專利名稱：：與牛精液品質性狀相關的INHβA基因片段作為分子標記的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于家畜分于標記制備
技術領域：
，具體地說涉及一種與牛精液品質性狀相關INHeA基因片段作為分子標記的應用。
背景技術：
：我國牛品種資源十分豐富，黃牛的存欄量占世界第一位。國家自從1972年籌建種公牛站，投入大量資金從國外引進優秀種公牛生產凍精，在全國范圍內推廣牛的人工授精技術，大規模地釆用牛冷凍精液配種，加快了黃牛改良的步伐。牛的精液冷凍和人工授精是一項早已投入生產的生物技術，在牛的品種改良和生產上發揮著巨大作用，因此,牛的精液品質的好壞直接影響著該技術帶來的經濟效益。研究表明，精液品質不僅受營養和環境因素影響，而且與受公畜本身遺傳因素有關。目前，對種公牛種用價值評定，主要采用后裔測定法，此法周期長，投入大，采用分子標記輔助選擇不失為一條捷徑，此方法可提供種公牛早期選擇和部分替代種公牛后裔測定，從而可以節省大量的時間和成本提高經濟效益。抑制素(Inhibin，INH)是下丘腦-垂體-性腺軸調控系統的重要激素，由a亞基和e亞基兩種形式，其中a亞基分子量為18kD;P亞基分子量為14kD;日亞基有6A和PB兩種形式，其主要作用是通過腦垂體對FSH的合成和分泌進行負反饋調節。姜慶林等(2005)發現抑制素(Inhibin，INH)主要由雌性動物卵巢顆粒細胞和雄性動物睪丸支持細胞分泌。Phillips(2005)報道在人、小鼠、豬、牛、綿羊等多個物種的卵巢、睪丸和子宮等生殖系統中均有表達。Matzuketal.(1995)研究發現PA亞基可能參與早期胚胎的發育和雌性動物的受精過程。Hiendlederetal(1996)發現INHPA基因對綿羊產羔數有顯著影響。薛昱等(2004)提出抑制素基因作為繁殖性能的候選基因。關于精液品質分子標記研究，在人和豬中均有報道。2004年有研究表明人雄激素受體(AR)基因CAG重復長度頻數分布在畸精者和正常者之間有顯著不同。王利權(2006)報道特發性無精子癥患者血清FSH水平和睪丸組織的FSHR表達水平與睪丸精子發生程度之間存在相關性。S.Y.Huang等(2002)把熱休克蛋白70.2基因與豬的精液品質進行關聯分析，表明豬的HSP70.2基因5'端側翼區的單核苷酸多態性和炎熱季節里精液品質性狀是相關的。Lin等(2005)以GnR服，PRL，PRLR，FSH日，LHP，FST，INHA,INHeA和INHPB為候選基因，研究其對豬的精液品質的影響，結果表明GnRHR與精子的活力、畸形率具有相關性；而INH與精子的濃度具有相關性。Linetal(2006)做了P肌動蛋白基因與豬的精液品質和生產性能的關聯分析，結果表明單倍型和精子的運動力、畸形率、胎產活仔數有關。雷雪芹等(2003)對FSHR基因5'端做了標記研究，發現其在一個品種內單胎母牛和雙胎母牛之間有一定趨勢。Kleeffetal(1998)報道人INHeA基因可以作為胰腺癌發生的標記基因。目前，關于抑制素對動物繁殖性能的研究主要集中在母畜上，關于INHeA基因對牛精液品質性狀影響的研究尚未見報道。
發明內容本發明的目的在于通過對牛精液品質性狀INHPA基因片段序列進行多態性分析，為公牛的標記輔助選擇提供一種分子標記。本發明涉及分子標記在牛精液品質性狀關聯分析上的應用，還涉及檢測牛精液品質性狀i朋eA基因片段分子標記的制備方法。本發明通過以下技術方案實現申請人通過分子生物學方法獲得一種作為分子標記的牛7A好^^基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所述。在序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的150bp處有1個C150-T150的堿基替換，導致5Xr/-RFLP多態性。同時設計了檢測牛//\好"^基因片段的堿基突變的引物對，所述的引物對的正向引物為5'-GGTGGTTGTTACTGTTTATC-3，，反向引物為5，-CAGGGTTTCAGAAGTTGG-3，。建立了一種篩選/A好"^基因在牛群體中多態性的方法，其步驟如下1)從牛精液基因組中提取DNA，以牛/yW-Z基因片段核苷酸序列為模板設計引物，進行PCR擴增，PCR產物回收、純化和測序，獲得如序列表SEQIDNO:1所述的核苷酸序列；2)采用PCR-RFLP方法檢測牛基因7T^》^片段C150T的多態性。對本發明更詳細描述參見實施例部分。圖l:是本發明的技術流程圖。圖2:是牛INHeA基因片段序列瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖中瓊脂糖膠濃度為1.2%。泳道l-7:INHPA基因片段PCR擴增產物，長度為288bp;M泳道DNA分子量標記(100bpladder)。圖3:I朋eA基因片段PCR擴增產物StyI酶切電泳圖譜。