鹵醇脫鹵酶突變體菌株、鹵醇脫鹵酶突變體及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：：鹵醇脫鹵酶突變體菌株、鹵醇脫鹵酶突變體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物領域，尤其涉及一種鹵醇脫鹵酶基因突變體，生產該鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌的構建，生產及其應用。
背景技術：
：環氧化物被公認為是有機合成中最重要、應用最廣泛的合成中間體之一。此類化合物通過化學合成易于制備，但化學反應立體選擇性差，針對手性碳相連的羥基和卣素進行脫鹵環氧化過程中，化學反應一般沒有立體選擇性，雖然可以在一些化學催化劑的幫助下進行立體選擇性反應，但一般反應條件要求苛刻，結果也不理想。借助鹵醇脫鹵酶生物催化劑的使用，可以進行高立體選擇性脫鹵環氧化，從而得到單一的環氧化物，為下一步合成奠定堅實的基礎，而且其也可以用于拆分不同手性的鄰鹵醇混合物。同樣，環氧化物在開環反應中可以進行立體選擇，其中立體選擇性開環反應因產生兩個鄰近的手性中心，所以是不對稱合成中極為重要的方法之一。目前環氧化物開環過程中使用的親核試劑主要有含碳親核試劑、含硫親核試劑、含氧親核試劑、含卣素親核試劑、和含氮親核試劑等，化學手性開環需要添加化學手性催化劑，這些手性催化劑在手性選擇上的結果并不理想。借助鹵醇脫鹵酶生物催化劑的使用，可以進行高手性選擇環氧化物開環反應，開環過程中可以加入親核基團如氰基、硝基或者疊氮基等，來制備非常有用的化學中間體，使用這種方法也可以對環氧化物進行手性拆分。使用化學催化劑進行的化學合成費用昂貴，而且重金屬會對環境帶來污染，要求的反應條件也很苛刻。而使用鹵醇脫鹵酶生物催化劑進行的生物合成，具有反應條件溫和，立體選擇性高，價格相對低廉，對環境沒有污染等特點，因此，卣醇脫卣酶生物催化在環氧化物合成中的應用被大力推崇。近年來，國內外有許多學者把環氧化物的合成和開環反應的研究重心轉移到生物催化領域中，Jensen完成(CanJMicrobiol，1957.3:151-153)了a-鹵酸脫鹵酶的早期石開究，并把能使鹵族離子從鹵代有機化合物上釋放出來的酶統稱為脫鹵酶(dehalogenase)，人們發現脫鹵酶具有很好的立體選擇作用。脫鹵酶既可以進行環氧化反應，同時又可以可逆地進行開環反應，反應過程中加入親核基團，環氧和開環可以同時進行，兩步反應后親核基團將取代鹵素，同時又不改變碳原子的手性。生物催化反應所要求的反應條件一般比較溫和常溫、常壓、中性或者接近中性pH。這樣對設備性能要求不高，投入資金相對較少，生產過程安全，并方便于工廠管理和員工的操作。目前針對鹵醇脫鹵酶在鄰鹵醇的脫鹵反應，申請人在國內還沒有發現用基因工程的方法來工業化生產鹵醇脫鹵酶的相關報道。
發明內容因此為了更好地實現鹵醇脫鹵酶的工業化生產，本發明提出的技術方案的目的之一在于提供一種鹵醇脫鹵酶突變體基因，并通過篩選得到生產該鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌。本發明的另一個目的在于提供一種鹵醇脫鹵酶突變體。根據本發明的技術方案，構建基因工程菌的宿主細胞選自大腸桿菌BL21，MC1061，和JM105中的一種，其載體系統選自改造后的pGEF或改造后的pBAD，且其包括本發明所提供的鹵醇脫鹵酶突變體基因。根據本發明的另一目的，提供了一種利用該基因工程菌制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法，包括構建該基因工程菌；篩選得到該基因工程菌；培養該基因工程菌；種子罐發酵該基因工程菌；以及收集和制備鹵醇脫鹵酶突變體。本發明的另一個目的在于將由基因工程菌生產出的鹵醇脫鹵酶突變體應用到鄰鹵醇脫鹵環氧化和環氧化物的開環中。根據本發明提供的該基因工程菌的應用，其中，底物的結構式為其中可以是選自由氫，低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，芳基和取代芳基組成的組中的任意一種取代基，&可以是選自由低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，芳基，取代芳基和酯基組成的組中的任意一種取代基，X為Cl，Br或I。其中&、R2獨立地選自由氫，低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，雜芳基，芳基，取代芳基和酯基組成的組。本發明基因工程菌的保藏信息—種基因工程菌，名稱為大腸桿菌MC1061，屬于大腸埃希氏菌，拉丁學名EscherichiacoliMC1061，保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2008-6-16，保藏編號CCTCCNO:M208089。具體實施例方式根據本發明一個實施例的鹵醇脫鹵酶基因突變體，其來源于放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)，通過聚合酶鏈反應擴增(PCR)方式從放射形土壤桿菌細胞基因組中得到基因序列，然后對某些位點進行突變，從而獲得該目的基因，其基因序列為SEQIDNO.1根據本發明一個實施例的鹵醇脫鹵酶突變體的蛋白序列為SEQIDNO.2。根據本發明一個實施例的重組載體，包括根據本發明實施例的鹵醇脫鹵基因突變體，載體可以是改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，具有核苷酸序列SEQIDN0.3，所述改造后的pBAD，具有核苷酸序列SEQIDNO.4，其中pGEF采用乳糖啟動子，誘根據本發明提供的該基因工程菌的應用，其中底物的結構式為導劑為IPTG;pBAD采用阿拉伯糖啟動子，誘導劑為L-阿拉伯糖。根據本發明一個實施例的生產鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌具有包括鹵醇脫卣酶(halohydrindehalogenase)基因突變體的重組載體。具體地，本發明的基因工程菌為保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏編號為CCTCCNO:M208089的基因工程菌。根據本發明的一個實施例的基因工程菌發酵工藝，包括以下步驟A)將根據本發明實施例的菌株進行搖瓶發酵；B)種子罐發酵；以及C)商品罐發酵。根據本發明一個實施例的制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法，包括以下步驟A)將根據本發明實施例的菌株進行搖瓶發酵；B)種子罐發酵；C)商品罐發酵；以及D)將商品罐發酵所獲得的菌體進行處理，獲得液態鹵醇脫鹵酶突變體。根據本發明實施例的制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法可以進一步包括E)將獲得的液態鹵醇脫鹵酶突變體進行干燥，以獲得固態鹵醇脫鹵酶突變體。下面對本發明的各個步驟進行詳細描述。—、基因工程菌構建過程1.放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1基因組DNA的抽提1)5mlLB培養基細菌過夜培養，取1.5ml培養物離心12000rpm/3min;2)將離心得到的沉淀物用567ii1TE緩沖液(10mMTris.HCl，pH8.0;lmMEDTA)溶解，加入30iU10X的SDS和3iU20mg/ml的蛋白酶K，混勻，37攝氏度溫育lh;3)加入100ill的5MNaCl，充分混勻，再加入80ii1CTAB麵C1溶液(10%CTAB、0.7MNaCl)，混勻，65攝氏度溫育lOmin;4)加入等體積的氯仿/異戊醇(24:l)，混勻離心12000rpm/5min。