專利名稱：一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法
技術領域：
本發明屬于一種快速篩選香蕉抗枯蔞病的方法。
背景技術：
香蕉作為世界重要水果之一，年產量達10400萬噸(FAO， 2004)。我 國的香蕉生產近年來發展迅猛，到2004年全國栽培面積達26.96萬hm2， 總產量達642萬噸，居全球第五，是我國南方產量最大的水果，香蕉業已 成為我國熱區農業中的支柱產業，但是由于目前香蕉栽培種抗性差，全球 香蕉產業深受枯萎病(又稱巴拿馬病)的危害，其病原菌為古巴尖鐮孢菌 (Fusarium oxysporum f.sp cuberse (E.F.Simth) Snyder .et hansen)， 是一種 具毀滅性的檢疫性病害，特別是該病原菌4號生理小種，能夠浸染所有的 香蕉種類，為毀滅性病害。以廣東為例，1995年報道該病在廣東危害香蕉 栽培種面積約1.4 hm2;而在2002年，發病面積猛增到1.4萬hm2， 2003 年則增加到2.0萬hm2。目前有枯萎病發生的蕉園里第一年發病率為10%， 第二年發病率為20% 30%，第三年發病率達70%以上，遭此危害的蕉田 基本上不能繼續種植香蕉。香蕉感染枯萎病后，當前沒有任何藥劑可以防 治，因此香蕉祜萎病已使得臺灣、廣東等地部分香蕉園毀滅，造成極大的 經濟損失。因此蕉農只有選擇抗枯萎病的香蕉品種進行種植，才能防止香 蕉枯萎病的發生。由于目前還沒有找到一種有效的防治香蕉枯萎病的化學 藥劑，采用種植抗病品種、與水生作物輪作和生物防治是當前防治香蕉枯 萎病比較有效的途徑，但是香蕉試管苗市場管理較為混亂，許多不是抗病 品種被不法商以抗病品種出售，最后造成蕉農經濟損失。而且在沒有水田 的地區，香蕉與水生作物輪作是不可能的。
本發明的目的是提供一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，分別篩選和 制備兩對特異性引物，以待檢測的香蕉植株的基因組DNA為模板，通過 PCR擴增的方法能快速地鑒定出抗香蕉枯萎病植株和易感枯蔞病植株，經過多次實驗結果表明，其檢測的準確率達100%。為蕉農選擇種植抗枯蔞病
香蕉品種進行種植提供了有效的保證。
本發明包括如下步驟
(1) 香蕉基因組DNA的提取
稱取0.5g香蕉根尖或者葉片，加入0.01-0.02克聚乙烯吡咯環酮，快 速在液氮中研磨成粉末狀；將粉末轉入65 'C預熱的4 mL3%CTAB提取液 中(CTAB提取液2% CTAB， lOOmmol L1 Tris漏Cl (pH8.0)， 1.4 mol L" NaCl， 20 mmol I/1 EDTA(pH8.0)， 20/(^巰基乙醇)，同時加入20 pL10 mg mL'1的 蛋白酶K，搖勻后65 t:水浴60min，期間不斷輕輕搖動離心管；冷卻后， 加入l/3體積5molL"的KAc溶液，混勻后冰浴20 mhi;加入等體積的氯 仿/異戊醇(24:l)，混勻后，在4'C條件下12,000 rpm離心10min;上清液 轉移到新的離心管中，向上清液中加入2/3倍體積預冷的異丙醇，充分混 勻，-20°。沉淀111后，在4'C條件下用12,000 rpm離心15min;棄上清， 加入1 mL75。/。乙醇洗滌兩次，4'C， 12,000 rpm離心5 min;棄上清，在通 風櫥中風干沉淀物，加入500 fiLTE緩沖液(含10嗎.mr1的RNase)溶解， 55'C水浴30min;取上層液相，加入2倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA， 在4'C條件下12,000 ipm離心15 min;棄上清，75°/。