專利名稱：重組人白細胞介素12真核表達載體的構建及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組人白細胞介素12 ( rhIL-12)真核表達載體的研 制和應用。具體涉及該載體的構建、表達鑒定、生物學活性分析、 rfiIL-12在真核細胞中穩定表達細胞系的篩選、 一種核酸疫苗的基因 佐劑和腫瘤基因治療制劑。
背景技術：
IL-12是一種由異源二聚體蛋白組成的細胞因子，編碼IL-12 兩個亞基(p35、 p40)的基因位于不同的染色體上，二者分別合 成后再通過亞基間二硫鍵結合成具有生物學活性的二聚體分子 (p70)。單獨的亞基不能發揮其生物學作用。而且，p40易形成 同源二聚體，通過受體競爭機制抑制IL-12的活性。
中國專利200410080518.7公開了一種純化重組人白細胞介素12 的方法，涉及蛋白質純化方法。本發明純化重組人白細胞介素12的 方法，是將重組人白細胞介素12的細胞培養上清液進行陽離子交換 層析和陰離子交換層析；所述重組人白細胞介素12的細胞培養上清 液進行所述陽離子交換層析時，pH高于重組人白細胞介素12的等電 點；進行所述陰離子交換層析時，先用pH3.5-5.0的緩沖液洗脫除去 雜蛋白，接著洗脫收集目的物。但是這種方法生產rhIL-12，產出的 rfiIL-12純度不夠，目前還不能用于臨床使用。
目前，國外已經將人IL-12真核表達載體和rhIL-12作為治療制
劑進入n/m期臨床實驗階段，涉及多種傳染性疾病、腫瘤、甚至自
身免疫性疾病的治療。使用人IL-12真核表達載體進行腫瘤進行基因 治療己成為腫瘤生物治療的一個新策略；也為臨床病毒性疾病及多種 自身免疫性疾病的治療開辟了新的研究領域。本研究擬構建一種rhIL-12的真核表達載體、對其進行表達鑒定、 研究其基因佐劑功能和腫瘤基因治療作用，并篩選其穩定表達細胞 系。rhIL-12真核表達載體的研制、在真核細胞中穩定表達細胞系的 建立、其基因佐劑和腫瘤基因治療功能的探索對于rhIL-12的理論和 應用研究均具有重要的意義，并具有潛在的市場前景。
發明內容
本發明提供了重組人白細胞介素12真核表達載體的構建及其應 用。構建rIL-12真核表達載體(pCDNA6-IL-12)，對其進行體外表達 鑒定及表達產物的生物學活性分析；將其與重組人巨細病毒被膜蛋白 PP65腺病毒核酸疫苗(Adno-pp65)共同免疫動物，評價其對核酸疫 苗的基因佐劑功能；將其直接在實驗小鼠腫瘤模型瘤體內注射或導入 腫瘤細胞后再致瘤，觀察其對腫瘤的基因治療作用；篩選rhlL-12穩 定表達細胞系。本發明已基本達到進入I期臨床實驗階段，可審慎選 擇少量臨床病例進行體內應用研究，以積累經驗，探索和完善方法， 為其后正軌的I期臨床研究提供支持。
為了解決背景技術所存在的問題，本發明采用以下技術方案 pCDNA6-IL-12的構建采用10個疏水的柔性氨基酸接頭連接的方 案獲取rlL-12P40、 P35融合基因，本構建策略不僅可保證P40、 P35 兩亞基以1: 1比率表達，而且柔性氨基酸接頭可使兩個亞基充分延 展、正確折疊，從而獲得最大的生物學活性。融合基因插入真核表 達質粒(pcDNA6/v5-hisp),構建pCDNA6-IL-12; 通過酶切、測序 鑒定重組克隆。將pCDNA6-IL-12導入HEK293細胞，ELISA檢測培 養上清液中rhlL-12表達。
rh-IL-12體外生物學活性分析應用特異性淋巴細胞增生實驗、 NK殺傷活性、細胞因子流式細胞(CFC)等方法對rhIL-12進行體 外生物學活性分析。
pCDNA6-IL-12的基因佐劑功能研究pCDNA6-IL-12與HCMV核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠體內共免疫。檢測其對核酸疫苗 的基因佐劑功能
應用pCDNA6-IL-12進行腫瘤基因治療的研究(l)以小鼠肉瘤細 胞(S-180)在昆明種小鼠建立荷瘤模型，將pCDNA6-IL-12直接瘤 體內注射。(2)將pCDNA6-IL-12轉染小鼠乳腺癌細胞株EMT6，經篩 選獲得rhlL-12基因修飾的小鼠乳腺癌細胞株(EMT6/IL-12);接種實 驗小鼠，觀察并檢測其對腫瘤的基因治療作用。
rhIL-12穩定表達細胞系的篩選將pCDNA6-IL-12轉染CHO細 胞；用Blasticidin篩選rhIL-12陽性表達克隆，并進行單克隆擴增、 表達鑒定及表達穩定觀察。
pCDNA6-IL-l2在實驗小鼠體內應用的初步安全性評價 pCDNA6-IL-12在實驗小鼠體內大劑量應用(肌肉注射)。觀察其體 溫、體重、 一般狀況等。
本發明的主要成果本發明成功地構建了重組人白細胞介素12 的單鏈雙亞基真核表達質粒(pCDNA6-IL-12)，并證明其表達的產物 (rhIL-12)具有預期的生物學活性。應用彈性蛋白接頭連接rhIL-12 兩個亞基的方案在國內為首次報道，享有獨立的知識產權。
