專利名稱：：一種與番茄抗病性狀相關(guān)的分子標記克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于蔬菜抗病分子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與番茄抗病性狀相關(guān)的分子標記克隆及應(yīng)用，為番茄的抗病基因的標記輔助選擇提供一種分子標記。
背景技術(shù)：
：蔬菜作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中占重要地位，也是我國出口創(chuàng)匯的重要作物。蔬菜生產(chǎn)中的病危害日益嚴重，每年因病害可使蔬菜作物減產(chǎn)10%—20%，嚴重時可能導(dǎo)致絕產(chǎn)，因此培育抗病品種是最有效的控制病害發(fā)生的途徑。目前蔬菜功能基因組的研究發(fā)展很快，番茄已經(jīng)啟動了測序工作，一些染色體己經(jīng)測序超過一半，很多控制抗病基因已經(jīng)被克隆。但目前抗病育種選育過程中所使用的分子標記與目標基因存在一定遺傳距離，易發(fā)生重組交換而分離，影響選擇的準確性，且大多數(shù)標記產(chǎn)物需要先進行酶切后才能電泳凝膠分離開來，使用起來很不方便，不利于高通量的篩選。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，制備一種與番茄抗病性狀相關(guān)的分子標記及應(yīng)用，為番茄的抗病基因的標記輔助選擇提供有用的分子標記。本發(fā)明的技術(shù)方案如下申請人制備了3種與番茄抗病性狀相關(guān)的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1,SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所述。在序列表SEQIDNO:1的312bp處有1個A312-G312的堿基突變，在2298bp處有1個G2298-C2298的堿基突變，在2299bp處有1個T2299-G2299的堿基突變，導(dǎo)致序列標簽位點多態(tài)性(STS)。在序列表SEQIDNO:2的3477bp處有1個A3477-G3477的堿基突變，在3516bp處有1個T3516-A3516的堿基突變，在3517bp處有1個G3517-C3517的堿基突變，在3606bp處有1個T3606-C3606的堿基突變，在3692bp處有1個C3692-G3692的堿基突變，在3693bp-3713bp之間有10bp的堿基插入，導(dǎo)致STS多態(tài)性。在序列表SEQIDNO:3的405bp處有1個A405-T405的堿基突變，在485bp處有1個G485-C485的堿基突變，516bp處有1個A516-C516的堿基突變，在517bp處有1個T517-G517的堿基突變，在530bp處有1個G530-A530的堿基突變，在610bp處有1個A610-C610的堿基突變，在672bp處有1個G672-A672的堿基突變，在715bp處有1個T715-C715的堿基突變，在725bp處有1個C725-G725的堿基突變，在806bp處有1個C806-A806的堿基突變，在847bp處有1個A847-G847的堿基突變，在997bp處有1個A997-C997的堿基突變，在H45bp處有1個A1145-G1145的堿基突變，在1171bp處有1個T1171-A1171的堿基突變，在1381bp處有1個A138卜T1381的堿基突變，在1543bp處有1個A1543-C1543的堿基突變，在1075bp-1081bp之間有6bp的堿基缺失，導(dǎo)致STS多態(tài)性。申請人根據(jù)上述SEQIDNO:1，SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的序列特征，分別設(shè)計引物，發(fā)展為STS標記。所述SEQIDNO:1，SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的引物對分別為SEQIDNO:1:正向引物為5'-GCCTCATTCMCTTCCTTCTGG-3'，反向引物為5'-GCCAGTATATMCGGTCTAMC-3'。SEQIDNO:2:正向引物為5'-CCATCTCTCMGGAACTGCGTC-3',反向引物為5'-GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA_3,。SEQIDNO:3:正向引物為C1:5'^GTTCTTATCCTTTAACACCCA-3'，反向引物為C2:5'-TCCCTCCAAATTATTACTTCC-3'。更詳細的技術(shù)方案見《具體實施方式》所述。序列表SEQIDNO:l是Tm-2a(基因登錄號AF536199)分子標記的和核苷酸序列，在312bp處有l(wèi)個A312-G312的堿基突變，在2298bp處有1個G2298-C2298的堿基突變，在2299bp處有1個T2299-G2299的堿基突變。