粉酶基因的終止子編碼序列組 成的DNA片段插入載體的多克隆位點。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高重組蛋白表達水平的技術方案。該方法中，首先將菊粉酶基因的啟動子、α-信號肽、目的蛋白和菊粉酶基因的終止子編碼序列依次連接；然后將上述序列插入克魯維酵母表達載體；最后轉化克魯維酵母，發酵，取發酵上清液分離即得。本發明的方法可以促進克魯維酵母表達重組蛋白的產量顯著增長。本發明可用于提高多種蛋白的表達量，為降低生產成本、擴大生產規模提供了新的方法。
文檔編號C12N9/24GK101386868SQ20081020034
公開日2009年3月18日 申請日期2008年9月23日 優先權日2008年9月23日
發明者靜 俞, 劉建平, 李育陽, 蔡顯鵬, 袁漢英 申請人:復旦大學