轉基因構建物及其在制備時空可調性肝臟損傷模型中的應用的制作方法

專利名稱：轉基因構建物及其在制備時空可調性肝臟損傷模型中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及轉基因構建物及其在制備時空可調性 肝臟損傷模型中的應用。
背景技術：
肝器官移植是目前臨床治療急性肝功能衰竭、終末期肝病以及代謝性肝病 的主要手段。然而由于供體肝的短缺，肝器官移植的臨床應用受到了嚴重限制。
美國每年約有14000人等待肝移植，其中50%等待超過1年，每年約1300人
由于等不到肝移植而死亡。我國要求行器官移植的等待名單也不斷增多。因此， 臨床急需其他方法來改善肝功能，延長患者的生存時間來等待肝移植，或取代 肝移植。
肝細胞具有較強的增殖能力。1988年Bumgardner等率先提出了肝細胞移 植的概念，1993年由Mito等在世界上開展了第一例人體肝細胞移植技術，當 時實行的是自體同源性肝細胞移植。隨后肝細胞移植技術迅速發展，并成為生 物醫學研究的熱點領域之一。通過實驗動物的臨床前期試驗顯示，肝細胞移植 在肝臟、脾臟和其他一些部位后，仍能維持其正常光鏡和電鏡結構，并且能表 達多種肝細胞功能，如血清白蛋白分泌、糖原儲存和酵解、膽紅素結合、氨代 謝以及細胞色素P450酶基因表達等。有望通過肝細胞移植治療的疾病包括肝 臟本身的疾病和肝相關性疾病，如急、慢性肝功能衰竭、慢性病毒性肝炎和肝 硬化等。
我國首例肝細胞移植于2004年獲得成功。目前肝細胞移植已經積累了豐 富的臨床經驗，并能部分或全部代替肝移植而應用于臨床。但是，肝細胞移植 研究的核心仍然是肝細胞的來源問題。臨床研究表明，自體成熟的肝細胞最適 合臨床移植，但這本身就是一個矛盾，為此，人們急于尋求其它來源。
ES細胞向肝細胞的定向分化，體細胞重編程后向肝細胞的定向分化似乎成
4為解決這一問題的有效手段。然而，定向分化產生的"肝細胞"功能是否正常， 需要有好的肝損傷模型來檢測，該模型最好是時空可調節的，可隨時地且高效 地誘導形成肝損傷。

發明內容
本發明的目的在于提供一種可用于制備時空可調性肝臟損傷模型的轉基 因構建物。
本發明的另一目的在于提供一種時空可調性肝臟損傷模型及其制備方法。
在本發明的第一方面，提供一種用于制備時空可調性肝臟損傷模型的構建 物組合，其包括
(1) 構建物l，從5，至3，依次包括以下可操作性相連的元件
啟動子，LoxP序列，報告基因序列，終止子1， LoxP序列，tBid基因序 列，Bax基因序列，終止子2;和
(2) 構建物2，從5'至3'依次包括以下可操作性相連的元件
啟動子，突變型雌激素受體配體結合結構域基因序列，Cre重組酶基因序 列，和終止子；其中所述的突變型雌激素受體配體結合結構域可被雌激素類似 物激活進而激活Cre重組酶活性，不被動物體內雌激素激活。
在另一優選例中，所述的雌激素類似物選自它莫西芬(Tamoxifen),或 4-羥它莫西芬(4-OH Tamoxifen, 4-OHT)。
在另一優選例中，所述的突變型雌激素受體配體結合結構域來源于小鼠雌 激素受體；較佳的是小鼠雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號 NM_007956)第281-599位，并且，其中第525位甘氨酸(G)突變為精氨酸(R)。
在另一優選例中，所述的突變型雌激素受體配體結合結構域來源于人雌 激素受體；較佳的是人的雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號 NM—000125)第282-594位，并且，其中第400位甘氨酸(G)突變為纈氨酸 (V)、第543位甲硫氨酸(M)突變為丙氨酸(A)、第544位亮氨酸(L)變為 丙氨酸(A)。
在另一優選例中，構建物1中，所述的報告基因是/3-半乳糖苷酶基因。 在另一優選例中，所述的報告基因3'端還連接有抗性基因序列；較佳的， 所述的抗性基因是新霉素(Neomycin， Neo)抗性基因。在另一優選例中，構建物1中，所述的啟動子是CAG(巨細胞病毒增強子，
雞/ 肌動蛋白和兔0球蛋白聯合啟動子)啟動子；或構建物2中，所述的啟動
子是白蛋白(Alb)啟動子。
在另一優選例中，構建物1中，所述的終止子1是3X多聚A(3個PA串 聯而成)，或所述的終止子2是兔/ 球蛋白多聚A。
在另一優選例中，構建物2中，所述的終止子是SV40多聚A。
在另一優選例中，構建物2中，在所述的Cre重組酶基因和終止子之間， 還含有一突變型雌激素受體配體結合結構域基因序列。
在另一優選例中，構建物1中，所述的tBid基因和Bax基因之間，還含有 內部核糖體插入位點(IRES)序列。
在本發明的第二方面，提供一種細胞(非生殖細胞)，所述的細胞的基因組 中整合有所述的構建物1和構建物2。
在另一優選例中，所述的細胞是肝細胞。
在另一優選例中，正常情況下，所述的細胞表達報告基因編碼的蛋白；當 用雌激素類似物處理后，所述的細胞表達tBid蛋白和Bax蛋白。
在本發明的第三方面，提供一種制備轉基因非人哺乳動物受精卵的方法， 所述的受精卵用于制備時空可調性肝臟損傷模型，所述方法包括
將所述的構建物1引入非人哺乳動物的受精卵，獲得轉入了所述構建物1 的受精卵；或
將所述的構建物2引入非人哺乳動物的受精卵，獲得轉入了所述構建物2 的受精卵。
在另一優選例中，所述的非人哺乳動物是小鼠。
在本發明的第四方面，提供一種制備時空可調性肝臟損傷模型的方法，所 述方法包括
(1) 將所述的構建物1引入非人哺乳動物的受精卵，將轉入了所述構建物 的受精卵移入假孕非人哺乳動物的輸卵管內，使之繼續發育，生成基因組中整 合有所述的構建物1的非人哺乳動物；
(2) 將所述的構建物2引入非人哺乳動物的受精卵，將轉入了所述構建物200810200207.8 的受精卵移入假孕非人哺乳動物的輸卵管內，使之繼續發育，生成基因組中整 合有所述的構建物2的非人哺乳動物；和
(3)使(1)和(2)獲得的非人哺乳動物進行交配，獲得基因組中整合有所述的
構建物1和構建物2的非人哺乳動物。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。


圖1.利用FACS分析Caspase 8， Bax， tBid基因或它們的組合誘導肝細 胞凋亡的能力。
圖2.構建獲得的轉基因質粒pCALL2-tlB的結構示意圖。 圖3.將攜帶Bax-IRES-tBid(tIB)、 Bax-IRES-tBid(BIt)、 tBid-IRES-EGFP (tIE) 、 Bax-IRES-EGFP(BIE) 、 IRES-EGFP(IE)或陰性對照的質粒分別與 pAlbCreSVPA共轉入LEPC中，通過觀察浮于培養液中死亡的細胞檢測細胞的
凋亡情況。
圖4. PCR鑒定陽性的F1代小鼠。
它們分別來自于7個首建者小鼠，M39: 141-149; M40: 151; F41: 159-162; F42: 163-168， 248-250; F43: 230-235; F44: 237-245; F46: 179-183。 M即
分子量標記D2000(天根公司)，NC為陰性對照。 圖5. 9個小鼠品系肝臟組織RT-PCR結果。
wt是野生型陰性對照；Rosa26是Rosa26-紐al小鼠的陽性對照。29， 149， 161， 168， 183， 234， 238分別是7個首建者小鼠的Fl代。首建者F41的161 號和首建者F42的168號后代顯示出轉基因的表達。GAPDH是內參，陽性對照。
圖6.首建者F42的后代250號轉基因分別在肝臟、腎臟和小腸中的表達 情況。通過X-gal染色可見轉基因]8geo有表達。
圖7. pAlbMerCreMerSVPA和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共轉入 Hepal-6中，24小時后用4-OHT誘導。綠色熒光表達，說明MerCreMer發揮 了活性，將共轉入的質粒loxP中間的mRFP切掉，使下游的EGFP表達。
圖8. pAlbCreERSVPA和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共轉入Hepal-6中，24小時后用4-OHT誘導。綠色熒光表達，說明CreER發揮了活性，將共轉入 的質粒loxP中間的mRFP切掉，使下游的EGFP表達。 圖9. PCR鑒定陽性的F0代小鼠。
