專利名稱：：新穎液化淀粉芽孢桿菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明是關于一種新穎液化淀粉芽孢桿菌菌株-Bacillusamyloliquefaciens，尤其，本發明是關于一種新穎液化淀粉芽孢桿菌菌株-BacillusamyloliquefaciensBa-BPD1或其突變株，用以產生多種酶、多種抗生素及生物表面活性劑。
背景技術：
：微生物及其產物已被廣泛應用以增進人類生活，例如在食品、酒類、藥物、化學工業及農業等方面。這些應用大量地降低生產及/或處理成本以及滿足人類需求。某些微生物生產酶以分解大分子。例如，解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)生產脂質分解酶(脂酶)用以降解橄欖研磨廠污水處理的化學需氧量(chemicaloxygendemand,COD)(Lanciotti，R.，Gianotti，A.，Baldi，D.，Angrisani，R.，Suzzi，G.，Mastrocola，D.andGuerzoni，M.E.UseofYarrowialipolyticastrainsforthetreatmentofolivemillwastewater.Bioresour.Technol.2005.96(3):317-22);銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugenosa)生產堿性蛋白酶用以水解皮革制造工業的主要蛋白固體廢棄物一動物肉質(K麗r，A.G.，Swarnalatha，S.，Sairam，B.andSekaran，G.ProductionofalkalineproteasebyPseudomonasaeruginosausingproteinaceoussolidwastegeneratedfromleathermanufacturingindustries.Bioresour.Technol.2008.99(6):1939-44);及土曲霉(Aspergillusterreus)生產羧甲基纖維素酶(carboxymethylcellulase，CMCase)用以生物降解木質纖維素廢棄物(lignocellulosicwaste)(Emtiazi，G.，Naghavi，N.andBordbar，A.BiodegradationoflignocellulosicwastebyAspergillusterreus.Biodegradation,2001.12(4):257-61)。然而，這些微生物被證明其主要酶功能在于分解一種受質。當處理都市污水中更復雜的成分時，加入多種微生物以降解多種大分子是必要且無可避免的。這將增加成本、降低經濟效益，而且處理過程將更復雜。再者，這些添加的微生物可能相互競爭生長優勢。若一種微生物具有生產多種酶的能力但只能應用于一種領域，此微生物的經濟效益比其他具有產生多種酶的能力及應用于多種領域的微生物低。除了生物降解有機廢棄物，微生物也可生產抗生素以拮抗其他真菌或細菌。一般說來，抗生素是由真菌生產或提取且應用于醫藥方面。然而，植物、果實及動物在成熟及生長時也面臨真菌或細菌感染。傳統的殺真菌劑、殺細菌劑及化學合成藥劑不只抑制真菌及細菌感染，而且危害人體及環境。若細菌被發現能生產生物性的抗生素以抑制真菌或細菌生長，此菌株將有益于農業及畜牧業。近來，由微生物生產的獨特兩親性(amphiphilic)生物性化合物-生物表面活性劑，已在有機及金屬污染地區的復原上顯現出多種潛在的應用(Bodour，A.A.，Drees，K.P.andMaier，R.M.Distributionofbiosurfactant—producingbacteriainundisturbedandcontaminatedaridsouthwesternsoils.Appl.Environ.Microbiol.2003.69(6):3280-7)。生物表面活性劑可降低表面張力、穩定乳化作用及促進泡沫生成，而且通常不具毒性且可生物降解。生物表面活性劑分為糖脂質(glycolipid)及脂蛋白(lipoprotein)兩類，其中脂蛋白包括由芽孢桿菌屬(Bacillussp.)生產的伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)及芬薺素(fengycin)等。生產生物表面活性劑的微生物在碳氫化合物污染區域的生物復原上扮演重要角色。生物表面活性劑也可用于促進油類回收，被認為在環境保護上具有其他應用潛力。其他應用包括殺草劑及殺蟲劑的劑型、清潔劑、保健及化妝品、紙漿與制紙、煤炭、紡織品、陶器處理及食品工業、鈾礦處理及泥碳機械脫水。因此，若微生物被發現能生產多種酶及分子，此微生物將有益于人類的生活及經濟。本發明申請人鑒于現有技術中的不足，經過悉心試驗與研究，并一本鍥而不舍之精神，終構思出本發明「新穎液化淀粉芽孢桿菌菌株及其應用」，篩選出的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1與其他微生物相比較，具有生產上述酶、抗生素及生物表面活性劑的能力，能夠克服先前技術的不足，以下為本發明的簡要說明。