圖4:牛INHPA基因片段DNA序列測序結果(其中帶有下劃線的序列為引物序列，括號處為突變位點和突變堿基)。具體實施例方式實施例11、牛精液品質性狀INHeA基因部分DNA片段的擴增(1)引物設計以牛INHeA基因組DNA為模版，利用Primer5.0設計特異性引物。引物序列如下所示正向引物5，-GGTGGTTGTTACTGTTTATC-3，，反向引物5'—CAGGGTTTCAGAAGTTGG—3'。該引物擴增長度288bp。(2)PCR反應體系及擴增條件PCR擴增反應體系為20iiL，包括2.5mmol/LdNTP0.5ul，25咖ol/LMgCl21.5u1，引物(10pmol)各l.Oy1，10X反應緩沖液2.0ul，0.2UTaqDNA聚合酶，50ng/n1DNA模板l.Oul，用超純水補足20ul。PCR反應條件為94。C預變性5min，94'C變性45s，53。C退火30s、72°C延伸40s，38個循環，72"延伸10min，最后4'C保存10min。PCR反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)PCR產物回收、純化及測序A、從低熔點瓊脂糖凝膠中回收純化PCR產物按回收試劑盒(購自上海捷瑞生物工程有限公司)說明操作。在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，于55。C溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產物純化試劑盒(購買自Promega公司)純化PCR產物，按照前述試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300pl融化的凝膠中加入lmlResin,混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使漿液通過Minicolumn擠出。再在注射器中加入80%的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5mlEpendorff管中，10，000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個干凈的1.5mlEpendorff管中，加入30ul50u1滅菌水，靜置lmin，10，000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管中。B、序列測定挑取2頭公牛個體樣本的擴增目的片段用于測序。1、PCR-RFLP檢測條件(1)牛INHPA基因部分片段的獲得INHPA基因片段擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示為特異性PCR產物(見圖2)。將PCR產物回收純化測序，結果顯示產物長度為288bp。(2)RFLP方法建立酶切反應總體系為lOyl:StyI內切酶(10U/ul)0.5ul，10X酶切緩沖液1.0u1，PCR產物5.0ul，用超純水補足10ul，37'C水浴鍋消化12h，用2%瓊脂糖凝膠或8%丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型。只出現288bp片段，命名為AA型，出現150bp和138bp兩條帶，命名為BB型，出現150bp、138bp和288bp三條帶，命名為AB型。PCR產物酶切反應體積是10ul,其中IXbuffer1.0"1，PCR產物5y1，限制性內切酶Styl為0.5Pl(5U)，用H20補足10y1，將樣品混勻后離心，37。C水浴12h，用2%瓊脂糖凝膠或8%丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型。在引物擴增產物(圖4)第150位(C150-T150)存在C/T等位突變，該突變導致限制性內切酶StyI酶切位點改變，當該位點為C時存在該酶切位點(150bp)，命名為B等位基因；當該位點為T時不存在該酶切位點(288bp)，命名為A等位基因；這兩個位點可組成3種基因型即AA、AB、BB。實施例2:本發明制備的分子標記在牛精液品質性狀關聯分析上的應用試驗牛群的品種是荷斯坦種公牛群，74個DNA樣品用于基因型檢測。進行關聯分析的精液品質性狀包括頂體完整率、畸形率、采精量、精子密度、原精活力及凍后活力。對牛INHPA基因StyI-RFLP多態性位點基因型檢測結果表明在74個個體中AA基因型有16個，AB基因型有39個，BB基因型有19個個體。