將上清液轉入一個新離心管中；5)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)，混勻離心12000rpm/5min。將上清液轉入一個新離心管中；6)加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，離心后沉淀用70%乙醇洗滌；以及7)離心棄上清液，沉淀干燥后用lOOulTE緩沖液溶解。2.引物的設計以NCBI登錄號為AF397296的片段為模板，以primmer5引物設計軟件為基礎進行引物設計正引物:ATCTGACCATGGCAACCGCAATTG(下劃線代表Ncol限制性酶切位點)；以及反引物:CCCAACGGATCCACGAACCACGGC(下劃線代表BamHI限制性酶切位點)。3.目的基因片段的獲得PCR反應獲得原始鹵醇脫鹵酶基因片段，對序列進行測序分析，基因序列為SEQIDNO.5。BLAST比對后確定片段為鹵醇脫鹵酶基因，然后，限制性酶NcoI和BamHI酶切后和表達載體改造后的pGEF和改造后的pBAD相連，轉化BL21、MC1061或JM105，通過抗生素、酶切、測序等方式篩選得到重組后的目的菌株。二、突變體文庫建立和篩選針對野生態鹵醇脫鹵酶在催化由S-3-羥基-4-氯-丁酸乙酯合成R-3-羥基_4-氰基_丁酸乙酯反應中的低轉換數，對該酶進行設計與改造。酶的催化效率可用酶的轉換數表示。在酶濃度一定，底物濃度遠遠大于酶濃度[Et]的情況下，酶對特定底物的最大反應速度(Vmax)也是一個常數。此時Vmax=K3[Et]。K3表示酶被底物完全飽和時，每單位時間內每個酶分子所能轉化底物的分子數，稱為轉換數(turnover皿mbeTN)，也稱為催化常數kcat。它相當于一旦底物_酶中間物形成后，酶將底物轉化為產物的效率，Kcat值愈大表示酶的催化效率愈高。在本發明中，改善酶的催化效率主要依靠大引物PCR技術，對鹵離子結合區(Prol75-Tyr187)進行突變，構建相應的突變體文庫，并對所構建的文庫進行篩選以獲得具有優良特性的突變體。1、簡并引物設計與合成將175-178位四個相鄰的突變位點設計在同一引物上，合成兩條互補的簡并引物(見表l)。由于引物中引入的突變位點較多，因此所合成的引物較普通的PCR引物長很多，以保證引物可以很好地進行退火。表1用于構建突變體文庫的兩條互補大引物(應用primerpremier5)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、PCR擴增反應擴增反應在0.2毫升的PCR管中進行，將模板、上述引物、底物、和MgCl2按照一定比例混合，加雙蒸水至各個PCR管的終體積為50微升，最后加入高保真pfuDNA聚合酶，在95t:下預變性2分鐘，95t:變性1分鐘，55t:退火30秒，72。C延伸2分鐘，PCR循環數為33，隨后72t:再延伸5分鐘。加入甘油增加pfuDNA聚合酶的穩定性，同時提高反應體系的pH值，為擴增反應提供良好的環境。額外加入了鎂離子，增強聚合酶的擴增能力。3、電擊轉化實驗為了保證所構建文庫具有足夠的多樣性，因此，需要非常高的轉化效率，為此選擇電擊轉化。對此方法，轉化時所加DNA的體積要足夠小。實驗前要對經Dpnl(購自MBI公司)處理過的上述PCR產物進行濃縮。采用傳統的乙丙醇/乙醇沉淀法。實驗證明，在4t:冰箱過夜沉淀的DNA濃縮效果最好。電擊轉化后鋪板培養過夜，轉化菌落數極大(大約107—8個)。4、突變體文庫保存突變體文庫保存的方法有多種，理論上應在電轉化鋪板培養后進行單克隆菌種保存，但是該方法不適合較大突變體文庫的保存，目前比較常用的方法是突變體文庫質粒的保存。因此，需對轉化后的菌落進行洗滌，采用中量質粒提取試劑盒進行質粒回收。同時，為了證明所構建文庫的質量，進行了酶切實驗。在含有野生型HheC基因的質粒中，只含有唯一一個限制性內切酶PpuMI酶切位點，因此，含有野生態HheC基因的質粒經該酶切后形成線形DNA。該酶切位點正好位于編碼Pro175的密碼子處，因此，該酶切位點會因為Pro175的突變而消失，因而在經該酶切后不會形成線形DNA。5、突變體文庫篩選突變體表達后的篩選a.毒性試驗法由于HheC作用的大多數底物具有毒性，因而可在含有一定濃度底物的培養基中進行文庫篩選。含有高催化活性的突變體的菌株可分解有毒底物而可以生存且繁殖，而含野生態或含具有低催化活性的突變體的菌株將不能生存。該方法不僅快速，而且適用的底物范圍廣。b.pH指示法通過pH指示劑的顯色反應來檢測酶催化底物的反應速率。三、具有高催化活性的鹵醇脫鹵酶突變體的獲得在特定條件下，催化效率是參考特定質量的酶在特定時間特定體積內催化特定底物轉化為實際產物質量與理論產物質量(100%轉化)的百分比值來進行評定的，比值越大，催化效率越高。這里是指在p朋.5-8.0的10-100mMTris_H2S04緩沖液中，底物為(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯，反應液中底物初始濃度5-50mM，鹵醇脫鹵酶(0.01-100mg/100ml)在20-5(TC下催化反應20-60小時后得到的實際產物質量與理論產物質量的比值。通過該方法，最后篩選得到催化效率提高3倍以上的正突變體，突變體的催化效率在表2中示出。表2鹵醇脫鹵酶突變體催化特性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四、基因工程菌發酵工藝A)搖瓶發酵搖瓶種子培養基成分酵母抽提物5g/1;蛋白胨10g/1;NaCl:10g/1;氨芐青霉素(簡稱氨芐)100iig/ml。搖瓶種子培養基制備取5g酵母抽提物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800ml蒸餾水中，調節pH到7，用蒸餾水定容到1000ml，12rC保持15min，，在12rC下保持15min，溶液冷卻到60°C以下后加入氨芐至終濃度100iig/ml。發酵步驟從斜面接種到搖瓶，30-37t:，轉速150-200rpm攪拌，過夜培養1012h。B)種子罐發酵培養基成分蛋白胨5-15g/1、酵母抽提物5-20g/1、葡萄糖8_20g/l(或者甘油5-10g/l)、KH2P0410-15g/l、(NH4)2HP044.0_5.0g/l、(NH4)2S04l_2g/l、MgS04.7H201-1.5g/l、擰檬酸1.5-2.0g/l、CoCl2*6H202_3mg/l、MnCl2*4H2012-15.0mg/l、CuCl2.4H201-2mg/l、生物素4-5mg/l、維生素B14_5mg/1。底料培養基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、CoCl2.6H20、MnCl2.4H20、CuCl2.4H20攪拌溶解，用NaOH調節溶液pH至6-7，121°C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)、MgS047H20單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素Bl采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖(或者甘油)，MgS047H20，生物素，和維生素B1加入底料培養基中。種子罐發酵控制按照5%_10%的接種量從搖瓶接種到種子罐中，發酵溫度控制在27-32。C，pH控制在6-8，D0X(溶解氧，dissolvedoxygen)控制在20%以上。