乙醇洗滌沉淀，在4 'C 條件下12,000 rpm離心15 min，棄上清，置超凈工作臺中倒置于吸水紙上 晾干，DNA干燥后，用50-10(HiL的TE溶解沉淀；用0.8%瓊脂糖凝膠電 泳檢測提取DNA的質量，同時用紫外分光光度計檢測DNA濃度，然后 -20'(:分裝保存備用；
(2) PCR檢測所用兩對引物的序列_
OPU10F 5，-ACCTCGGCACTCGAAGACACAT-3，~~
OPU10R 5，-ACCTCGGCACTATTACCCATCAT-3， OPS09F 5'-TCCTGGTCCCAGTACAAATAC-3， OPS09R 5，-TCCTGGTCCCTCTGAATTTTC-3，
這兩對引物序列設計好以后，由上海生工生物公司進行合成，得到引 物后，用dd水配成10倍的母液，使用時按要求進行使用； (3) PCR擴增反應條件分別利用兩對特異引物OPU10F和OPU10R， OPS09F和OPS09R對抗 病品種'威廉斯芽變'和感病品種'威廉斯'香蕉基因組進行PCR擴增，反應 體系為2.5 pL 10xbuffer， 0.4 jiL25 mmol丄-1 MgCl2, 1.0 |iL 2.5 m mol丄1 dNTP， lULATaqDNA聚合酶，1.0^110fimoW/1引物，20ng模板DNA， 最后加入16 ddH20補足到25 jiL的總反應體積;然后在PCR儀上反應， PCR反應程序為，94'C預變性5 min，然后94'C變性40 S，38 。C退火1 min， 72 。C延伸90 S ,循環35次，72 。C 10 min;取10 PCR反應產物與2 jiL 上樣緩沖液混勻，點入含EB的1.2%瓊脂糖凝膠中，在5Vcm"條件下電 泳1 h后，把瓊脂糖凝膠轉移到FX自動成像系統(BIORAD公司)進行拍照， 從擴增的產物中就可以快速地確定所有檢測的待測株是否能抗香蕉枯萎 病。
本發明以香蕉基因組為模板，用兩對特異引物分別對其基因組進行 PCR擴增，都能從抗病品種中擴增出特異DNA片段，而感病的香蕉品種則 不能擴增出目的片段。這項技術通過一次實驗同時用兩對特異引物分別進 行PCR擴增，擴增結果可以相互驗證，能有效地消除PCR假陽性的現象， 檢測過程快速簡單，結果可靠，從而能快速地鑒定出抗香蕉枯蔞病植株和 感枯蔞病香蕉植株。經過多次實驗結果表明，這種方法對香蕉抗枯萎病的 檢測的準確率達100%。為蕉農選擇抗香蕉枯萎病品種進行提供了可靠的保 證。
圖1是本發明用OPU10F和OPU10R引物對'威廉斯'和'威廉斯芽變'基 因組擴增結果圖2是本發明用OPS09F和OPS09R引物對"威廉斯芽變"和"威廉斯" 基因組擴增結果圖3是本發明利用OPU10F和OPU10R在"金手指"和"威廉斯芽變" 和其它四個感病品種中的擴增結果圖4是本發明OPS09F和OPS09R在四個感病品種、"威廉斯芽變"和"金 手指"中的擴增結果圖5是本發明利用OPU10F和OPU10R對"威廉斯芽變"組培苗檢測 結果圖；圖6是本發明利用OPS09F和OPS09R對"威廉斯芽變"組培苗檢測結 果圖。
具體實施方式
實施例l