序列表SEQIDNO:2是12(基因登錄號AF118127)分于標記的和核苷酸序列，在3477bp處有1個A3477-G3477的堿基突變，在3516bp處有1個T3516-A3516的堿基突變，在3517bp處有1個G3517-C3517的堿基突變，在3606bp處有1個T3606-C3606的堿基突變，在3692bp處有1個C3692-G3692的堿基突變，在3693bp-3713bp之間有10bp的堿基插入。序列表SEQIDNO:3是Cf-9(基因登錄號AJ002236)分子標記的和核苷酸序列。在405bp處有1個A405-T405的堿基突變，在485bp處有1個G485-C485的堿基突變，516bp處有1個A516-C516的堿基突變，在517bp處有l(wèi)個T517-G517的堿基突變，在530bp處有1個G530-A530的堿基突變，在610bp處有1個A610-C610的堿基突變，在672bp處有1個G672-A672的堿基突變，在715bp處有1個T715-C715的堿基突變，在725bp處有1個C725-G725的堿基突變，在806bp處有1個C806-A806的堿基突變，在847bp處有1個A847-G847的堿基突變，在997bp處有1個A997-C997的堿基突變,在1145bp處有1個Al145-G1145的堿基突變，在U71bp處有1個T1171-A1171的堿基突變，在1381bp處有1個A1381-T1381的堿基突變，在1543bp處有1個A1543-C1543的堿基突變，在1075bp-1081bp之間有6bp的堿基缺失。圖1:J基因及等位序列在翻譯起始之前的intron的比對結(jié)果圖2:T)z-^基因分子標記對單株的檢測。泳道l-6分別為Alll、A114、A53、A115、A113;7泳道為LA1221;CK:空白對照；M:Marker圖3:煙草花葉病毒接種不同番茄植株后的葉部特征。A為A53,B為LA1221。圖4:/^基因分子標記對單株的PCR檢測。l-6分別為A53、AlOl、A112、A114、中蔬五號、中蔬六號；7-8為LA3847、LA4026CK:空白對照M:Marker圖5:必W基因分子標記對單株的檢測。左為LA2819(抗病)右為A53(敏感對照)；M:Marker圖6:根結(jié)線蟲接種番茄植株的特征。A:番茄植株三葉期接種根接線蟲后植株生長勢情況。左為LA2819，右為A53。B:番茄植株三葉期接種根接線蟲后根部特征。左為LA2819，右為A53圖7:Cf-9基因分子標記對單株的檢測。1泳道為Ont7719，2-7泳道分別為Ont7717、Ont7516、V121、Vetomold、Leafmouldresister、Moneymaker:CK:空白對照sM:Marker具體實施例方式實施例l:番茄抗煙草花葉病毒基因化-《標記的創(chuàng)建與應(yīng)用步驟如下(l)根據(jù)文獻上找到7)7/-^基因以及其等位基因to-2的登錄號，r/z-i^基因登錄號為AF536201'等位基因加-2的登錄號為AF536199。(2)經(jīng)過比對軟件分析兩序列后發(fā)現(xiàn)，搜索到SNP位點3處，分別為312A/G;22982299GT/CG。(3)設(shè)計引物并合成。根據(jù)7i-^j基因22982299GT/CG設(shè)計PCR引物，引物3'端與補，并在引物3'端第三位人為的引入錯配。引物序列如下Al:5'-GCCTCATTCAACTTCCTTCTGG-3';A2:5'-GCCAGTATATAACGGTCT嵐C-3'。(4)PCR擴增與電泳檢測。PCR反應(yīng)總體積為25uL，10XPCRBuffer2.5uL,3.0mMMgCl2，0.2mMdNTP，各引物0.2uM,20-50ng模板，Taq酶0.5U。PCR熱循環(huán)程序94°C變性5min，然后94°C45s、59°C45s、72°C1min進行33個循環(huán)，最后72'C延伸8min，結(jié)果用1%瓊脂糖電壓5V/cm條件下電泳30-40min，終結(jié)果用EB染色，凝膠成像系統(tǒng)上顯示(見圖2)。含7頂-^的株系能檢測出469bp的片斷；而不含7i7-,的株系不能檢測到產(chǎn)物。(5)將PCR檢測的植株接種病毒鑒定，在兩片真葉期摩擦接種煙草花葉病毒(邵碧英等，煙草花葉病毒弱毒株的篩選及其交互保護作用，福建農(nóng)業(yè)大學學報，2001，30(3):297-303)，兩周后調(diào)査發(fā)病情況，確認&-/分子標記的正確性(見圖3)。實施例2:番茄抗枯萎病基因/-2標記的創(chuàng)建與應(yīng)用步驟如下(1)在文獻上找到/^基因以及其等位基因信息，/^基因登錄號為AF118127,/-^的等位基因/-i"序列僅知道291bp長的片斷，(2)通過比對軟件分析1-2與等位基因部分序列，搜索到5個SNP位點和1個插入突變位點，分別為3477A/G、35163517TG/AC、3606T/C、3692C/G、3693-3713位插入10個堿基。(3)設(shè)計引物并合成，根據(jù)2'-2基因缺失序列兩端來設(shè)計引物，其中等位基因特異引物與I-2基因互補，引物序列如下Bl:5'-CCATCTCTCAAGGMCTGCGTC-3';B2:5'-GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA-3'。