發明內容本發明提出一種篩選出的菌株，其具有特定的16S核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)序列，分類為液化淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensBa-BPD1)，其在德國微生物菌種保藏中心的生物材料樣品保藏編號為DSM21836。此新穎菌株生產具有專一性且有益的酶，例如脂質分解酶用以分解脂質、淀粉分解酶用以水解淀粉、纖維素分解酶用以水解纖維素、及蛋白分解酶用以水解蛋白質。由于有機物質存在于污水中，生產多種酶的新穎液化淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensBa-BPD1)應用于處理污水、水管道系統、動物飼料、廚房垃圾處理，以增進污水中的有機物質分解以及污水、垃圾處理過程的品質及效率。因此，此新穎菌株及其酶可被制作成清潔劑并應用于除污及食品制造。再者，該生產多種酶的新穎液化淀粉芽孢桿菌應用于農業，包括青貯菌劑(silageinoculants)、家畜糞肥處理及動物飼料組成的益生菌(DirectFedMicrobials)。再者，由于其將大分子分解為簡單有機分子的酶活性，篩選出的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1可促進植物生長。此外，由液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1生產的血栓分解酶可水解血栓，以致降低血液中的血栓量，預防及治療心血管疾病、栓塞、動脈硬化、子宮內膜異位及癌癥。因此，血栓分解酶可促進人類及動物的健康。此外，分離出的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產抗生素(包括伊枯草菌素、表面活性素及芬薺素)及表面活性劑。尤其，伊枯草菌素是指伊枯草菌素A及其同源物。伊枯草菌素、表面活性素及芬薺素屬于脂多肽，對預防及治療真菌及/或細菌感染有益，而這些感染的對象為植物、動物及果實。此外，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1生產生物表面活性劑，包括表面活性素、伊枯草菌素及芬薺素，用以抑制植物病原菌及動物病原菌的生長，并具有抗生素生產的潛力。本發明另一目的在于提出新穎菌株_液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1及/或該菌株所生產的抗生素，作為抗真菌劑，用以抑制屬于下列組成群組中至少一種真菌菌屬的生長，該組成群組包括葡萄孢屬(Botrytis)、剌盤孢屬(Colletotrichum)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、鐮刀菌屬(Fusarium)、菌核屬(Sclerotium)、鏈格孢屬(Alternaria)、疫霉屬(Phytophthora)、曲菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)及球二孢屬(Botryodiplodia)。其中，該真菌感染源自下列組成群組的真菌百合灰霉病菌(Botrytiselliptica)、玫瑰灰霉病菌(Botrytiscinerea)、檬果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、舌甘柿膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、水禾舀立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、豌豆尖孢嫌刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.pisi)、番茄尖抱嫌刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)、蘭花嫌刀菌(Fusariumsolani)、蒸枝嫌刀菌(Fusariumsolani)、百合白絹病菌(SclerotiumrolfsiiSaccardo)、蘋果鏈格孢菌(Alternariamali)、甜椒疫病菌(Phytophthoracapsici)、洋蔥黑曲霉菌(Aspergillusniger)、柑桔青霉菌(Penicilliumitalicum)、蓮霧果腐菌(Pestalotiopsiseugeniae)及檬果蒂腐菌(Botryodiplodiatheobromae)。本發明另提出新穎菌株_液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1及/或該菌株所生產的抗生素，作為抗菌劑，用以抑制屬于下列組成群組中至少一種細菌菌屬的生長，該組成群組包括歐氏桿菌屬(Erwinia)、嗜酸菌屬(Acidovorax)、農桿菌屬(Agrobacterium)、伯克氏菌屬(Burholderia)、腸桿菌屬(Enterobactor)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、青枯菌屬(Ralstonia)、黃色單胞菌屬(Xanthomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)及沙門氏菌屬(Salmonella)。