C)商品罐發酵培養基分底料培養基和流加培養基。其中底料培養基成分如下葡萄糖2-20g/l(或者甘油5-10g/l)、蛋白胨5-15g/l、酵母抽提物5-20g/l、KH2P0410_15g/1、(NH4)2HP044.0-5.0g/l、(NH4)2S04l-2g/l、MgS04.7H201-1.5g/l、擰檬酸1.5-2.Og/1、CoCl26H202-3mg/l、MnCl24H2012—15.Omg/l、CuCl24H20l_2mg/l、Na2Mo042H202-3mg/l、Zn(CH3C00)22H2010-20mg/l、擰檬酸鐵80-100.Omg/l、生物素4-5mg/l、維生素B14-5mg/1。底料培養基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、CoCl2.6H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、擰檬酸鐵攪拌溶解，用NaOH調節溶液pH至6-7，12rC下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素Bl采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖、MgS(^71120、生物素、和維生素Bl加入底料培養基中。流加培養基成分如下葡萄糖400g/l(或者甘油700g/l)、CoCl26H204.0-6.Omg/l、MnCl24H2020_30mg/l、CuCl24H202_3mg/l、H3B035_8mg/l、Na2Mo042H204-5mg/l、Zn(CH3C00)22H2010-20mg/l、擰檬酸鐵40_50mg/l。流加培養基配制:CoCl26H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、檸檬酸鐵攪拌溶解，用NaOH調節溶液pH至6-7，121。C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖和MgS0^7H20單獨滅菌，12rC下保持20min。然后將無菌的葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20加入流加培養基中。商品罐發酵控制整個過程控制DO20%以上，通風比為1:l-4(VVM)，葡萄糖(或者甘油)殘余含量O.001%。-1%。(w/v)，整個發酵時間25-60小時，發酵結束后菌體干重可以達到20-80g/l左右。商品罐誘導控制在發酵過程中，通過誘導劑的添加表達目的蛋白酶，誘導劑有IPTG或者L-阿拉伯糖，誘導劑用量為0.1°;-5°;(w/v)，誘導時期為發酵前期或者中后期。五、發酵液處理和酶制備發酵完畢后，將發酵液送入連續分離機、板框或者真空轉鼓進行菌液分離，濃縮菌體，濃縮菌體單獨或者結合采用物理、化學和生物破壁方法進行細胞破碎。物理方法主要采用均質機破碎，菌液濃度控制在50-200g/l，破碎壓力控制在30-60Mpa;化學方法開始用稀硫酸將濃菌體(50-200g/l)的pH調到7-8，攪拌均勻，用10X-20X的CaCl2下調pH到6-7，充分攪拌后用稀NaOH調節pH到7_8;生物方法主要采用溶菌酶進行細胞破壁，溶菌酶濃度l-2mg/ml，菌液濃度50-200g/l，攝氏37度處理4_20小時。細胞處理液板框過濾或者離心后取上清，上清進行微濾和超濾濃縮，向濃縮液中添加1%_10%甘油，0.02%。-2%。苯甲酸鈉，制備液態酶。按照產品酶活，將濃縮液中添加適量的淀粉、面粉、糊精等，在進風溫度120-180。C、出風溫度70-80。C、風速l士O.5mVmin、壓力:12-15X10kPa條件下進行噴霧干燥，制備固態酶。鹵醇脫鹵酶突變體的應用1.鹵醇脫鹵酶的作用機理鹵醇脫鹵酶和SDR家族在活性位點上存在相似性，其中132位絲氨酸(Serl32)和145位酪氨酸(Tyrl45)在蛋白氨基酸組成中非常保守，這些氨基酸在催化過程中所起的作用和SDR家族類似。Tyr作用于底物中的鄰鹵羥基，獲取質子，同時Ser通過氫氧鍵和底物的羥基中的氧結合，固定底物和穩定反應液。鹵醇脫鹵酶HheC在pH7-8、30-5(TC條件下，145位的蘇氨酸，132位的絲氨酸，和149位的Arg與底物反應，生成單一手性環氧化物。開環過程類似，是環氧化物合成的逆反應。通過氨基酸位點突變來證明酶的作用機理(底物2-溴-1-苯乙醇)，結果在表3中示出。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表3中我們可以看出，對于絲氨酸(Serl32)和145位酪氨酸(Tyrl45)進行突變后，其對底物的反應速度明顯下降，證明這兩個位點對于鹵醇脫鹵酶的催化作用起到了至關重要的作用。反應式l如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>反應式1關于鹵醇脫鹵酶作用底物的廣泛性，可以通過以下實驗結果得到證實(見表4)。表4催化速度(以每毫克蛋白每分鐘從1、3-二氯-2-丙醇中釋放20.71111101鹵素計為100%)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表4中可知，鹵醇脫鹵酶對多種鹵醇都具有脫鹵催化作用。環氧化物合成的作用底物鄰鹵醇其中，&可以是選自由氫，低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，芳基和取代芳基組成的組中的任意一種取代基，&可以是選自由低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，芳基，取代芳基和酯基組成的組中的任意一種取代基，X為Cl，Br或I。2.環氧化物開環的作用底物環氧化物o其中，R2獨立地選自由氫，低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，雜芳基，芳基，取代芳基和酯基組成的組。開環過程中，可以通過NaCN、NaN02、NaN3引入_CN、_冊2、或者_N3親核基團，從而合成各種非常有用的中間體化合物。在一種優選的具體實施方式中，&為H，R2為乙酸乙酯基。在另一種優選的具體實施方式中，&為H，R2為乙酸甲酯基。在另一種優選的具體實施方式中，&為H，R2為氯甲基。在另一種優選的具體實施方式中，&為對硝基_苯基，R2為H。在本申請的上下文中，烷基可以是含有1至IO個碳原子的直鏈或支鏈飽和基團，具有包括1至10個碳原子在內的烷基基團的實例是甲基，乙基，丙基，異丙基，叔丁基，正丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，2-乙基己基，2_甲基丁基，2_甲基戊基，l-甲基己基，3_甲基庚基，以及它們的其他異構形式。優選地，烷基基團具有1至6個碳原子，實例是甲基，乙基，丙基，異丙基，叔丁基，正丁基，戊基，己基等。如下所述，這些烷基基團可以被取代，例如被芳基或烷氧基基團取代。術語烷氧基表示如上文定義的烷基基團，其通過一個氧原子連接于分子的其余部分。術語鏈烯基表示直鏈或支鏈基團，這些基團包含2至6個碳原子，并且存在至少一個C=C雙鍵。鏈烯基基團的實例尤其包括烯丙基基團。術語炔基表示直鏈或支鏈基團，其包含2至8個碳原子，并且存在至少一個Cec三鍵。炔基基團的實例尤其包括乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基和己炔基基團。如下所述，這樣的基團可以被取代，尤其是被烷氧基、NHCOR'或如下定義的芳基取代。術語芳基包括任何包含6至18個碳原子，優選6至14個碳原子的芳族基團。