(4)PCR擴增與電泳檢測PCR反應(yīng)總體積為25uL,10XPCRBuffer2.5uL，3.0raMMgCl2，0.2mMdNTP，各引物0.2uM，20-50ng模板，Taq酶0.5U;PCR熱循環(huán)程序94°C變性5min，然后94'C1min、58°C1min、72°C75s進行33個循環(huán)，最后72'C延伸10min,結(jié)果用1%瓊脂糖電壓lOV/cm條件下電泳30-40min,終結(jié)果用EB染色，凝膠成像系統(tǒng)上顯示。含/-2基因的株系能檢測出601bp的片斷；而不含1-2基因的株系能檢測出723bp的片斷(見圖4)。(5)將PCR檢測的植株接種鐮孢屬的番茄萎蔫病菌(&5ary咖ox/鄰or咖/.印./ycope/^'c/,劉暉等，山東農(nóng)業(yè)大學學報自然科學版，1991,22(4):356-360)鑒定，在兩片真葉期浸根接種鐮孢菌，3周后調(diào)査發(fā)病情況，確認1-2分子標記的正確性。實施例3:番茄抗葉霉病基因Cf-5標記的創(chuàng)建與利用(l)據(jù)根相關(guān)文獻信息找到C/^基因與其等位基因的信息，C/-5基因序列登錄號為AJ002236，Cf-5的等位基因C/W的序列登錄號為AY639604。(2)通過比對軟件分析，搜索到16個SNP位點和1個插入突變位點。分別為405A/T、485G/C、516517AT/CG、530G/A、610A/C、672G/A、715T/C、725C/G、806C/A、847A/G、997A/C、1145A/G、1171T/A、1381A/T、1543A/C、1075-1081位缺失6個堿基。(3)設(shè)計引物并合成，根據(jù)Cf-5基因缺失序列處來設(shè)計引物，等位基因特異引物在3'端與C/"^基因互補配對，故該條引物與Cf-0在3'端發(fā)生錯配。引物序列如下Cl:5'-GTTCTTATCCTTTAACACCCA-3';C2:5'-TCCCTCCMATTATTACTTCC-3'。(4)PCR擴增與電泳檢測PCR反應(yīng)總體積為25uL，10XPCRBuffer2.5uL,3.0mMMgCl2,0.2mMdNTP,上游引物O.16uM'下游引物0.24uM,20-50ng模板，Taq酶0.5U;PCR熱循環(huán)程序94'C變性5min，然后94°C1min、57°C1min、72'C75s進行34個循環(huán)，最后72'C延伸10min，結(jié)果用1%瓊脂糖電壓10V/cm條件下電泳30-40min，終結(jié)果用EB(溴化乙啶)染色，凝膠成像系統(tǒng)上顯示。所有材料中僅0nt7719(Cf-9/Cf-9)能擴增出約415bp大小的片段，在其他幾個番茄品系中沒有任何產(chǎn)物。因此該特異引物能特異檢測Cf-S基因，可用于基因標記輔助育種(見圖7)。(5)將PCK檢測的植株葉霉病菌接種鑒定，在四片真葉期噴霧法接種番茄葉霉病菌(顧沛雯等，番莉葉霉病菌生物學特性研究，寧夏農(nóng)學院學，2004，25(3):21-23)(1Cf個/ml)，兩周后進行病情調(diào)査，確認Cf-P分子標記的正確性。實施例4:番茄抗根結(jié)線蟲基因#2'-7標記的創(chuàng)建與應(yīng)用(1)據(jù)根相關(guān)文獻信息找到必'-/及其等位序列的信息。/基因的序列登錄號為U81378，等位基因肌'-ZC的序列登錄號為DQ863290。(2)通過比對軟件分析，發(fā)現(xiàn)#/-7與則'-JC在翻譯起始前的內(nèi)含子(intron1)序列存在很大差異(見圖1)。(3)設(shè)計引物并合成，根據(jù)必'-/的intron1兩端序列來設(shè)計引物來擴增intronl全長序列。引物序列如下Dl:5'-TTCTCTAGCTMACTTCAGCC-3'D2:5'-TTTTCGTTTTTCCATGATTCTAC-3'(4)PCR擴增與電泳檢測PCR反應(yīng)總體積為25UL,10XPCRBuffer2.5uL，3.0mMMgCl2，0.2mMdNTP，上下游引物各0.2M，20-50ng模板，T叫酶0.5U。PCR熱循環(huán)程序94°C變性5min，然后94。C1min、58°C1min、72°C75s進行34個循環(huán)，最后72'C延伸10min，結(jié)果用1%瓊脂糖屯壓10V/cm條件下電泳30-40min，終結(jié)果用EB染色，凝膠成像系統(tǒng)上顯示。含必4基因的株系能檢測出大小為556bp和1353bp的片斷；而不含#/_/基因的株系能檢測出大小為1287bp的片斷(見圖5)。(5)將PCR檢測的植株進行南方根結(jié)線蟲M8005(Meloidogyneincognita,趙洪海等，采自煙臺市的南方根結(jié)線蟲的描述，萊陽農(nóng)學院學報，2000,17(2):81-85)接種鑒定，在20d苗齡時灌根法接種2000條淋的根接線蟲。30d后觀察根部發(fā)病情況'確認必-_/分子標記的正確性(見圖6)。