其中，該細菌感染源自下列組成群組的細菌菊軟腐歐氏桿菌和胡蘿卜軟腐歐氏桿菌古月蘿卜亞禾中(Erwiniachrysanthemi及Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)、燕麥嗜酸菌瓜類亞禾中(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli)、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、石竹伯克氏菌(Burholderiacaryophylli)、茭白細菌性基腐菌(Enterobactorcloaceae)、楊桃假單胞菌(Pseudomonassyringae)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、根枯饋嫁菌(Xanthomonasaxonopodispv.cirti)、茄科植物細菌性斑點菌(Xanthomonasaxonopodispv.vesicatoria)、十字花禾斗黑腐菌(Xanthomonascampestrispv.compestris)、水禾舀白口十枯菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、錯狀芽抱桿菌(Bacilluscereus)及沙門氏菌(Salmonella)。再者，篩選出的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1作為抑制真菌及/或細菌生長的抗微生物制劑，抗真菌劑抑制屬于下列組成群組中的真菌生長百合灰霉病菌、玫瑰灰霉病菌、檬果炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、甜柿膠孢炭疽菌、水稻立枯絲核菌、豌豆尖孢鐮刀菌、番茄尖孢鐮刀菌、蓮花鐮刀菌、荔枝鐮刀菌、百合白絹病菌、蘋果鏈格孢菌、甜椒疫病菌、洋蔥黑曲霉菌、柑桔青霉菌、蓮霧果腐菌及檬果蒂腐菌。抗菌劑抑制屬于下列組成群組中的細菌生長細菌性軟腐桿菌、燕麥嗜酸菌瓜類亞種、根癌農桿菌、石竹伯克氏菌、茭白細菌性基腐菌、楊桃假單胞菌、青枯病菌、柑桔潰瘍菌、茄科植物細菌性斑點菌、十字花科黑腐菌、水稻白葉枯菌、蠟狀芽孢桿菌及沙門氏菌。表面活性素抑制家畜及食物的病原菌生長，并且預防及/或治療受該病原菌感染的動物或植物。此外，由于對環境無毒及較佳的生物降解特性，表面活性素被廣泛地應用于清潔劑、化妝品、食品、藥物、石化業、農業及環境保護等方面。6根據上述構想，篩選出的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的應用型態為全肉湯培養液(wholebrothculture)、上清液、可濕性粉齊U(wettablepowder)、粒齊U(granule)、水分散性茅立劑(waterdispersiblegranule)、濃縮懸劑(suspensionconcentrateorflowableconcentrate)及微囊形式(microencapsulation)。本發明另一目的在于提出生物材料樣品保藏編號為DSM21836的液化淀粉芽孢桿菌的篩選突變株，其具有特定的16S核糖體序列(SEQIDNO:l)。本發明另一目的在于提出包括具有生物材料樣品保藏編號為DSM21836的液化淀粉芽孢桿菌的組合物。圖1為根據本發明實施例7及8，由液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的伊枯草菌素A及表面活性素的LC/T0F-MS分析圖譜。圖2為根據本發明實施例7，由液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的芬薺素的LC/T0F-MS分析圖譜。具體實施例方式本發明所提出的「新穎液化淀粉芽孢桿菌菌株及其應用」將可由以下的實施例說明而得到充分了解，使得本領域技術人員可以據以完成，然而本發明的實施并非可由下列實施例而被限制其實施型態，本領域技術人員仍可依據除已公開的實施例的精神推演出其他實施例，這些實施例都應當屬于本發明的范圍。實施例1:新穎液化淀粉芽孢,桿菌的特征新穎液化淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensBa-BPD1)是由發明人自臺灣臺中縣梨山的土壤篩選出來，并且進一步培養、鑒定及保存。當培養液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl時，接種其單菌落并過夜培養于6ml的LB培養液(Luria-Bertani，Miller,Difco)。培養后的菌液再以1/100比例接種于500mlLB培養液，于30。C、150rpm培養6天。此外，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl與其他細菌相較，具有特定的16S核糖體RNA序列，其部分的16S核糖體序列被測序，且將于2009年12月31日公開于美國國家生物科技信息中心網站(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI，http://www.ncbi.nlm.gov/Genbank/)，其基因庫(GenBank)序號命名為EF137183。如后所述的該部分16S核糖體序列(SEQIDN0:1)成為液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl特殊及重要的特征。液化淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensBa-BPD1)于2008年9月11日保藏于德國微生物菌種保藏中心(地址德國不倫瑞克D-38124茵霍芬大街7B)，生物材料樣品保藏編號為DSM21836。實施例2:液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的淀粉分解酶為了證明液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl可生產淀粉分解酶(淀粉酶)以水解淀粉，淀粉酶水解測試如下所述。