61個經過原核注射發育而來的小鼠中，通過針對Alb啟動子和Cre酶的引 物擴增，鑒定出有6只小鼠基因組整合有打靶序列，分別是2、 3、 6、 8、 31、 37。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛的研究，找到了特別適合于高效誘導肝細胞凋亡的基 因，構建了可選擇性表達凋亡基因的構建物，從而建立了一種時空可調性的肝 臟損傷非人動物模型。所述的非人動物模型在沒有誘導的情況下不表達凋亡基 因，而在誘導的情況下可異常高效地表達凋亡基因，從而可高效地、實時地誘 導發生肝損傷(如肝功能衰竭)。
tBid基因和Bax基因
Bid蛋白即BH3 interacting domain death agonist,是Bcl-2家族中的成員之 一，含有一個BH3結構域，其分子質量(Mr)為22000Da。
tBid蛋白是截短的Bid蛋白，是Bid蛋白切去其N端約60個氨基酸而形 成的Bid蛋白片段。tBid是一種細胞凋亡相關的蛋白，可誘導例如Hela細胞等 一些細胞發生凋亡。
本發明可用tBid的全長蛋白或其生物活性片段。任何一種tBid蛋白的生物 活性片段都可以應用到本發明中。在這里，tBid蛋白的生物活性片段的含義是 指作為一種蛋白片段，其仍然能保持完整的tBid蛋白的全部或部分功能(如至 少80%的活性，更佳的至少90%的活性)。經過一個或多個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加而形成的tBid的氨基酸序列也包括在本發明中。所述的經過一個或 多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的tBid蛋白也具有與Bax協同促進肝 細胞凋亡的功能。本發明也可采用經修飾或改良的tBid蛋白，比如，可采用為 了延長其半衰期、改善其穩定性而改良的tBid蛋白。
tBid的來源沒有特別限制，可以是人、小鼠、大鼠、豬或其他哺乳動物的 tBid。作為本發明的一種優選方式，所述的tBid的氨基酸序列可以與GenBank登
錄號為NM—007544所示的序列第319-729位基本上相同。優選的，可采用重組的
8tBid蛋白。在獲得蛋白的序列后，本領域人員很容易得知編碼所述tBid蛋白的
DNA序列。
Bax基因廣泛存在于哺乳動物的多種組織和細胞中，屬于Bcl-2家族的成 員，其參與一些腫瘤細胞的促凋亡作用。
本發明可用Bax的全長蛋白或其生物活性片段。任何一種Bax蛋白的生物活 性片段都可以應用到本發明中。在這里，Bax蛋白的生物活性片段的含義是指 作為一種蛋白片段，其仍然能保持完整的Bax蛋白的全部或部分功能(如至少 80%的活性，更佳的至少90%的活性)。經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的Bax的氨基酸序列也包括在本發明中。所述的經過一個或多 個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的Bax蛋白也具有與tBid協同促進肝細 胞凋亡的功能。本發明也可采用經修飾或改良的Bax蛋白，比如，可采用為了 延長其半衰期、改善其穩定性而改良的Bax蛋白。
Bax的來源沒有特別限制，可以是人、小鼠、大鼠、豬或其他哺乳動物的 Bax。作為本發明的一種優選方式，所述的Bax的氨基酸序列可以與GenBank 登錄號為NM—007527所示的序列第124-702位基本上相同。優選的，可采用重 組的Bax蛋白。在獲得蛋白的序列后，本領域人員很容易得知編碼所述Bax蛋 白的DNA序列。
轉基因構建物
一個好的動物肝損傷模型必須具備如下4個方面的特性時空可誘導性， 操作簡單，肝損傷誘導效率高，容易保存和擴展。為了滿足這些要求，最終 獲得適合的轉基因構建物，本發明人構建了一對構建物。所述的構建物1從5' 至3'依次包括以下可操作性相連的元件啟動子，LoxP序列，報告基因，終 止子l， LoxP序列，tBid基因，Bax基因，終止子2;所述的構建物2包括以
下可操作性相連的元件啟動子，突變型雌激素受體配體結合結構域基因序
列，Cre重組酶基因序列，和終止子；其中所述的突變型雌激素受體配體結合 結構域可被雌激素類似物激活進而激活Cre重組酶活性，且不被動物體內雌激
素激活。
當兩種構建物同時處于一個細胞系統中，在特定誘導條件下可激活Cre重 組酶，從而進一步誘導LoxP位點之間發生重組，使得tBid和Bax基因表達，誘導細胞發生凋亡。
時空可調性的實現基于Cre/loxP系統。本發明人使用了一種雙標記表達框 架，該框架的兩端各包含一個同向LoxP序列，兩個LoxP位點之間是可獨立表 達的報告基因和/或抗性篩選標記基因。當系統中存在Cre重組酶后，Cre重組 酶能夠識別LoxP位點而發生位點專一的重組，將兩個LoxP位點之間的序列切 除，從而下游tBid基因和Bax基因表達。
而細胞中Cre重組酶的活性是通過突變型雌激素受體的配體結合結構域來 調控。將突變型雌激素受體的配體結合結構域與Cre融合之后，Cre的活性受 到突變型雌激素受體的配體結合結構域的調節。由于該結構域是經過突變改造 的，它不響應小鼠自身激素的誘導，而對它莫西芬(Tamoxifen)等物質較為敏感 (參見Logie and Stewart, 1995， Ligand-regulated site-speific recombination, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 5940-5944)。這樣，突變型雌激素受體的配體結合結構 域與Cre融合蛋白便受到Tamoxifen等的調節。
可誘導突變型雌激素受體的配體結合結構域進而調節Cre活性的雌激素類 似物包括4-OHT、 Tamoxifen。
所述的突變型雌激素受體的配體結合結構域可以是來源于多種哺乳動物 的。作為一種優選方式，所述的突變型雌激素受體配體結合結構域來源于小 鼠雌激素受體；較佳的是小鼠雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號 NM_007956)第281-599位，并且，其中第525位甘氨酸(G)突變為精氨酸 (R)。
作為另一種優選方式，所述的突變型雌激素受體配體結合結構域來源于人 雌激素受體；較佳的是人的雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號 NM_000125)第282-594位，并且，其中第400位甘氨酸(G)突變為纈氨酸 (V)、第543位甲硫氨酸(M)突變為丙氨酸(A)、第544位亮氨酸(Leu)變為 丙氨酸(A)。
可用于本發明的啟動子沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于) MMTVLTR啟動子、CMV啟動子、唾液淀粉酶基因啟動子等。作為本發明的 優選方式，采用CAG(巨細胞病毒增強子，雞/5肌動蛋白和兔/3球蛋白聯合啟 動子)啟動子作為構建物1的啟動子，該啟動子是一種泛表達的強啟動子，能 夠驅動它的下游基因廣泛表達，經驗證具有良好的調控基因表達的作用。作為 本發明的優選方式，使用Alb啟動子指導突變型雌激素受體的配體結合結構域
10與Cre融合基因的表達，這樣有利于使得該融合基因在肝臟中特異性表達。當 所述融合基因發生表達，Cre重組酶發揮活性，從而誘導凋亡基因tBid和Bax 的表達，引起組織損傷。
作為本發明的優選方式，在融合表達時，在Cre重組酶基因的5'端和3'端 分別與一個突變型雌激素受體的配體結合結構域基因相連接，即構成 MER-Cre-MER的結構。經過本發明人的實驗比較發現，MER-Cre-MER型的融 合基因具有以下特點在沒有誘導的情況下活性關閉更嚴，在有誘導的情況下 誘導效率更高。
可用于本發明的終止子沒有特別限制，任何適合的具有可終止基因表達功 能的終止子均是可用的。作為本發明的一種方式，構建物1中，所述的終止子 1是3X多聚A，所述的終止子2是兔0球蛋白多聚A;構建物2中，所述的終 止子是SV40多聚A。
本發明所述的各元件之間是可操作性相連的，所述的"操作性相連"或"可 操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調節或控制 同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉錄，那 么它就是可操作地連于編碼序列。
所述的各元件之間可具有適當的間隔序列，例如具有0-1000bp，較佳的 0-500bp的間隔序列。
如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了 "包含"、"主 要由......構成"、"基本上由......構成"、和"由......構成"；"主要由......