最優選的芳基基團是單環或雙環的，并且包含6至10個碳原子，如苯基、或a-萘基、或者|3-萘基。另一種最優選的芳基基團是三環的，并且包括蒽基、或芴基基團。當&或者12是芳基基團時，它優選是苯基、l-萘基、或2-萘基基團。術語雜芳基包括任何包含4至18個碳原子，優選4至14個碳原子，并且被選自N、0、S的一個或幾個雜原子所中斷的芳族基團。最優選的雜芳基基團是噻吩基或苯并噻吩基，苯并呋喃基，吡啶基，嘧啶基，噠嗪基，異喹啉基，喹啉，噻唑基，呋喃基，吡喃基，吡咯基，2H-吡咯基，咪唑基，苯并咪唑基，吡唑基，異噻唑基，異噁唑基，以及噴哚基基團。術語芳烷基(或芳(C「Ce)烷基)基團總體上表示通過如上文定義的烷基基團連接于分子的芳基基團，如芐基或苯乙基。術語(C「Ce)烷芳基基團總體上表示通過如上文定義的芳基基團連接于分子的烷基基團。術語"環烷基"表示環狀的飽和烴基體系，其優選為具有3至6個碳原子的單環或多環。這類基團的典型實例是環丙基、環丁基、環戊基或環己基基團。術語"雜環"包括任何烴基化的芳族或非芳族的環，并具有一個或多個環雜原子。尤其是，一個雜環存在4至18個碳原子和一個或多個環雜原子，如N、0、或S。它們包括雜芳基基團，如噻吩基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，吡啶基，嘧啶基，噠嗪基，異喹啉基，喹啉基，噻唑基，呋喃基，妣喃基，妣咯基，2H-妣咯基，咪唑基，苯并咪唑基，妣唑基，異噻唑基，異唑基，以及吲哚基基團。它們還包括非芳族雜環，如嗎啉，哌啶，哌嗪，四氫呋喃基，以及吡咯烷基團。鹵素應理解為是指氟、氯、溴或碘。雜原子應理解為是指0、N或S。下面將結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而非限制本發明的范圍。實施例I.本發明基因工程菌的構建依靠大引物PCR技術，對鹵醇脫鹵酶的鹵離子結合區(Prol75-Tyr187)進行突變，將突變體和載體pBAD進行構建，轉化到宿主MC1061中構建突變體文庫，對突變體文庫進行篩選，發現P175H和Y177W突變效果比較理想，突變體氨基酸序列為SEQIDNO.2，進一步得到能生產該突變體的基因工程菌，該基因工程菌保藏編號為CCTCCNO:M208089。II.基因工程菌的發酵將本發明的菌株按照以下條件進行發酵。A)搖瓶發酵取5g酵母抽提物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800ml蒸餾水中，調節pH到7，用蒸餾水定容到1000ml，12rC下保持15min，溶液冷卻到60°C以下后加入氨芐至終濃度lOOiig/ml。從斜面接種到搖瓶，溫度37t:，轉速150rpm攪拌，過夜培養12h。B)種子罐發酵培養基成分葡萄糖8g/l(或者甘油10g/l)、蛋白胨10g/l、酵母抽提物15g/1、KH2P0410g/l、(NH4)2HP044.0g/l、(NH4)2S04lg/l、MgS04.7H20lg/l、擰檬酸1.5g/l、CoCl26H202mg/l、MnCl24H2012mg/l、CuCl2.4H20lmg/l、生物素4mg/l、維生素Bl4mg/1。底料培養基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、CoCl2.6H20、MnCl2.4H20、CuCl2.41120攪拌溶解，用NaOH調節溶液pH至7，121。C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)、MgS0^7H20單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素Bl采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖，MgS0^7H20，生物素和維生素Bl加入底料培養基中。種子罐發酵控制按照5%的接種量從搖瓶接種到種子罐中，發酵溫度控制在30°C，pH控制在7，DO控制在20%以上。C)商品罐發酵其中底料培養基成分如下葡萄糖20g/l(或者甘油10g/l)、蛋白胨10g/l、酵母抽提物15g/l、KH2P0410g/l、(NH4)2HP044.0g/l、(NH4)2S04lg/l、MgS04.7H20lg/l、檸檬酸1.5g/l、CoCl26H202mg/l、MnCl24H2012mg/l、CuCl24H20lmg/l、Na2Mo042H202mg/l、Zn(CH3C00)22H2010mg/l、擰檬酸鐵80mg/l、生物素4mg/l、維生素Bl4mg/l。底料培養基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、檸檬酸、13CoCl2.6H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3C00)221120、擰檬酸鐵攪拌溶解，用Na0H調節溶液pH至7，12rC下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS0^7H^單獨滅菌，12rC下保持20min。生物素和維生素B1采用無菌膜過濾除菌。然后將無菌的葡萄糖(或者甘油)，MgS047H20，生物素和維生素Bl加入底料培養基中。流加培養基成分如下葡萄糖400g/l(或者甘油700g/l);CoCl26H204.Omg/1;MnCl24H2020mg/l;CuCl24H202mg/l;H3B035mg/l;Na2Mo042H204mg/l;Zn(CH3COO)22H2010mg/l;擰檬酸鐵40mg/1。流加培養基配制:CoCl26H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、檸檬酸鐵攪拌溶解，用NaOH調節溶液pH至6-7，121。C下保持30min，冷卻后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20單獨滅菌，12rC下保持20min。然后將無菌的葡萄糖和MgS047H20加入流加培養基中。商品罐發酵控制整個過程控制DO20%以上，空氣流量1:1.5vvm，控制葡萄糖(或者甘油)殘余含量1%。以下，發酵結束后菌體干重可以達到20g/l。商品罐誘導控制在發酵過程中，通過誘導劑的添加表達目的蛋白酶，誘導劑為IPTG(pGEF表達載體)或者L-阿拉伯糖(pBAD表達載體)，誘導劑用量為2%。(w/v)，誘導時期為發酵前期。III.鹵醇脫鹵酶突變體的制備及鑒定將CCTCCM208089按上述條件發酵完畢后，將發酵液進入連續分離機進行菌液分離，濃縮菌體，濃縮菌體采用均質機破碎，菌液濃度控制在100g/l，破碎壓力控制在50MPa。細胞處理液板框過濾后取上清，上清進行微濾和超濾濃縮，濃縮液添加1%甘油，1%。苯甲酸鈉，制備液態酶。按照產品酶活，將淀粉和面粉(淀粉面粉=i:i)混合物按照一定比例加入濃縮酶液中，在進風溫度15(TC、出風溫度7(TC、風速1±0.5mVmin、壓力12-15X10kPa條件下進行噴霧干燥，制備固態酶。IV.鄰鹵醇的脫鹵實例1:(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的催化合成將反應緩沖液(50mMTrisH2S04，pH:8)力B熱恒溫到30°C;將底物加入反應緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為10g/l，攪拌均勻。