實施例5:抗病功能標記在優(yōu)質(zhì)多抗番茄品種(品系)選育中的應(yīng)用(1)引進國外多抗性番茄品種Ke印sake3275，購自美國福羅里達州番茄育種公司(TomatoGrowersS叩plyCompany),自交得到F2分離群體(2)對F2單株進行PCR檢測，結(jié)合田間經(jīng)濟性狀調(diào)査(如笫l開花節(jié)位，結(jié)實率，單果重等)，選擇含有三種抗性基因且性狀優(yōu)良的植株，F(xiàn)2單株繼續(xù)自交得到F3群體；(3)對F3單株進行PCR檢測(表l),結(jié)合田間經(jīng)濟性狀調(diào)查，選擇含有三種抗性基因且性狀優(yōu)良的植株，F(xiàn)3單株繼續(xù)自交得到F4群體；(4)對F4單株進行PCR檢測(表2)，結(jié)合田間經(jīng)濟性狀調(diào)查，選擇三種抗病基肉已純合且性狀優(yōu)良的植株，得到的優(yōu)質(zhì)多抗自交系與多個優(yōu)良自交系(如中蔬5號)雜交。(5)通過調(diào)査經(jīng)濟性狀與抗病性，選擇配合力好的組合用于實踐生產(chǎn)。表1利用分子標記輔助選擇對番茄分離群體F3的單株檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2利用分子標記輔助選擇對番茄分離群體F4的單株檢測結(jié)果(部分)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3本發(fā)明中所創(chuàng)建的標記與前人所創(chuàng)建的標記對比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明利用可隆的基因序列信息開發(fā)基因特異標記，并結(jié)合抗病接種鑒定或抗病品系來驗證基因標記的準確性，所獲得的4個抗病基因特異引物均能有效的區(qū)分抗病與敏感番茄材料，且在檢測過程中無需酶切、準確度高(表3)。通過本發(fā)明提供的分子標記用于抗病基因分子標記的篩選，以及抗病品種雜交一代種子純度的DNA檢測、選育多抗性蔬菜品種。可對不同來源的蔬菜種質(zhì)資源進行快速和早期鑒定、科學指導(dǎo)抗病親本的選擇，大大降低苗期抗病接種鑒定的工作量，提高抗病育種選擇效率，節(jié)約成本，加快品種選育的進程。序列表<110〉華中農(nóng)業(yè)大學<120>—種與番茄抗病性狀相關(guān)的分子標記克隆及應(yīng)用<130〉<141〉2008-10—15〈歸3〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>9837〈212〉DNA<213>番茄(Lycopersiconesculent咖)〈220〉<221〉gene<222>(1)..(9837)〈223〉<220><221>mutation<222>(2299)..(2299)<223〉<220〉<221〉咖tation〈222〉(2298)..(2298)〈223〉<220〉〈221〉mut&tion〈222〉(312)..(312)〈223〉〈400〉1ggatccttctcatttttagattecaagttctatactcttgttctttatag60ttgtg犯ttgtaatagttga33taagttctaagttt肌ta犯atttgaggaaataattca120ctcatattttctttctactattttcatcacatacatacttcaaagatata180tcattttataatatcaattct犯tt3gC3tg3g幼ceicgtcgtgttcaac240aactaatattactaaaagtgatcaaaatcatattttatt"t300agttattt犯aggtaattttatttttattcatgatatagtgattgttc3teittataatact360attattgattactttctttt鄉(xiāng)gggtaaattgtatggcaatattttcag420tcttttatcattagaa犯cttatttatacttgtatactcg480ggtt卿agttttgtgttctatgagtttctttgtaattat540tgatatatttttat犯ttttgttttactatgttattatat犯tattgtag600caaatgccccctc犯cgtataactggatttccaactacac3cttaaacttteicg3g8gtc660ctatcacccccctg犯ctatcccttaaa犯3gtC3t犯CC720agatctattttcacgtgtttg3cacgacatttatttttaggg8t犯tgCC780caagtaccccctcaacctatgcccgeiaatttcag3g加acactta^ct3tactaaggtc840ctattacccccctgaacttattttattaataattttttactcctttttagcctacgtggc900actatcttgggggcccaacgatggttgactttttttttcaaactagtgccacgtaagcta960肌gttC3ggggggt犯t鄉(xiāng)3ccttagtat1020agtat犯gtgtgtctctgggatttcgggcataggttg卿gggtacttgtgcattttctc1080ttatttttaccatcactagaacaccataagtccattattgggtctttgag1140ttatagctcgtttgaattttgctcatttgatacctaaaat1200taacttta犯gggg卿tggggggtt柳sgacgaatattgtC3tt犯tg1260atggtcaccgatgctctcaagg3卿tgsgctatgatgtc1320tgccacatcatcttctatggcgacaacaattgatggattaactag3tt犯tagct犯犯tgatattcteittagtaaaaaaaateittttttccatattgattttctcaaattetggtccaaatttatctc犯ttgattttggatgattggtaattttg犯tcagaaatsgtcaatccggtg3gtga肌gattgag3gatttgtt幼t犯ggstattgattgactttatcccatccgttaaaaacttgtcatttctaccctccaaattaacggcaattta犯ttacccatttgaaattgattttaacattggtga犯cttcaaactttcttcc3t犯t3tacawtcaat3t3cat8犯cc33g組agctattgccatggtaca犯tcgtttacaccattacattatttggtgctgttttctatcccaatggtgacaaacacaactgaagaaacgatgacgatcaaaaagcaagaggacgaatctgcaccatattttcttcgatattccctattgaaccaatagccccc犯tatttcaatttgtagaagac3gcatcgttcaaatcgatttggt犯g犯tgg犯Cgt3CC3gttCgtCgg38tgaacgaagagagttatcctt犯ttgagatgt犯cctttga/tggeiga^taag^gtcsttgctttgttgttatttgtttactataatgggatatggcaattttatttgaaattgggatgag犯gggtac3tatgacaagtttttttcaaggteagggtaaBgtta^ccagte肌tc犯3犯犯taa3taEtttga^aeitgcata^teitttataa/tagattttgatgttcactctccaaagacattcagggaggtaattatttcagttttaaagtttaattgtgtagttgaaaatccaaaaaaatattaaaaatttaaagatccataaggggcttttactaagtaaattgtccaagagttgccacttattaataatttttatataattgattttgttattttaaattatttttcatgagateataattccttcatttcatctaataattcctaataatattcaatatttttttt犯s朋aataaecccttaagttttggggtctaagacacataaaattgtctcgccttacgcgcgtgttcgaagg卿tgttatttgtagttttgatgatgaggttctc犯catgagttttgatgatgtgattcccaacatgaatagcctgttgactgccatacc肌tggcgtgagEtaaagtcagacctttacttgtctatacaatgtcactttcctaaacgtactctcacgaacatttgcaaaggctatacaactgaa犯ttcag肌gcatatcgtgtagttcaaataggctacgatatt1380tttgtagatat幼ttgattgattgagattt1440tggttgg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MATTATTACTTCC-3'。10、權(quán)利要求4-6任1項所述的分子標記在番茄分子標記輔助育種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于番茄分子標記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
。制備得到三段與番茄抗病性狀相關(guān)的分子標記，它們的核苷酸序列分別如序列表SEQIDNO1，SEQIDNO2和SEQIDNO3所述。定義了這些分子標記的相關(guān)堿基的突變位點，檢測分析表明，這些堿基突變引起序列標簽位點(STS)多態(tài)性。本發(fā)明已將Tm-2<sup>a</sup>，I-2，Cf-9和Mi等四種抗病基因進行聚合，根據(jù)分子標記輔助選擇，選育成多抗番茄自交系和F<sub>1</sub>抗病番茄雜交組合。本發(fā)明為番茄分子標記輔助育種有提供了一些有用的分子標記。文檔編號C12N15/11GK101386857SQ200810197310公開日2009年3月18日申請日期2008年10月21日優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日發(fā)明者劉忠祥,葉志彪,孫亞林,張余洋,張俊紅,李漢霞申請人:華中農(nóng)業(yè)大學