構成"、"基本上由......構成"和"由......構成"屬于"含有"、"具有"或
"包括"的下位概念。
動物模型的制備
在獲得了所述的轉基因構建物之后，可用常規方法將線性化的構建物轉入 受精卵中。待子代動物出生后可用本領域已知的多種方法(包括但不限于PCR 檢測、Southern印跡法等方法)鑒定轉基因構建物是否整合入其基因組，從而 獲得轉基因的動物。
因此，本發明還提供了一種制備時空可調性肝臟損傷模型的方法，所述方 法包括(1)將權利要求1所述的構建物1引入非人哺乳動物的受精卵，將轉 入了所述構建物的受精卵移入假孕非人哺乳動物的輸卵管內，使之繼續發育，生成基因組中整合有權利要求1所述的構建物1的非人哺乳動物；(2)將權利 要求1所述的構建物2引入非人哺乳動物的受精卵，將轉入了所述構建物的受
精卵移入假孕非人哺乳動物的輸卵管內，使之繼續發育，生成基因組中整合有
權利要求1所述的構建物2的非人哺乳動物；和(3)使(1)和(2)獲得的非人哺乳 動物進行交配，獲得基因組中整合有權利要求1所述的構建物1和構建物2的 非人哺乳動物。
為了得到遺傳穩定的后代，作為本發明的優選方式，所述的方法還包括 (4)將(3)獲得的轉基因非人哺乳動物與(3)獲得的非人哺乳動物交配，獲得基因 組中整合有所述的構建物的后代非人哺乳動物。
本發明所述的非人哺乳動物可以為鼠、羊、牛、豬、兔等。優選的是鼠， 包括小鼠、大鼠或其它類型的鼠。
本發明的時空可調性肝臟損傷模型的主要用途包括但不限于肝損傷的預
防研究，肝細胞移植的效果分析，肝臟再殖的效果分析等。
一種利用本發明的時空可調性肝臟損傷模型來分析待測肝細胞移植效果
的方法是(l)將雌激素類似物(如Tamoxifen或4-OHT)給予前述獲得的基因 組中整合有權利要求1所述的構建物1和構建物2的非人哺乳動物，激活Cre 重組酶，Cre重組酶進一步誘導構建物1的LoxP位點之間發生重組，使得loxP 之間的序列被切掉，導致tBid和Bax基因表達，誘導細胞發生凋亡，從而形成 動物肝損傷模型；(2)將待測肝細胞移植到動物的肝臟，觀察移植后肝臟的情 況，從而得知待測肝細胞移植效果。
分析待測肝細胞移植效果或肝臟再殖效果的方法是本領域已知的技術，例 如可通過免疫組織化學的方法。
本發明的主要優點在于
(1) 本發明人找到了特別適合于誘導肝細胞凋亡的基因組合，其可發揮高 效的誘導肝細胞凋亡作用。
(2) 本發明人構建了可選擇性表達凋亡基因的時空可控性構建物，從而建 立了時空可調性的肝臟損傷非人動物模型。所述動物模型可隨時地、高效地誘 導肝損傷，為肝細胞移植、肝臟再殖的研究提供了有效的途徑。因此，本發明 人建立了一種新的方法來誘導組織損傷。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方
法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所 建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
I.材料
1. 質粒與菌株
轉基因載體pCALL2獲自加拿大Samuel Lunenfeld研究所； pIRES2-EGFP質粒和pEGFP-N2購自Clontech公司； pMD18T-simple質粒購自Takara公司； pET28a質粒購自Novagen;
pcDNA3和pcDNA3.1/Hygro(-)購自Invitrogen公司。
2. 工具酶與試劑
限制性內切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；
dNTP、 Hifi Taq Platinum、 Trizol、 RT-PCR kit購自Invitrogen;
TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、 X-gal購自天根公司；
DNA小量快速抽提試劑盒購自博大泰克公司；
膠回收試劑盒購自捷瑞公司；
QIAprep Maxprep Kit購自Qiagen公司。
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I購自BD Biosciences公司。 轉染試劑Effectene購自Qiagen公司。
II.實施例
實施例l.確定最適合于誘導肝細胞凋亡的基因
已知有多種基因可誘導細胞凋亡，本實施例中首先選擇最適合于誘導肝細 胞凋亡的基因。
用常規的FACS的方法，對三個基因Caspase8， Bax， tBid誘導肝細胞凋亡 能力進行比較，確定最適合的基因。將Caspase8， Bax，和tBid分別克隆到載體pcDNA3.1 (購自Invitrogen)中。以小鼠肝臟cDNA作為模板，引物序列分別是(上游引物設置五coi /位點，下游引物設置^o/位點)
Caspase 8 F (SEQ ID NO: 2):
CTCTGAATTCCCATGGATTTCCAGAGTTGTCTTTATGC:Caspase 8 R (SEQ ID NO: 3):
GCACCTCGAGTTAGGGAGGGAAGAAGAGCTTCTT;BaxF(SEQ ID NO: 4):
GCAGGAATTCCCATGGACGGGTCCGGGGAG;BaxR(SEQ ID NO: 5):
GTGGCTCGAGTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGG;■ F (SEQ ID NO: 6):
ATATGAATTCGCATGGGCAGCCAGGCCAGCC;tBidR(SEQ ID NO: 7):
GCGCCTCGAGTCAGTCCATCTCGTTTCTAACCAAG;
將攜帶Caspase 8， Bax或tBid的載體單獨轉染入LEPC細胞(小鼠成體雙能肝干細胞；來自上海第二軍醫大學；可參見Li WL等，2006， Isolation andcharacterization of bipotent liver progenitor cells from adult mouse. Stem Cells. 24:322-332)中，或者將攜帶Bax的載體和攜帶tBid的載體。FACS檢測結果見閣l，由結果可見，單獨轉染中，tBid促凋亡的能力最強，Bax次之，Caspase最弱。而共轉Bax和tBid時，促凋亡的能力最強。
可見，對于肝細胞而言，Bax和tBid共同表達的促凋亡作用最強。
實施例2.轉基因載體構建
用PCR的方法從小鼠肝臟cDNA中擴增tBid和Bax基因，并將它們連接到pMD18T-simple載體中。
引物序列如下
腕F(SEQ ID NO: 8):
5 ，-ATATAGATCTACCATGGGCAGCCAGGCCA-3';tBidR(SEQ ID NO: 7):5，-GCGCCTCGAGTCAGTCCATCTCGTTTCTAACCAAG-BaxF(SEQ ID緣9):
5 ， - AT AT AG ATCT ACC ATGG ACGGGTCCGGG-3 ，；BaxR(SEQ ID NO: 5):
5 ， -GTGGCTCG AGTC AGCCC ATCTTCTTCC AGATGG-3 ，。
PCR擴增條件分別如下
tBid:首先94。C， 5min;然后94。C， 30s; 56°C， 30s; 72°C， 30s; 30個循環；最后72°C， lOmin。
Bax:首先94°C， 5min;然后94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 30s; 30個循環；最后72°C， lOmin。
用5g/J/和Wco /將IRES序列從pIRES2-EGFP中切下來，連接到pET28a中相應的位點，得到pET28a-IRES;接著用PCR的方法，從肝臟cDNA中擴增出Bax和tBid并分別插入pMD18T-simple載體中，得到pMD18T-Bax和pMD18T-tBid，測序結果正確后，用Wco/和/將Bax從pMD18T-Bax中切下來，連接到pET28a-IRES相應位點，得到pET28a-IRES-Bax;再用萬g/7/和Z/ o /將tBid從pMD18T-tBid中切下來，連接到pET28a-IRES-Bax的5g/ //和SaZ/之間，得到pET28a-tBid-IRES-Bax，簡稱pET28a-tlB。接下來用5《///和;Ow/將tlB切下來，連接至UpCALL2中相應位點，得到質粒pCALL2-tlB。 PCR產物回收、DNA片段回收、質粒抽提按博大泰克說明書操作，酶切與連接按NEB酶的操作說明進行。
轉基因質粒pCALL2-tlB構建完成后，其共包含7個關鍵部分能夠驅動基因廣泛表達的強啟動子CAG， loxP序列，iSgeo基因的編碼框，3XpolyA(終止子)，與前一個loxP同向的loxP序列，基因tIB，兔/3球蛋白polyA，共9.5kb，其結構如圖2所示。測序表明完全正確。pCALL2-tlB質粒的全長序列如SEQ IDNO: 1所示。
基于與前述類似的方法，本發明人還構建了攜帶Bax-IRES-tBid(BIt)的pCALL2-BIt質粒，該質粒中Bax和tBid的串聯方式不同于pCALL2-tlB質粒。
本發明人同時還構建含有IRES-EGFP(IE)的質粒，以及基于單獨的凋亡基因構建分別含有Bax-IRES-EGFP(BIE)和tBid-IRES-EGFP(tIE)的質粒。具體的
15構建方法如下
對于pCALL2-BIt，用ATco/和^ of將tBid從pMD18T-tBid中切下來，連接到pET28a-IRES相應位點，得到pET28a-IRES-tBid;再用^8g/ //和ZAo /將Bax從pMD18T-Bax中切下來，連接至lJpET28a-IRES-tBid的5g/ //和<&/ /之間，得到pET28a-Bax-IRES-tBid，簡稱pET28a-BIt。接下來用5《///和^0 r將BIt切下來，連接到pCALL2中相應位點，得到質粒pCALL2-BIt。
對于pCALL2-tlE，用5《///和^0/將{81(1從？]^018丁-181€1中切下來，連接到口11^82-￡0 載體中5《///和5^/之間，得到ptBid-IRES-EGFP，簡稱ptIE,然后用^^///和^0^將《￡切下來，連接到pCALL2相應的位點，即得至IJpCALL2-tlE。
對于pCALL2-BIE，用5§///和^%0/)|每8&乂從？^/1018丁-8&義中切下來，連接到pIRES2-EGFP載體中^g///和5^//之間，得至廿pBax-IRES-EGFP，簡稱pBIE，然后用Sg/ //和7Vw /將BIE切下來，連接到pCALL2相應的位點，即得到pCALL2-BIE。