先將30%NaCN的溶液稀釋10-20倍，然后用稀硫酸調節NaCN溶液pH到8.0，按照底物和NaCN的摩爾數比1:2比例添加稀釋的NaCN，攪拌均勻；加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯二1:100(w/w))進行催化反應，反應過程中通過補加NaCN調節反應液pH值。3(TC下反應24小時，催化效率達到97%，目的產物的光學純度(ee)值達到99%。實例2-l:(S)-氯甲基-環氧乙烷的催化合成將反應緩沖液(50mMTris*H2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將1，3-二氯-2-丙醇加入反應緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為10g/l，攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體1，3-二氯-2-丙醇=1:500(w/w))進行催化反應。3(TC下反應24小時，催化效率達到90%，目的產物光學純度達到95%。實例2-2:(lS，2R)-2-甲基_1_苯基_環氧乙烷的催化合成將反應緩沖液(50mMTris*H2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將(1S，2R)_2-氯(或者溴)-1-苯基-1-丙醇加入反應緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為80g/l，攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體(lS，2R)—2-氯(或者溴)-l-苯基-l-丙醇=1:500(w/w))，進行催化反應。3(TC下反應24小時催化效率達到92X，目的產物光學純度達到96%。V.環氧化物開環實例3-l:(S)-氯甲基環氧乙烷的手性拆分將反應緩沖液(50mMTrisH2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將混旋的氯甲基環氧乙烷加入反應緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為10g/l，然后加入40%NaN3到終濃度為10g/l，攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體對應于氯甲基環氧乙烷=1:500(w/w))進行催化反應。3(TC下反應24小時催化效率達到45X，目的產物光學純度達到95%。實施例3-2:(1S，2R)-1_甲基-l-苯基環氧乙烷的手性拆分將反應緩沖液(50mMTris*H2S04，pH:8)加熱恒溫到30°C;將混旋1_甲基+苯基環氧乙烷加入反應緩沖液中，控制底物在水溶液中的含量為80g/l，然后加入40%NaN3到終濃度為10g/l攪拌均勻。加入鹵醇脫鹵酶突變體(鹵醇脫鹵酶突變體(1S，2R)—1-甲基-1-苯基環氧乙烷=1:500(w/w))進行催化反應。3(TC下反應24小時催化效率達到45%，目的產物光學純度達到96%。綜上所述，雖然本發明已以一個優選實施例披露如上，然其并非用以限定本發明。本發明所屬
技術領域：
中的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，可以作各種更動與修改。因此，本發明的保護范圍當視所附的申請權利要求書所限定的為準。序列表〈110〉安琪酵母股份有限公司〈120〉鹵醇脫鹵酶突變體的菌株、鹵醇脫鹵酶突變體及其制備方法和應用〈130〉P20220ANGEL〈160>5〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>765〈212>DNA〈213〉鹵醇脫鹵酶基因突變體〈400>1atgtcaaccgcaattgtaaccattttggggg^tggggtctgcacttcgt60ctctcggaagagtggcttgcgcttcaaaca120cttgaagcctttgccgaaacctatccacaatgtcgg肌ca3g^CC3gCg180gaactcatcgctccgcttatggt固gttgatgtacttgtg3gC33Cg3C240atettcgcaccagagttccaacccategattcgcggtgcg300gtcgaggcgcaccatttgcactggtcaacgccgttgcaag360^gcgc皿^gcggacatettetctttattacctctgcaacgcccttcgggccttgg啷420gaactttctacctacacgtc3gCCCg3gC3ggtgratgcaccttggcaaatgccctttcg■朋gg朋ctcggtg朋tec朋cattccggtgttcgcaataggacacaattggcttcacagtgaagatagtccctacttctaccccacagaaccgtgg朋朋cgaatccagaacacgttgcccatgtcaaaaaagtcactgcgctccagcggttaggtacac3g朋3g朋ttgggag朋ctcgtcgcgtttctcgcgtctggtegttgtgactatctgaccggccaggtgttctggttggccggcggattcccaatgatcgagcgttggcctggtatgcccgagtag〈210>2〈211>254〈212>PRT〈213〉鹵醇脫鹵酶突變體〈400>2MetSerThrAlalieValThrAsnValLysHisPheGlyGlyMetGly151015SerAlaLeuArgLeuSerGluAlaGlyHisThrValAlaCysHisAsp202530GluSerPheLysGinLysAspGluLeuGluAlaPheAlaGluThrTyr354045ProGinLeuLysProMetSerGluGinGluProAlaGluLeulieGlu505560AlaValThrSerAlaTyrGlyGinValAspValLeuValSerAsnAsp65707580liePheAlaProGluPheGinProlieAspLysTyrAlaValGluAsp859095TyrArgGlyAlaValGluAlaLeuGinlieArgProPheAlaLeuVal100105110AsnAlaValAlaSerGinMetLysLysArgLysSerGlyHislielie115120125PhelieThrSerAlaThrProPheGlyProTrpLysGluLeuSerThr130135140TyrThrSerAlaArgAlaGlyAlaCysThrLeuAlaAsnAlaLeuSer145150155160LysGluLeuGlyGluTyrAsnlieProValPheAlalieGlyHisAsn165170175TrpLeuHisSerGluAspSerProTyrPheTyrProThrGluProTrp180185190LysThrAsnProGluHisValAlaHisValLysLysValThrAlaLeu195200205GinArgLeuGlyThrGinLysGluLeuGlyGluLeuValAlaPheLeu210215220AlaSerGlySerCysAspTyrLeuThrGlyGinValPheTrpLeuAla13/17頁76516225230235240GlyGlyPheProMetlieGluArgTrpProGlyMetProGlu245250〈210〉3〈211〉3089〈212〉DNA〈213〉改造后的pGEF〈400〉3attg^gcatttatcagggttettgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttaga60皿teggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgtatgcggtg120C3C3g3tgCgteaggag3^ateccgcatcaggcg^att180atettttgtt皿^ttcgcgttaaatetttgttaaatcagctcatttttt240ccg^atcggcaaaatccctcg卿tegggttgagtgttg300ttccagtttgg^c^gagtccactettea3g^cgtgg3ctccaacgtc■agggcg^360aaaccgtctatc鄉gcgatggcccactacgtgaaccatcagttttttgc420ggtcg郷tgccgtaaagctcte^tcgga3cccte33gggagcccccgatttagagctt480gacgggg^agCCggCg33Cgtggcg卿a鄉^ggg^ggagcgggcg540ctegggcgctggc卿tgtegcggtcacgctgcgcgtaacC3CC3C3CCCgccgcgctte600atgcgccgctac鄉gcgcgtccagtcgccattcaggctgcgcaactgttggg皿gggcg660atcggtgcgggcctcttcgctettacgccaggatctcgatcccgcgaaattaatecgact720cacteteggg3g3CC3C^Cggtttccctctagaaataattttgtttaac780tggctagcatg3Ctggtgg3C3gC皿3tgggtcggatccggctgctaaca840皿gcccga皿gg皿gctgagttggctgctgccaccgctgagc皿teactegcataacccc■ttggggcctcte皿cgggtcttgaggggttttttgctgaaatetccggat960gggttcg腿tcgateagctctgcctcgcgcgtttcggtgaaacctctga1020cacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgteagcggatgccggg3gC3g3C朋1080gcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtca1140cgtegcgategcggagtgtetectggctteactetgcggcattgtectga1200g3gtgC3CC3tatetgcggtgtga皿teccgcacagatgcgteaggag皿aateccgcat1260caggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcg13203gcggtetcagctcactc皿aggcggteatacggttetccgggateacgc13803tgtg3gC皿朋ggCC3gC3皿3ggCC3gg皿ccgtea皿aggccgcgtt1440gctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatgacgctc皿g1500tc卿ggtggcg皿3cccgacaggactete皿gatecc3ggcgtttccccctggaagctc1560cctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctteccggatecctgtccgcctttctccc1620ttcggg朋gcgtggcgctttctcategctcacgctgteggtetctcagttcggtgteggt1680cgttcgctcc朋gctgggctgtgtgracgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcctt1740atccggtaactatcgtcttgagtccaacccggteagacacgacttetcgccactggcagc1800agccactggt朋caggattegcag3gcgaggtetgteggcggtgct織gagttcttgaa1860gtggtggcctaactecggct3cacteg朋ggacagtetttggtetctgcgctctgctg朋1920gccagttaccgagttggtegctcttgatccggcaaacaaaccaccgctgg1980tegcggtggtttttttgtttgc朋gcagc3gattecgcgc3ga朋朋朋ggatctc朋ga2040agatcctttgatcttttctecggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgtteagg2100gattttggtcatgagattetc朋3朋ggatcttcacctegatcctttt朋atte朋朋tg2160朋gtttte朋tcaatcteaagtetetatgagteaacttggtctgacagttaccaatgctt2220朋tcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctetttcgttcatccategttgcctgact2280ccccgtcgtgtagateactecgatecgggagggctteccatctggccccagtgctgcaat2340gateccgcgagacccacgctcaccggctccagatttetcagcaateaaccagccagccgg2400朋gggCCgElgcgcagaagtggtcctgcaactttetccgcctccatccagtctetteattg2460ttgccggg朋gctegagteagtegttcgccagtteategtttgcgcaacgttgttgccat2520tgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtetggcttcattcagctccggttc2580ccaacgatcaaggcgagttecatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttegctcctt2640cggtcctccgatcgttgtcagaagteagttggccgcagtgttetcactcatggttetggc2700agcactgcataattctcttectgtcatgccatccgteagatgcttttctgtgactggtga2760gtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtetgcggcgaccgagttgctcttgcccggc2820gtc朋tecgggateateccgcgccarategcag皿ctttea^gtgctcatcattgga朋2880acgttcttcggggcg朋皿ctctcaaggatctteccgctgttgagatccagttcgatgta2940acccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttectttcaccagcgtttctgggtg3000gg皿ggra皿atgccgc皿3皿3ggg皿te3gggcg3cacgg朋atgttg3060ctcttccttt-ttcaatatt3089〈210〉4〈211〉4094〈212〉DNA〈213〉改造后的pBAD〈400〉4ttgtccatettgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttectggctct60tctcgcteacca皿ccggteaccccgcttette朋3gcattctgteac朋agcgggacca120皿gCC3tg3C朋c朋朋gtgtcteteatcacggcag朋朋gtccacattg180attetttgcacggcgtcacactttgctetgccategcatttttetccateagattegcgg240atcctecctgacgctttttetcgcaactctctectgtttctccatecccgttttttgggc300teacaggaggggatccgagctcgagatctgcagctggteccatetgggaa360ttcgaagcttgggcccg皿c3朋朋ctcatctcag朋gaggatctg朋tegcgccgtcga420ccatcatcatcatcatcattgagttteaacggtctccagcttggctgttttggcggatga■gag皿gattttcagcctgat3cagatte朋tcag朋cgc3g朋gcggtctgate朋3C3g540aatttgcctggcggragtegcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtg600a皿cgccgtegcgccgatggtegtgtggggtctccccatgcgagagtegggaactgccag660ctcagtcgaaagactgggcctttcgttttetctgttgttt720gtcggtg雄gctctcctgagteggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaa780gcaacggcccgg郷gtggcgggc郷acgcccgccateaactgccaggc840gcag皿ggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctecaaactcttttgtttetttt■ttcaaatetgtatccgctcatgagac皿teaccctgateaatgcttcaat960朋gg皿gagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctttt1020ttgcggcattttgccttcctgtttttgctc3CCC3g皿3Cgctggtg咖1080gttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggteaga1140tccttgagagttttcgccccg皿g皿cgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgc1200tetgtggcgcggtettatcccgtgttgacgccgggc皿gagcaactcggtcgccgcatec1260actettctcag皿tgacttggttgagtectcaccagtcaccttecggatg1320gratgacagttgcagtgctgccateaccatgagtgateacactgcggcca1380acttecttctgac皿cgatcgg郷紅gaaggagcteaccgcttttttgC3C朋C3tgg1440gggatratgtaactcgccttgatcgttggg皿ccggagctg皿tg皿gccatecc皿3cg15003Cg3gCgtg3caccacgatgcctgtegcaatggc朋c皿cgttgcgca皿ctetteactg1560gcgaactacttactctagcttcccggcaacctggatggaggcggate皿g1620ttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgate皿tctg1680g賜ccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggcc卿tggteagccct1740cccgtetcgtagttetctec3Cg3Cgggg3gtcaggc皿ctetggatg皿cga朋tegac1800agatcgctgagateggtgcctcactgatte3gcattggteactgtcagaccaagtttect1860catetetactttegattgattteaaacttcattttteatttea朋ggatcteggtga卿1920tcctttttgataatctcatgctteacgtgagttttcgttccactgagcgt1980cagaccccgt朋aggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgteatct2040gctgcttgcaccaccgcteccagcggtggtttgtttgccggatengage2100teccaactctttttccgaaggteactggcttcagragagcgcagateccaaatectgtcc2160ttctegtgtegccgtegtteggccaccacttcaagaactctgtegcaccgcctecatecc2220tcgctctgctaatcctgtteccagtggctgctgccagtggcgateagtcgtgtctteccg2280ggttggactc朋gacgategtteccggate郷cgragcggtcgggctgaaeggggggtt2340cgtgcacacagcccagcttggagcg朋cgacctecaccgaactgagatecctecagegtg24003gctetgag3朋gcgccacgcttcccgaaggg卿皿ggcgg織ggtetccggteagcg2460gc郷gtcgg朋C3gg3g3gcgracg郷gagcttccaggggg朋acgcctggtatcttt2520atagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcag2580gggggcggagcctetgga皿朋CgCC3gC3acgcggcctttttecggttcctggcctttt2640gctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttetcccctgattctgtggat朋ccgte2700ttaccgcctttgagtgagctgateccgctcgccgcagccg皿cgaccgagcgcagcgagt2760C3gtg3gCg3gg皿gcgg皿gagcgcctgatgcggtettttctccttecgcatctgtgcg2820gtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtecaatctgctctgatgccgcategttea2880gccagtetecactccgctetcgctecgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgcc2940aacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgctt3C3g3C皿gC3000tgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccga朋cgcgc3060atcaattcgcgcgcg朋ggcg皿gcggcatgcateatgtgcctgtcaaat3120gg3Cg皿gC3gggattctgcaaaccctetgctectccgtcaagccgtcaattgtctgatt3180cgtteccaattatgacaacttgaeggctecatcattcactttttcttcacaaccggcacg3240gaactcgctcgggctggccccggtgcatttttteaatecccgcgagaaatagagttgatc3300acattgegaecgacggtggcgateggcatccgggtggtgctc皿皿grag3360cttcgcctggctgatecgttggtcctcgcgccagctteagacgcteatcccteactgetg3420gcgg皿朋gatgtgacagacgCg3CggCg3C皿gC皿3C3tgctgtgcgacgctggcgat3480ctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtecccgatt3540atccatcggtggatggagcgactegtteatcgcttccatgcgccgcagteacaattgetc3600atcgccagcagctccgaategcgcccttccccttgcccggcgttaatgat3660ttgcccaaac郷tcgctgaaatgcggctggtgegctteateegggegaaagaaccccgt3720attggc朋atattgaeggeeagtteagcc3ttratgeragteggegegeggacg皿3gte3780aacccactggtgateccattcgcgagcctceggatgaegaccgtagtgatgaatctctcc3840tggcggg雄cacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcac3900caccccctgaccgcg朋tggtgagattgagaatetaacctttcattcccagcggtcggtc3960tcgagateaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggc4020atte皿cgagtatcccggcagcaggggatcattttgegettcagccatecttttcatect4080cccgccattcagag4094〈210〉5〈211〉765〈212〉DNA〈213〉原始鹵醇脫鹵酶基因片段〈400〉5atgtcaaccgcaattgtaaccattttgggggaatggggtctgcacttcgt60ctctcggaagagtggcttgcC3Cg3tg^3gCttC^3C33皿gg3Cg^120cttgaagcctttgecgaaacctatccacaaCtC3皿CC^tgtCgg33C33g^CC3gCg180gaactcatcgaggcagttecctccgcttatggtc皿gttgatgtecttgtgagc^cgac240atettcgcaccagagttccaacccategata^tecgctgtegaggactetcgcggtgcg300gtcgaggcgcaccatttgeaCtggtC33CgCCgttgC33gtca皿tg^g360■gcgc^^geggacatettetctttattacctctgcaacgcccttcgggccttggaag420gaactttctacctacacgtc3gCCCg3gC3ggtgcatgcaccttggcaaatgccctttcg480■gg^ctcgcattceggtgttcgcaataggacccaattatcttcacagt540cctacttctaCCCC3C3g^ccgtgg^^Cg^tCC3g33C3CgttgCC600aagtcactgcgctccagcggtteggtecac3ga^g^ttgggag^ctc660gtcgcgtttctcgcgtctggtegttgtgactatctgaccggccaggtgttctggttggcc720ggcggattecc^tgatcgagcgttggcctggtetgcccgagteg76權利要求一種鹵醇脫鹵酶突變體基因，其包括序列SEQIDNO.1。2.—種由權利要求l所述的基因編碼的鹵醇脫鹵酶突變體，其具有序列SEQIDNO.2。3.—種生產權利要求2所述的鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中包含權利要求1所述的突變體基因。4.根據權利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主細胞選自大腸桿菌BL21，MC1061，和JM105中的一種。5.根據權利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的載體系統選自改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，其具有核苷酸序列SEQIDNO.3;所述改造后的pBAD，其具有核苷酸序列SEQIDNO.4。6.—種利用權利要求3所述的基因工程菌制備鹵醇脫鹵酶突變體的方法，其特征在于包括以下步驟(a)構建所述基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細胞，載體系統以及鹵醇脫鹵酶突變體基因；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養所述基因工程菌；(d)種子罐發酵所述基因工程菌；以及(e)收集和制備鹵醇脫鹵酶突變體。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述宿主細胞選自大腸桿菌BL21，MC1061，和JM105中的一種。8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的載體系統選自改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，其具有核苷酸序列SEQIDNO.3;所述改造后的pBAD，其具有核苷酸序列SEQIDNO.4。9.根據權利要求68中任一項所述的方法，還包括在一定商業罐發酵條件下，進行工業化制備所述鹵醇脫鹵酶突變體的步驟。10.根據權利要求9所述的方法，其中所述商業罐發酵條件是DO20%以上，空氣流量1:l-4vvm，葡萄糖或者甘油的殘余含量為0.001。；-lQ;。11.根據權利要求35任一項所述的基因工程菌在鄰鹵醇脫鹵環氧化反應中的應用，所述底物的結構式為其中A是選自由氫，低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，芳基和取代芳基組成的組中的任意一種取代基，R2是選自由低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，芳基，取代芳基和酯基組成的組中的任意一種取代基，X為Cl，Br或I。12.根據權利要求35任一項所述的基因工程菌在環氧化合物開環反應中的應用，所述環氧化合物的結構式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Ri、R2獨立地選自由氫，低級烷基，環烷烴，烷氧基，鏈烯基，炔基，雜環，雜芳基，芳基，取代芳基和酯基組成的組。全文摘要本發明提供了一種生產鹵醇脫鹵酶的基因工程菌，并且通過培養該基因工程菌和發酵工藝，使得鹵醇脫鹵酶的生產工業化。本發明還提供了該基因工程菌的應用，由該基因工程菌生產出的鹵醇脫鹵酶可以應用到鄰鹵醇脫鹵環氧化和環氧化物的開環反應中。文檔編號C12N1/21GK101760468SQ20081018657公開日2010年6月30日申請日期2008年12月25日優先權日2008年12月25日發明者余華順,余明華,俞學鋒,姚鵑,李知洪,楊海珍,熊茂盛,石雨申請人:安琪酵母股份有限公司