各基因型間性狀的最小二乘均值和標準差分析結果見表l，關聯分析結果表明荷斯坦種公牛精液AA純合型個體頂體完整率分別比AB、BB型個體高0.04%、0.42%，差異不顯著；AA純合型個體畸形率分別比AB、BB型個體低0.12%、0.40%,差異不顯著；AB雜合型個體采精量分別比AA、BB型個體多0.23ml、0.62ml，AA與AB差異顯著(P〈0.05)，AA與BB、AB與BB差異極顯著(P〈0.01);AB雜合型個體精子密度分別比M、BB型個體高0.47Xl(f個/ml、0.67X108個/1111，AA與AB基因型差異顯著，AB與BB差異極顯著；AB雜合型個體原精活力分別比AA、BB型個體高0.003、0.032，AA與AB基因型差異不顯著，AB與BB、AA與BB差異極顯著；BB純合型個體精液凍后活力分別比AA、AB型個體高0.04、0.02，AA與AB基因型差異顯著，AB與BB、AA與BB差異極顯著。荷斯坦種公牛個體精液的頂體完整率和畸形率性狀的優勢基因型是AA，其次是AB和BB;采精量、密度和原精活力性狀的基因型AB最高，其次是AA，BB最低；凍后活力性狀的基因型BB最高，其次是AB，AA最低。綜合考慮6個評定牛精液品質的指標，基因型精液品質效應表現為AB>AA>BB,研究結果初步證明A等位基因與荷斯坦種公牛精液品質呈正相關。表1荷斯坦種公牛不同/A^^/4基因型個體精液品質性狀的最小二乘均值性狀基因型最小二乘均值土標準誤AA48.1±0.6a頂體完整率ooAB48.1±0.5aBB47.7±0.6aAA14.6±0.4a畸形率(%)AB14.7±0.3aBB15.0±0.4a采精量(ml)AA6.l土O.lAaAB6.4±0.14Ab6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注同一列中，不同小寫肩標表示差異顯著(p<0.05),不同大寫肩標表示差異極顯著(p<0,01)。〈110〉華中農業大學<120>與牛精液品質性狀相關的INHeA基因片段作為分子標記的應用<130>〈141〉2008-10-29〈腸1<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>288<212〉DNA〈213〉牛(Bostaurus)〈220>〈221〉gene<222〉(1)..(288)〈223>〈220〉〈221>primer一bind〈222〉(272)..(288)〈223〉<220><221〉primer一bind〈222〉(l)..咖〈223>〈220〉<221〉mutation〈222>(150).,(150)〈223〉〈400〉1ggtggUgtt3Ctgttt3tCtttt33g3aa3C333鄉g33g3g3CC3C333gC3gagCt60tcatcacttaactctaaaatgatcatcagctgtagattctgagttgtagggtcctccaga120gatgagaggaaaaggcagctggaaactgctctaggctccgtgaacaggcgtggaggagcc180tgtggtcccctccagtgtgggcacagccaccctgccccgcagagaatgttaacaagctcc240ctgctggtctcccttctgcctccacacaggccaacttctgaaaccctg288權利要求1、一種作為分子標記的牛INHβA基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述，在該序列的150bp處有1個C150-T150的堿基替換，導致StyI-RFLP多態性。2、檢測權利要求1所述的基因片段堿基突變的引物對，所述的引物對的正向引物為5'-GGTGGTTGTTACTGTTTATC-3，，反向引物為5，-CAGGGTTTCAGAAGTTGG-3，。3、一種篩選/A^^4基因在牛群體中多態性的方法，其特征在于按照以下步驟4.1)從牛精液基因組中提取DNA，以牛/A^^4基因片段核苷酸序列為模板設計引物，進行PCR擴增，PCR產物回收、純化和測序，獲得如序列表SEQIDNO:1所述的核苷酸序列；2)采用PCR-RFLP方法檢測牛基因/iW/y^片段C150T的多態性。4、權利要求1所述的牛/A馮W基因片段在牛標記輔助選擇中的應用。全文摘要本發明屬于家畜分子標記制備
技術領域：
，具體涉及一種與牛精液品質性狀相關INHβA(InhibinβA，INHβA)基因片段作為分子標記的應用。本發明的特征是檢測到一個與牛精液品質性狀相關INHβA基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述，在該序列的150bp處有1個C150-T150的堿基替換，導致StyI-RFLP多態性。本發明還公開了上述基因片段多態性的應用，為牛精液品質性狀標記輔助選擇提供了新的分子標記。文檔編號C12N15/12GK101418297SQ20081019744公開日2009年4月29日申請日期2008年10月30日優先權日2008年10月30日發明者于俊娜,張春燕,楊利國,滑國華申請人:華中農業大學