對于pCALL2-IE,則直接用5g///和AWT將IRES-EGFP從pIRES2-EGFP中切下來，連接到pCALL2相應的位點，得到pCALL2-IE。
將這些質粒分別與pAlbCreSVPA共轉入LEPC中，通過觀察死亡細胞懸浮來檢測細胞的凋亡情況。結果發現，pCALL2-tlB促凋亡的能力顯著比pCALL2-BIt強；同時表達兩個凋亡基因的比表達一個基因的促凋亡能力強；表達凋亡基因的比不表達凋亡基因的促凋亡能力強，如圖3所示。pCALL2-tlB質粒的全序列如SEQIDNO: l所示，共11323bp。
因此，本發明人選用了pCALL2-tlB質粒，將其線性化，注射到小鼠受精卵中，制備了tIB轉基因小鼠，用于條件誘導組織細胞凋亡。
實施例3.受精卵顯微注射和轉基因小鼠鑒定
用/和S/ /將前述構建的質粒pCALL2-tlB切開，回收包含上述7個元件的9.5kb的條帶，去除無關片段，最后將該片段稀釋至2-5ng/pL，按常規進行受精卵顯微注射。然后將接受DNA的受精卵移植到受體假孕母鼠輸卵管內，使之繼續發育，最后分娩獲得子代小鼠。
通過PCR的方法對出生的后代作基因型鑒定，取出生后約30天的小鼠0.5-lcm尾尖置于1.5mL離心管中，加入組織裂解液[50^L 10% SDS，
1610)wL20mg/mL蛋白酶K， 200juL NLB(10mM Tris-HCl， pH8.2; 400mMNaCl;lmM EDTA， pH8.0)]于55。C過夜裂解。向裂解完全的樣品中加入飽和NaCl，顛倒混勻，8000rpm于4。C離心15min。上清與200/xL異丙醇混合，室溫13200rpm離心15min，沉淀用70%乙醇洗滌一次，風干，最后用lOO^L的
TE溶解。
基因型鑒定的引物如下
紐al-F (SEQ ID NO: 10):
5，-GTGACGTCTCGTTGCTGCATAAAC-3，；
/3gal-F (SEQ ID NO: 11):
5 ， -C ACGGCGTTAAAGTTGTTCTGCT-3 ，；
Bax-F (SEQ ID NO: 12):
5 ， -G AGGTT AAA A A A ACGTCT AGGCCC-3 ，；
Bax-R (SEQ ID NO: 13):
5，-TTTGGCAGAGGGAAAAAGATCG-3，；
CD34 enh-F (SEQ ID NO: 14):
5 ，-ACGCGTGAGTGGTCTGGATCCAAACTGAGTG-3';CD34 enh-R (SEQ ID NO: 15):
5 ，-AAGCTTAGCTATAATGCAACCAGAATATAAAGCAT-3'。
PCR擴增條件分別如下
iSgal:首先94°C， 2min;然后94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 30s;進行28個循環；最后72X:， 10min。
Bax:首先94°C， 2min;然后94°C， 30s; 57°C， 30s; 72°C， 35s;進行28個循環；最后72卩，10min。
CD34 enhancer:首先94。C， 2min;然后94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C，50s;進行28個循環；最后72。C， 10min。
結果，共得到11個轉基因首建者(FO代)，初步鑒定它們的基因組上有整合的陽性小鼠。將這些首建者小鼠分別與野生型小鼠交配，后代Fl攜帶轉基因(圖4)。
17實施例4.轉基因小鼠肝臟表達RT-PCR檢測
11個首建者小鼠分別與野生型小鼠交配建系。繼續通過PCR的方法鑒定 基因組上攜帶轉基因的Fl代小鼠。
選取其中7個首建者后代，加上野生型的陰性對照和Rosa26-紐al陽性對 照共9只小鼠，取其肝臟，液氮速凍小鼠新鮮肝臟，研磨成粉末，立即用Trizol 裂解細胞RNA的提取，RNA的提取，RT-PCR過程按照Invitrogen相應的說明 書進行。同時取其尾尖用于抽基因組DNA。紐al的擴增與前相同。
9個小鼠品系肝臟組織RT-PCR結果如圖5所示，RT-PCR結果顯示其中 兩個首建者后代有轉基因的表達，分別是首建者F41的161號和首建者F42的 168號后代。
實施例5. X-gal檢測組織轉基因表達
取經過RT-PCR表明轉基因有表達的首建者后代(F42的后代250號)，對 其肝臟、腎臟和小腸進行X-gal染色。將器官置于固定液中(1%甲醛，0.2%戊 二醛，0.02。/。NP-40于PBS中)4。C固定4小時，然后用PBS室溫洗滌2次，每 次20分鐘，接著將器官至于染色液中(5mM亞鐵氰化鉀，5mM鐵氰化鉀，0.0P/。 過氧膽酸鈉，0.02% NP-40， 2mM氯化鎂，lmg/mL X-gal于PBS中)，室溫染 色過夜。
X-gal染色結果見圖6，可以看到這些器官都有轉基因的表達，因此可以確 定該轉基因小鼠有轉基因的正常表達，本發明人將該小鼠稱為tIB小鼠，能夠 用于后續實驗。
實施例6.肝臟特異表達的可誘導Cre酶小鼠的構建
對于在肝臟里面特異表達的可誘導Cre酶小鼠的構建，用1/ 0/和4/7//將 pIRES2-EGFP(Clontech)和pcDNA3.1/Hygro(-)(Invitrogen)切開，并將前者中約 1.6kb含polyA的片段插入后者中，得至UpcDNA3.1-SVPA/Hygro(-)。接著，用 M/w /和Z/w /將Alb啟動子從pGEMAlbSVPA (參見Goshi Shiota等，1990， Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 5940-5944. 89: 373-377)中切下來，插入 pcDNA3.1 -SVPA/Hygro(-)中相應的位點，得到pAlb(Old)-SVPA/Hygro(-)。為 了將Alb啟動子后面的ATG去掉，用常規PCR的方法，擴增啟動子最后0.5kb片斷，？01產物用3 附///和^/^/酶切后，替換掉pAlb(01d)-SVPA/Hygro(-)中相應片斷，得至UpAlbSVPA/Hygro(-)。然后，用常規PCR的方法從pANMerCreMer(Zhang等，1996; Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stemcells. Nucleic Acids Research. 24: 543-548)中將Cre的序列擴增出來(以Cre Fl和CreR作為引物)，連接到pMD-18T simple vector中，測序正確之后，用^7 o/和iVo, /將Cre連接到pAlb-SVPA/Hygro(-)中相應位點，得到pAlbCreSVPA。用Ac/和&c/將CreER從pBS-CreLBD (購自中國科學院上海模式動物中心)切下來，在相同的位點把pAlbCreSVPA中的Cre替換下來，得到pAlbCreERSVPA。
此外，本發明人還構建了pAlbMerCreMerSVPA，用PCR的方法將Cre從pANMerCreMer中擴增出來(以Cre F2和Cre R作為引物)，連接到pMD-18T simplevector,得到T-Cre。接下來，將pANMerCreMer用&c/酶切，回收4.4kb的片段，然后將這4.4kb的片段用A^o/部分酶切的方法酶切，回收約3kb的片段，并將其插入T-Cre相應位點，得到T-MerCreMer。用Ac/和Sac/將MerCreMer從T-MerCreMer切下來，在相同位點替換掉pAlbCreSVPA中的Cre，得到pAlbMerCreMerS VPA 。
由于pAlbCreERSVPA和pAlbMerCreMerSVPA中都含有可誘導的Cre ，本發明人比較了一下CreER和MerCreMer，看哪一個在沒有誘導的條件下本底活性低，而經受誘導的效率更高。
本發明人將pAlbCreERSVPA和pAlbMerCreMerSVPA分別和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共轉入肝癌細胞系Hepal-6 (購自中科院生化細胞所細胞庫)中，轉染24小時后，分別用lpM的4-OHT誘導。從綠色熒光表達來看，在沒有誘導的情況下，MerCreMer活性關閉的更嚴，而用4-OHT誘導后，MerCreMer誘導效率更高，見圖7和圖8。因此本發明人選擇了p AlbMerCreMerS VP A質粒去制備轉基因小鼠。
引物序列
CreFl (SEQ ID NO: 16):
TATACTCGAGGCGCGCCACCATGCCCAAGAAGAAGAGGCreF2 (SEQ ID NO: 17):
TATACTCGAGGCGCGCCACCATGGCCAAGAAGAAGAGGCreR(SEQ ID NO: 18):
19ATATGCGGCCGCGAGCTCTAATCGCCATCTTCCAGCAGG AlbproF(SEQ ID NO: 19): ATATGGATCCATGGGGTTGATTTGGATGTAG Alb proR(SEQ ID NO: 20): CAGTCTCGAGGGAAAGGTGATCTGTGTGCA
PCR擴增條件分別如下
Cre:首先，94°C， 2min;然后，94°C， 30s; 55°C， 30s; 72°C， lmin; 20 個循環；最后，72°C， lOmin。
Alb啟動子首先，94°C， 2min，然后，94°C， 30s; 55°C， 30s; 72°C， 30s; 20個循環；最后，72°C, lOmin。
pC AG-loxP-mRFP-loxP-EGFP的構建方法如下
用常規PCR的方法從pDB587 (參見M. Fischer et al.， 2004, A brilliant monomelic red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictyostelium. FEBS Letters. 577: 227—232)中將mRFP擴增出來，PCR產物用C7" /和Sc/ /酶切，并替換掉pCALL2的C/fl /和/之間的序列，得到 pCAG-loxP-mRFP-loxP。然后用5aw H/和A^ f將pEGFP-N2中的EGFP序列切下 來，并插入pCAG-loxP-mRFP-loxP中5g/ //禾卩M f /之間，得到 pCAG-loxP-mRFP-loxP國EGFP 。
引物序列
mRFPF (SEQ ID NO: 21): ATCGATACCATGGCCAGCTCCGAG mRFP R (SEQ ID NO: 22): TGATCATTAGCTTCCAGCGCCTGTGC