分別用OPU10F和OPU10R、 OPS09F和OPS09R兩對引物都能從抗香蕉 枯蔞病品種"威廉斯芽變"4個植株中通過PCR反應，擴增出約為1800bp 的DNA片段，而在感染病品種"威廉斯"4個植株中則無此片段出現如圖l 和圖2所示。說明通過利用引物OPU10F和OPU10R、 OPS09F和OPS09R對香 蕉基因組進行PCR擴增，能夠準確地從香蕉植株中篩選出抗香蕉枯萎病品 種，此目的帶的出現也可作為香蕉抗枯蔞病抗品種 一個重要標記。
圖l.用OPU10F和OPU10R引物對'威廉斯'和'威廉斯芽變'基因組擴 增結果，1,2,3,4是"威廉斯芽變"是抗病品種；5,6，7,8是"威廉斯"是感 病品種。
圖2 .用OPS09F和OPS09R引物對"威廉斯芽變"和"威廉斯"基因 組擴增結果，1,2,3,4是"威廉斯芽變"是抗病品種；5,6,7,8是"威廉斯" 是感病品種。
實施例2
將OPU10F和OPU10R， OPS09F和OPS09R引物用于感病品種
('Cavendish'、'大蜜哈，、'巴西蕉，、'野生蕉，)和抗病品種('金手指
Goldfinger，)進行進一步驗證。結果表明，用OPU10F和OPU10R這一對
引物在抗病品種'金手指'和"威廉斯芽變"中均穩定擴增出大小相同的目
的片段，而感病的4個品種均不能擴增出目的片段如圖3所示；再用
OPS09F和OPS09R在抗病品種'金手指'和"威廉斯芽變"均擴增出目的片
段，但是在金手指中擴增時出現多條泳帶，這是可能是由于退火時溫度過
低導致的錯配現象而造成的如圖4所示。實驗結果表明，分別用兩對引物
相互驗證可以直接應用于香蕉抗病枯萎病品種快速檢測。
圖3利用OPU10F和OPU10R在"金手指"和"威廉斯芽變"和其
它四個感病品種中的擴增結果。
注M是Maricer2000; 1，"金手指"是抗病品種，2，"威廉斯芽變"是
抗病品種；3,4,5,6分別為感病品種("Cavendish"、"大蜜哈"、"巴西蕉"、"野生蕉")
圖4 OPS09F和OPS09R在四個感病品種、"威廉斯芽變"和"金手指" 中的擴增結果。
注M是Marker 2000; 1，2,3,4是四個感病品種("Cavendish"、"大蜜 哈"、"巴西蕉"、"野生蕉");5,6是"威廉斯芽變"和"金手指"。 實施例3
隨機選取本實驗室的40株"威廉斯芽變"組培材料，分別利用OPU10F 和OPU10R， OPS09F和OPS09R引物，對其組培苗是否也能抗香蕉枯萎病 情況進行分析。用兩對引物分別檢測到在40株"威廉斯芽變"幼苗，結果 表明有39株苗都能擴增出目的片段。在組培苗中有一株可能發生了變異， 導致基因組中目的片段的缺失，所以擴增不出目的片段。
同時對這40株組培苗進行接種枯萎病4號生理小種病菌后，再種植在 中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所香蕉園內(廣東湛江)，在香蕉苗 種植后整個生育期間沒有枯萎病的發生。因此從本實驗結果看，利用這兩 對引物進行檢測后再種植，能保證檢測到的香蕉苗抗枯萎病植株不感染枯 蔞病，所以這種快速的檢測方法是切實有效的。
圖5利用OPU10F和OPU10R對"威廉斯芽變"組培苗檢測結果。 注M是Marker 2000; 140是是"威廉斯芽變"組培苗，其中第六個植 株發生了變異，PCR結果為陰性，其他39株均為陽性。
圖6利用OPS09F和OPS09R對"威廉斯芽變"組培苗檢測結果。 注M是Marker 2000; 140是是"威廉斯芽變"組培苗，其中第六個植 株發生了變異，PCR結果為陰性，其他39株均為陽性。
所需要的儀器和藥品在國內的的生物試劑公司均有公幵銷售，能很容易 地從市場上購買到。 .