pCDNA6-IL-12與HCMV核酸疫苗在實驗小鼠體內共免疫，可 顯著增強核酸疫苗的免疫效果，發揮理想的基因佐劑功能。經進一步 完善后，可進入臨床試用階段的研究。
pCDNA6-IL-12于實驗小鼠瘤體內注射或應用pCDNA6-IL-12對 腫瘤細胞進行基因修飾后再致瘤的研究表明，pCDNA6-IL-12通過激 發機體的抗腫瘤細胞免疫機制而發揮抗腫瘤作用，研究結果令人振 奮。同時獲得了經基因修飾并穩定表達rhlL-12的小鼠乳腺癌細胞株 (EMT6/IL-12)。為應用pCDNA6-IL-12進行腫瘤生物治療的I期臨 床研究奠定了基礎。
成功地篩選出穩定表達rhIL-12的細胞系，為進行rhIL-12的中試生產和純化鋪平了道路，并為其進一步深入的功能研究和產業化開發 奠定了基礎。初步的安全性評價結果表明，其在實驗小鼠體內應用具 有較好的安全性。
具體實施例方式
本具體實施方式
采用以下技術方案pCDNA6-IL-12的構建采 用10個疏水的柔性氨基酸接頭連接的方案獲取rIL-12 P40、 P35融合 基因，本構建策略不僅可保證P40、 P35兩亞基以l: 1比率表達，而 且柔性氨基酸接頭可使兩個亞基充分延展、正確折疊，從而獲得最 大的生物學活性。融合基因插入真核表達質粒(pcDNA6/v5-hisp)， 構建pCDNA6-IL-12; 通過酶切、測序鑒定重組克隆。將 pCDNA6-IL-12導入HEK293細胞，ELISA檢測培養上清液中rhIL-12 表達。
rh-IL-12體外生物學活性分析應用特異性淋巴細胞增生實驗、 NK殺傷活性、細胞因子流式細胞(CFC)等方法對rhIL-12進行體 外生物學活性分析。
pCDNA6-IL-12的基因佐劑功能研究pCDNA6-IL-12與HCMV 核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠體內共免疫。檢測其對核酸疫苗 的基因佐劑功能
應用pCDNA6-IL-12進行腫瘤基因治療的研究(l)以小鼠肉瘤細 胞(S-180)在昆明種小鼠建立荷瘤模型，將pCDNA6-IL-12直接瘤 體內注射。(2)將pCDNA6-IL-12轉染小鼠乳腺癌細胞株EMT6,經篩選 獲得rhlL-12基因修飾的小鼠乳腺癌細胞株(EMT6/IL-12);觀察并檢 測其對腫瘤的基因治療作用
rhIL-12穩定表達細胞系的篩選將pCDNA6-IL-12轉染CHO細 胞；用Bksticidin篩選rhlL-12陽性表達克隆，并進行單克隆擴增、 表達鑒定及表達穩定觀察。
權利要求
1、重組人白細胞介素12真核表達載體的構建及其應用，其特征在于pCDNA6-IL-12的構建過程采用10個疏水的柔性氨基酸接頭連接的方案獲取rIL-12 P40、P35融合基因，插入真核表達質粒(pcDNA6/v5-hisp)，構建重組rIL-12表達載體(pCDNA6-IL-12)；通過酶切、測序鑒定重組克隆。
2、 根據權利要求1所述的重組人白細胞介素12真核表達載體的 構建及其應用，其特征在于rh-IL-12體外生物學活性分析應用特 異性淋巴細胞增生實驗、NK殺傷活性、細胞因子流式細胞(CFC)等 方法對rhIL-12進行體外生物學活性分析。
3、 根據權利要求1所述的重組人白細胞介素12真核表達載體的 構建及其應用，其特征在于基因佐劑功能；pCDNA6-IL-12與HCMV 核酸疫苗(aden-pp65)在Bab/c小鼠體內共免疫，能顯著增強疫苗的 免疫效果。
4、 根據權利要求1所述的重組人白細胞介素12真核表達載體的 構建及其應用，其特征在于腫瘤基因治療作用將pCDNA6-IL-12 直接在實驗小鼠腫瘤模型瘤體內注射或導入乳腺癌細胞內再致瘤，表 現出抗腫瘤作用。
5、 根據權利要求1所述的重組人白細胞介素12真核表達載體的 構建及其應用，其特征在于rhIL-12穩定表達細胞系的建立將 pCDNA6-IL-12轉染CHO細胞，用Blasticidin篩選出rhIL-12陽性 表達克隆，獲得穩定表達細胞系。
全文摘要
重組人白細胞介素12真核表達載體的構建及其應用，它涉及重組人白細胞介素12(rhIL-12)表達載體的研制、穩定表達細胞系的篩選、其核酸疫苗基因佐劑功能和腫瘤基因治療作用。采用10個疏水的柔性氨基酸接頭連接P40、P35獲得融合基因構建rhIL-12真核表達質粒(pCDNA6-IL-12)。將其轉染CHO細胞篩選出了穩定表達細胞系，并且表達產物具有良好的生物學活性。pCDNA6-IL-12與核酸疫苗共免疫可顯著增強其免疫效果。直接在實驗小鼠腫瘤模型瘤體內注射或用其對腫瘤細胞進行基因修飾后再植入均可發揮強大的抗腫瘤作用。經進一步完善后可進入臨床試用階段的研究。
文檔編號C12N15/24GK101638657SQ20081018346
公開日2010年2月3日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者張文卿 申請人:張文卿