PCR擴增條件如下
首先，94°C， 2min;然后，94°C, 30s; 55°C， 30s; 72°C， 45s; 20個循環; 最后，72°C， lOmin。
本發明人將pAlbMerCreMerSVPA用M/" /和尸me /切開，回收含有Alb啟動 子，MerCreMer基因和SV40polyA的6.1kb的片段，用于對受精卵進行原核注射。將注射后的受精卵移植到假孕母鼠的子宮內，以完成胚胎發育。F0代小鼠出生
后一個月，抽鼠尾DNA進行基因組鑒定，選擇基因組上整合了片段的陽性小鼠。
鑒定所用的引物序列如下
Alb Enh/Pro GT-F (SEQ ID NO: 23):
GCTGATGCAGAGTGAAGAGTGTGTGA;
Alb Enh/Pro GT-R (SEQ ID NO: 24):
GGCATGGAAGCATGCCACATT;
Cre GT-F (SEQ ID NO: 25):
GAGC ATACCTGGAAAATGCTTCTGT;
Cre GT-R (SEQ ID NO: 26):
CCC AGGCTAAGTGCCTTCTCTAC A;
CD34 enh-F (SEQ ID NO: 14):
5 ， - ACGCGTG AGTGGTCTGG ATCC AAACTG AGTG-3 ，； CD34 enh-R (SEQ ID NO: 15):
5' - A AGCTT AGCT AT A ATGC A ACC AGAAT ATAA AGC AT-3'。
PCR擴增條件如下
AlbEnh/Pro， 94°C， 2min; 94°C， 30s; 59°C， 30s; 72°C， 30s; 35個循環; 72°C， 10min。 Cre， 94。C， 2min; 94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 30s; 28個循 環；72°C， lOmin。
CD34 enhancer, 94°C ， 2min; 94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 50s; 28個 循環；72。C， lOmin。
結果如圖9，結果共得到7個陽性首建系(F0代)。
接下來，將7個首建系分別與C57野生型小鼠雜交，獲得了F1代小鼠。在F1 代小鼠中，通過抽鼠尾DNA鑒定基因組整合為陽性的子代。
選擇陽性的子代小鼠，通過Western blot和RT-PCR的方法，選擇表達水平 較高的首建系，培育出純合的MerCreMer轉基因小鼠，稱為MCM小鼠，與前述 制備的純合的tIB小鼠雜交，以得到雙轉基因小鼠MCM/tlB。
6-8周左右的MCM/tlB小鼠通過腹部注射4-OHT， lmg/天，連續注射5天。 從第6天開始連續取5天肝組織，通過TUNEL檢測肝臟發生凋亡的情況。確 定時空可調地誘導肝臟細胞凋亡，有效地引發了肝損傷。本發明人從所得到的小鼠的肝中提取肝細胞，該種肝細胞的基因組中含有
MerCreMer構建物以及tIB構建物，該細胞可體外培養和繁殖。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，
本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權利要求書所限定的范圍。序列表
<liO〉中國科學院上海生命科學研究院
〈120>轉基因構建物及其在制備時空可調性肝臟損傷模型中的應用
<130> 085115
<160> 26
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 11323
<212〉 靈
<213> 人工序列
<221> 邁isc—feature
〈223> 重組^體
<柳> 1
gtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60
gccc3tatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120
ccaacgscccccgcccattgacgtc肌taatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180
ggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacUggcagtac240
atcaeigtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300
CCtggC3tt3tgcccagtacatgaccttatggg&ctttcctacttggcagtacatctacg360
tattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctcccc420
atctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgca480
gcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcg540
gggcggggcgaggcgg柳ggtgcggcggcagcc33tcagagcggcgcgctccgaaagtt600
tccttttatggcgaggcggcggcggcggcggCCCt3t犯333gCg33gCgcgcggcgggc660
gggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgcc720
ccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctcc780
gggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttctUtctgtggctgcgtga犯g840
ccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcg900
tgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctg960
cgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggc1020
ggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggctgcgtgcggggtgtgtgcg1080
tgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcaccccU40
cctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggc1200
gcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcgggg1260
ccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggct1320
gtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagg1380
gacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctc1440
tagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggsgggcctt1500
cgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcaggggg1560
acggctgccttcgggggggacggggcsgggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcgi620
gctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggca1680
scgtgctggttsttgtgctgtctcatcattattcctcgat1740
aeitaacttcgtatagcatac3ttatacgsagttatattaagggttccgcaagcttcctag1800
actagtcgacggtatcgata3gC3gCttg3tgatctgtgacatggcggatcccgtcgttt1860
tacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatc1920
cccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagt1980
tgcgcagcctgaatggcgastggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccgg2040
aaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggc2100
agatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatc2160
cgccgtttgttcccacggag犯tccgacgggttgttactcgctcacattt3atgttgatg2220
aaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttc2280
atctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaat2340
ttgacctgagcgcatttttacgcgccggaga犯accgcctCgCggtg3tggtgctgcgtt2400
ggagtgscggcagttatctgggi柳tceiggatatgtggcggatgagcggcattttccgtg2460
acgtctcgttgctgcatasaccg￡ict￡icacaaatcagcgatttccatgttgccactcgct2520
ttaatgatgatttcagccgcgctgtactgg3ggCtg33gttcagatgtgcggcgagttgc2580
gtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggca2640
ccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgsgcgtggtggttatgccgatcgcgtcacac2700
tacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtg2760
cggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcag肌gcctgcgatgtcg2820
gtttccgcgaggtgcggattgaa犯tggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctga2880
23ttcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcaga2940
cgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtg cgctgttcgc3000
attatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctg tatgtggtgg3060
atgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatga^atcgtctgaccgstgatccgc3120
gctggctaccggcgatgagcg犯cgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacc3180
cgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgc3240
tgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggag3300
ccgacaccacggccaccgatatt3tttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagc3360
ccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgc3420
gcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgatgggtaacagtcttggcggtttcgcta3480
wtactggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactggg3540
tggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttaicggcggtg3600
attttggcgatacgccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgacc3660
gcacgccgcatccagcgctgacggaagc犯gC3gUUtccagttccgtt3720
tatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgBt犯Cg3gC3780
tcctgcactggS"tggtggCgctggatggt3agccgctggcgtgcctctgg3840
atgtcgctcccagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcg3900
ccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgcaaccg犯cgcgaccgcatggtcagaag3960
ccgggcacatC3gCgCCtggC3gC3gtggCgtctggcggagtgacgctcc4020
ccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagc4080
gcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctUcacagatgtggattg4140
gcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggata4200
acgacattggcgtaagtg犯gcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctgga4260
aggcggcgggccattaccaggccg犯gcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttg4320
ctgatgcggtgctgattacgaccgctcacgcgtggcagcatc3gggga^3accttattta4380
tcagccggaaaacctaccggattgatggtagtggtcaaatggcgsttaccgttgatgttg4440
aagtggcgagcgatacaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcagg4500
tagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgcctta4560
ctgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtct4620
tcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattg認Uatggcccacaccagt4680
ggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaacca4740
gccatcgccatctgctgcacgcgg犯gaaggcacatggctgaatatcgacggtttccata4800
tggggattggtggcgacgactcctggagcccgtcagtatcggcgga3ttccagctgagcg4860
ccggtcgctaccattacc3gttggtctggtgtcaggggatcccccgggct4920
agatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtgg3gaggctattcg柳O
gctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgUccggctgtcag5040
cgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgc5100
aggscgaggcagcgcggct3tcgtggctggCC3Cg3Cgggcgttccttgcgcsgctgtgc5160
tcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcagg5220
atctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgc5280
ggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgca5340
tcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacg犯g5400
agcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacg5460
gcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaa犯tg5520
gccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggaca5580
tagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcc5640
tcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttg5700
acgagttcttctgaggggatcaattctctaggcttgggatctttgtgaaggaaccttact5760
tctgtggtgtgacataattggaca犯ct3Cctacagagatttaaagctctaaggtaaatei5820
taaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttaga5880
ttcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcatas5940
tcagccataccacatttgt3gaggttttacttgctttaaaaaacctccceicacctccccc6000
tgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgc3gcttat36060
atggttacaaataaagcaatatttceic^ataaagcatttttttcactgc6120
attctagttgtgtttgtccaaactcatc犯tgtatcttatcatgtctggatcataatcag6函
tttgtEigaggttttacttgccttccccacacctccccctg6240
gC33ttgttgttgttaacttgttt3ttgC3gcttataatg6300
gttaca犯ta犯gcwtagcatcaca犯tttcacaaataaagcatttttttcactgcatt6360
ctagttgtggtUgtcc貼actcatcaatgtatcttatcatgtctggatcataatcagcc6420
ataccacatttgt柳ggttttacttgctttaaaaaacctcccacficctccccctgaacc6480
aatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttat犯tggtt6540
acaaataaagcaatagcatcacaaatttcaca^ta犯gcatttttttcactgcattcta6600
gttgtggtttgtccaaactc3tC肌tgtEltcttatcatgtctggatccactagttctagc6660