權利要求
1、一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，其特征是包括如下步驟(1)香蕉基因組DNA的提取稱取0. 5g香蕉根尖或者葉片，加入0.01-0.02克聚乙烯吡咯環酮，快速在液氮中研磨成粉末狀；將粉末轉入65℃預熱的4mL3％CTAB提取液中，同時加入20μL10mg mL-1的蛋白酶K，搖勻后65℃水浴60min，期間不斷輕輕搖動離心管；冷卻后，加入1/3體積5mol L-1的KAc溶液，混勻后冰浴20min；加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻后，在4℃條件下12,000rpm離心10min；上清液轉移到新的離心管中，向上清液中加入2/3倍體積預冷的異丙醇，充分混勻，-20℃沉淀1h后，在4℃條件下用12,000rpm離心15min；棄上清，加入1mL75％乙醇洗滌兩次，4℃，12,000rpm離心5min；棄上清，在通風櫥中風干沉淀物，加入500μLTE緩沖液溶解，55℃水浴30min；取上層液相，加入2倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA，在4℃條件下12,000rpm離心15min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀，在4℃條件下12,000rpm離心15min，棄上清，置超凈工作臺中倒置于吸水紙上晾干，DNA干燥后，用50-100μL的TE溶解沉淀；用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量，同時用紫外分光光度計檢測DNA濃度，然后-20℃分裝保存備用；(2)PCR檢測所用兩對引物的序列這兩對引物序列設計好以后，由上海生工生物公司進行合成，得到引物后，用dd水配成10倍的母液，使用時按要求進行使用；(3)PCR擴增反應條件分別利用兩對特異引物OPU10F和OPU10R，OPS09F和OPS09R對抗病品種‘威廉斯芽變’和感病品種‘威廉斯’香蕉基因組進行PCR擴增，反應體系為2.5μL 10×buffer，0.4μL 25mmol.L-1MgCl2，1.0μL 2.5m mol.L-1dNTP，1U LATaq DNA聚合酶，1.0μL 10μmol·L-1引物，20ng模板DNA，最后加入16μL ddH2O補足到25μL的總反應體積；然后在PCR儀上反應，PCR反應程序為，94℃預變性5min，然后94℃變性40S，38℃退火1min，72℃延伸90S，循環35次，72℃ 10min；取10μL PCR反應產物與2μL上樣緩沖液混勻，點入含EB的1.2％瓊脂糖凝膠中，在5V.cm-1條件下電泳1h后，把瓊脂糖凝膠轉移到FX自動成像系統(BIO-RAD公司)進行拍照，從擴增的產物中就可以快速地確定所有檢測的待測株是否能抗香蕉枯萎病。
2、 據權利要求職所述的一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，其特征是 CTAB提取液2。/。CTAB， lOOmmol L" Tris-Cl ， pH8.0， 1.4 mol L" NaCl， 20 mmol L" EDTA ， pH8.0， 2°/<^巰基乙醇。
3、 據權利要求職所述的一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，其特征是 緩沖液含10叫.mr1的Rnase。
全文摘要
一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，分別制備兩對特異性引物，以待檢測的香蕉植株的基因組DNA為模板，通過PCR擴增的方法能快速地鑒定出抗香蕉枯萎病植株和易感枯萎病植株。本發明以香蕉基因組為模板，用兩對特異引物分別對其基因組進行PCR擴增，都能從抗病品種中擴增出特異DNA片段，而感病的香蕉品種則不能擴增出目的片段。這項技術通過一次實驗同時用兩對特異引物分別進行PCR擴增，擴增結果可以相互驗證，能有效地消除PCR假陽性的現象，檢測過程快速簡單，結果可靠，從而能快速地鑒定出抗香蕉枯萎病植株和感枯萎病香蕉植株。經過多次實驗結果表明，這種方法對香蕉抗枯萎病的檢測的準確率達100％。為蕉農選擇抗香蕉枯萎病品種提供了可靠的保證。
文檔編號C12Q1/68GK101423870SQ20081019842
公開日2009年5月6日 申請日期2008年9月5日 優先權日2008年9月5日
發明者張秀梅, 李偉才, 尉 王, 胡玉林, 莫億偉, 謝江輝, 陳佳瑛 申請人:中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所