tagtctaggtcgatgcaggataacttcgtatagcatacattatacgaagttatagatcta6720
ccatgggcagccaggccagccgctccttcaacc站ggaagaatagagccagattctga犯6780
aatcatccac3acattgccagacatctcgcccaaat3ggcgatgagatgg6840
acceic33C3tccagcccacactggtgagacagctagccgcacagttcatgaatggcagcc6900
tgtcggagga貼ctgcctggccaaagcccttgatgaggtgaagacagcct6960
tccccEigagacEitggagaacgacaaggccatgctgataatgaccatgctgttggcca犯a7020tcacgcaccatctttgctccgtgatgtcttccacacgactgtcaacttta7080
ttaaccagaacctattctcctatgtgaggaacttggttag犯3cgagatggactgactcg7140
acggtaccgcgggcccgggatccgcccctc"tccctcccccccccctaacgttactggccg7200
aagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgcc7260
gtcttttggcCCCgg333CCtggccctgtcttcttgacg3gcattcctag7320
gggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagt7380
tcctctggaagcttcttgaagaca犯caacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcgg認7440
ccccccacctggcgacaggtgcctctgcggcgtgtataagatacacctgc7500
a犯ggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtc犯atg7560
gctctcctcaagcgtattcascaaggggctgaaggatgcccagaeiggtaccccattgtat7620
gggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcga7680
acgtctsggccccccg犯ccacggggacgtggttttcctttgaaaaacac7740
tggccacaaccatggacgggtccggggagcagcttgggagcggcgggcccaccagctctg7800
認cagatcatg3柳C3ggggcctttttgctacagggtttcatccaggatcgeigcaggga7860
ggatggctggggagacacctgagctgaccttggagcagccgccccaggatgcgtccacca7920
agaagctgagcgagtgtctccggcgaattggagatgaactggacagcaatatggagctgc7980
,gga_tg3ttgctgacgtggacacggactccccccgagaggtcttcttccgggtggcag8040
ctgac￡itgtttgctgatggcaacttc肌ctggggccgcgtggttgccctcttctactttg8100
ctagcaaactggtgctcaaggccctgtgcactaaagtgcccgagctgatcagaaccatca8160
tgggctggscactggacttcctccgtgagcggctgcttgtctggatccaag3ccagggtg8220
gctgggaaggcctcctctcctacttcgggacccccacatggcagacagtg&ccatctttg8280
tggctggagtcctcaccgcctcgctcaccatctgga&gaagatgggctgactcgaggcgg8340
ccgcgatctttttccctctgtggggacatcatgaagccccttgagcatct8400
gacttctggcaatttattttcattgcaatagtgtgttgg3attttUgtg8460
tctctcactcggaaggacatettggg站ggcaaatcatttaatgagtattt8520
ggtttagagtttggcaacatatgccatatgctggctgccatgaacaaaggtggctataaa8580
gaggtcatcagt3tatg犯acagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagcct8640
tgacttgaggttagatttttUtatattttgmtgtgttatttttttctttaacatccc8700
taaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccag8760
tcatagctgtccctcttctcttatgaagatccctcgacctgcagcccaagcttggcgtaa8820
tcatggtcatagctgtttcctgtgtgsaattgttatccgctcacaattcc8880
CgElgCCgg犯gcataaagtgtaaagcctggggtgcctemtgagtgagctaactcac3tta8940
attgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagcgg3tccgc9000
atctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactc9060
cgcccagttccgcccattctccgccccatggctgact犯ttttttttatttatgcagagg9120
ccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcc9180
taggcttttgcaaaaagctaacttgtttattgcagcttataatggttaca犯tsaagcaa9240
tagcatcacaaatttcacaatttttcactgcattctagttgtggtttgtc9300
caaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatccgctgcattaatgaatcggcc犯cgc9360
gcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgEictcgctg9420
cgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggtta9480
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aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgag9600
atcgacgctcaagtcagaggtggcga犯cccgacaggactataaagatac9660
caggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttacc9720
ggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgt9780
aggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctCC33gCtgggctgtgtgcaCg33CCCCCC9840
gttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgeigtcc犯cccggtaaga9900
cacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgagg"Utg"U9960
ggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagta10020
tttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaa犯柳gttggtagctcttga10080
tccggcaaactggtagcggtggtmutgtttgcaagcagcagattacg10140
cgcagaaaaa犯gg3tCtC3agaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcag10200
tggaacgaaaactcacgtta3gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacc10260
tagatcctttatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaeiact10320
tggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctattt10380
cgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggctta10440
ccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagattta10500
tcagcwtaaaccagccagcCgg33gggCCgagcgcagaagtggtcctgcaactttatcc10560
gcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaat10620
agtttgcgc3acgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggt10680
tcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttg10740
tgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaeigttggccgca10800
gtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgta10860
agatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgsgaatagtgtatgcgg10920
cgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatsccgcgccacatagc郎犯ct10980
ttaaaagtgctcatcattgg犯aacgttcttcggggcgM犯ctctcaaggatcttaccg11040
ctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatctttt11100
actttcaccagcgUtctgggtgagC￡l￡l￡l3ac3gg犯ggcaaaatgccgca貼犯aggga11160
25ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaeita ttattgaagc 11220 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaata犯 11280 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctg 11323
<210〉2
<211>38
<212>隨
〈213>人工序列
<221>misc feature
<223>引物
<400>2
ctctgaattc ccatggattt<210>3
<2ii〉34
<212>醒
<213>人工序列
<221>邁isc feature
〈223>引物
<400>3
gcacctcgag ttagggaggg<210>4
<211>30
〈212〉隱
<213>人工序列
〈221〉misc feature
<223>引物
<備〉4
gcaggaattc ccatggacgg<210>5
<21i>33
<212>腿
<213>人工序列
<221>misc feature
<223>引物
<400>5
gtggctcgag tcagcccatc<210>6
<211>31
〈212〉隱
<213>人工序列
〈221>misc feature
<223〉引物
〈400>6
atatgaattc gcatgggcag<210〉
<2U>35
〈212>腿
<213>人工序列
<221>misc feature
〈223>引物""
<■>7
38
aagaagagct tctt
34
30
33
ccaggccagc c
31
gcgcctcgag tcagtccatc tcgtttctaa ccaag <210> 8
35<211〉 29
<212> DNA 〈213>人工序列
<221〉 misc_feature
〈223〉 引物
〈柳> 8
atatagatct accatgggca gccaggcca
<210〉 9
〈211> 28
<212> 廳
<213〉 人工序列
〈221> misc—feature
<223> 引物
<400〉 9
atatagatct accatggacg ggtccggg
<210> 10
<211> 24
<212〉 腿
〈213〉 人工序列
<221> misc一featu:re
<223> 引物
〈400〉 10
gtgacgtctc gttgctgcat aaac
<210> 11
<211〉 23
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<221〉 misc_feature <223> 引物
<400〉 11
cacggcgtta aagttgttct get
23
<210〉 12
〈211〉 24
〈212〉 醒
<213〉 人工序列
<221〉 misc—feature
<223> 引物
<400〉 12
gaggttaa犯a^cgtcteig gccc
24
<210> 13
〈2H〉 22
<212> 腿
<213〉 人工序列
〈221〉 misc—feature
<223> 引物
〈400> 13
tttggcagag ggaa犯,t cg
22
〈210〉 14 <211> 31 <212> 眺〈213> 人工序列
〈221〉 <223>
misc—feature 引物
<400〉 14
acgcgtgagt ggtctggatc caaactgagt g
31
<210> <2U> <212> <213>
15 35 醒
人工序列
<221〉 misc_feature <223〉 引物
<400> 15
aagcttagct ataatgcaac cagaat&taa agcat
35
<210〉 〈211〉 <212〉 <213>
16 38 DNA
人工序列
〈221〉 misc—feature 〈223〉 引物
<400> 16
tatactcgag gcgcgccacc atgcccaaga
38
<210> <211〉 〈212〉 <213>
17 38 醒
人工序列
<221〉 raisc_feature <223〉 引物
<400〉 17
tatactcgag gcgcgccacc atggccaaga agaagagg
38
<210〉 〈211〉 <212> <213〉
18 39 DNA
人工序列
<221> misc—feature <223〉 引物
<柳> 18
atatgcggcc gcgagctcta atcgccatct tccagcagg
39
<210〉 <211> 〈212〉 <213〉
19 31 DNA
人工序列
<221〉 misc_feature <223> 引物
<■〉 19
atatggatcc atggggttga tttggatgta g
31
〈210> 20
〈21》 30
<212> 薩
<213〉 人工序列
<221〉 misc—feature
2824
200810200207. 8
<223> 引物
〈400〉 20 cagtctcgag
ggaaaggtga tctgtgtgca
〈210〉 <211〉 <212> <213>
2i 24 腿
人工序列
<221> misc—feature <223> 引物
<權〉21
atcgatacca tggccagctc cgag
<210> <211〉 〈212〉 <213〉
22 26 腿
人工序列
<221>inisc feature
<223>引物
〈400>22
tgatcattag cttccagcgc<210〉23
<211>26
<212>瞧
<213〉人工序列
〈221〉misc feature
〈223〉引物
<400〉23
gctgatgcag agtgaagagt<210>24
<211〉
〈212〉鵬
<213〉人工序列
〈221〉misc feature
〈223>引物
<400〉24
ggcatggaag catgccacat〈210〉25
<211〉25
<212>隱
<213>人工序列
<221〉misc feature
<223>引物
<400〉25
gagcatacct ggaaaatgct〈210>26
<211〉24
<212>瞧
<213>人工序列
<221>misc feature
<223>引物
〈400>26
26
26
21
25
cccaggctaa gtgccttctc taca
2權利要求
1.一種用于制備時空可調性肝臟損傷模型的構建物組合，其特征在于，其包括(1)構建物1，從5’至3’依次包括以下可操作性相連的元件啟動子，LoxP序列，報告基因序列，終止子1，LoxP序列，tBid基因序列，Bax基因序列，終止子2；和(2)構建物2，從5’至3’依次包括以下可操作性相連的元件啟動子，突變型雌激素受體配體結合結構域基因序列，Cre重組酶基因序列，和終止子；其中所述的突變型雌激素受體配體結合結構域可被雌激素類似物激活進而激活Cre重組酶活性，不被動物體內雌激素激活。
2. 如權利要求l所述的構建物，其特征在于，構建物1中，所述的報告基 因是/3-半乳糖苷酶基因。
3. 如權利要求l所述的構建物，其特征在于，構建物1中，所述的啟動子 是CAG啟動子；或構建物2中，所述的啟動子是白蛋白啟動子。
4. 如權利要求1所述的構建物，其特征在于，構建物2中，在所述的Cre 重組酶基因和終止子之間，還含有一突變型雌激素受體配體結合結構域基因序 列。
5. 如權利要求1所述的構建物，其特征在于，構建物1中，所述的tBid 基因和Bax基因之間，還含有內部核糖體插入位點序列。
6. —種細胞，其特征在于，所述的細胞的基因組中整合有權利要求l-5任一所述的構建物組合。
7. 如權利要求6所述的細胞，其特征在于，所述的細胞是肝細胞。
8. —種制備轉基因非人哺乳動物受精卵的方法，所述的受精卵用于制備時 空可調性肝臟損傷模型，其特征在于，所述方法包括將權利要求1所述的構建物1引入非人哺乳動物的受精卵，獲得轉入了所 述構建物1的受精卵；或將權利要求1所述的構建物2引入非人哺乳動物的受精卵，獲得轉入了所 述構建物2的受精卵。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動物是小鼠。
10. —種制備時空可調性肝臟損傷模型的方法，其特征在于，所述方法包括(1)將權利要求1所述的構建物1引入非人哺乳動物的受精卵，將轉入了 所述構建物的受精卵移入假孕非人哺乳動物的輸卵管內，使之繼續發育，生成 基因組中整合有權利要求1所述的構建物1的非人哺乳動物；('2)將權利要求1所述的構建物2引入非人哺乳動物的受精卵，將轉入了 所述構建物的受精卵移入假孕非人哺乳動物的輸卵管內，使之繼續發育，生成 基因組中整合有權利要求1所述的構建物2的非人哺乳動物；和(3)使(1)和(2)獲得的非人哺乳動物進行交配，獲得基因組中整合有權利要 求1所述的構建物1和構建物2的非人哺乳動物。
全文摘要
本發明涉及轉基因構建物及其在制備時空可調性肝臟損傷模型中的應用。本發明公開了一種用于制備時空可調性肝臟損傷模型的構建物組合，包括時空可調性表達肝損傷誘導基因的構建物以及表達Cre重組酶的構建物。本發明還公開了含有所述構建物的細胞。本發明還公開了制備時空可調性肝臟損傷模型的方法，所獲得的動物模型可隨時地、高效地誘導肝損傷，為肝細胞移植、肝臟再殖的研究提供了有效的途徑。
文檔編號C12N15/85GK101684476SQ20081020020
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月22日 優先權日2008年9月22日
發明者欣 王, 曉 胡 申請人:中國科學院上海生命科學研究院