由營養瓊脂培養基(nutrientagar(NA)plate)挑取液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的單菌落并混合于50y1無菌水作為菌液。然后，將此50y1菌液滴在lcm直徑的濾紙上，再放置于酵母提取物_可溶性淀粉瓊脂培養基(yeastextract-solublestarchagar(YSA)plate，含1.0%酵母提取物、1.0%可溶性淀粉及1.5%瓊脂)上。將YSA培養基置于3(TC培養2至3天。培養后，以3至4ml碘液(含0.3%(w/v)碘及3%(w/v)碘化鉀(potassiumiodine))覆滿YSA培養基，于5分鐘內測量液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的菌落大小及溶解圈(clearzone)大小。培養基變成藍黑色表示淀粉未被水解，然而，菌落周圍的溶解圈表示淀粉被水解。三重復的結果顯示菌落直徑及溶解圈大小分別為1.57cm及2.81cm。Ito等人(1998)也證實嗜堿性枯草芽孢桿菌生產堿性胞外清潔酶，包括a_淀粉酶，應用于強效清潔劑及自動洗碗機清潔劑，用以分解污水里的淀粉(Ito，S.，Kobayashi，T.，Ara，K.，0zaki，K.，Kawai，S.andHatada，Y.Alkalinedetergentenzymesfromalkaliphiles:enzymaticproperties,genetics,andstructures.Extremophiles.1998.2(3):185-90)。因此，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1生產的淀粉分解酶可以應用于水解污水、廢棄物、農業及食品業的淀粉。實施例3:液化淀粉芽拘,桿菌Ba-BPDl牛產的蛋白分解酶為了證明液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產蛋白分解酶(蛋白酶)水解蛋白質，蛋白水解測試如下所述。液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的菌液如實施例2所述制備。將50iU菌液滴在lcm直徑的濾紙上，再放置于脫脂乳瓊脂培養基(skimmilkagar(SMA)plate，含1.5%脫脂奶粉、1.3%營養肉湯(nutrientbroth，NB)及1.5%瓊脂)上(Elsheikh，L，E.，Bergman,R.，Cryz，S.J.Jr.andWretlind，B.AcomparisonofdifferentmethodsfordeterminingelastaseactivityofPseudomonasaeruginosastrainsfrommink.ActaPathol.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.B，Microbiol.1986.94(3):135-8)。將此SMA培養基以3(TC培養2至3天，測量液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1的菌落大小及溶解圈大小。菌落周圍的溶解圈表示脫脂乳中的蛋白質被細菌水解。三重復的結果顯示菌落直徑及溶解圈大小分別為1.77cm及3.61cm。Kumar等人(2008)發現銅綠假單胞菌生產堿性蛋白酶，用以水解皮革制造工廠產出的蛋白固體廢棄物(K麗r，A.G.，Swarnalatha，S.，Sairam，B.andSekaran，G.ProductionofalkalineproteasebyPseudomonasaeruginosausingproteinaceoussolidwastegeneratedfromleathermanufacturingindustries.Bioresour.Technol.2008.99(6):1939-44)。此外，Drouin等人(2008)證實地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)生產的蛋白酶對污水污泥具有蛋白水解活性(Drouin，M.，Lai，C.K.，Tyagi，R.D.andSurampalli，R.Y.Bacilluslicheniformisproteasesashighvalueaddedproductsfromfermentationofwastewatersludge:pre_treatmentofsludgetoincreasetheperformanceofth印rocess.WaterSci.Technol.2008.57(3):423-9)。在實施例3中，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的蛋白分解酶也可應用于污水、廢棄物、農業及食品業的蛋白水解，并可制造為清潔劑或洗衣劑的成分。實施例4:液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的纖維素分解酶為了證明液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產纖維素分解酶(纖維素酶)水解纖維素，纖維素水解測試如下所述。液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl菌液如實施例2所述制備。將50ill菌液滴在1cm直徑的濾紙上，再放置于Mandel-Reese(M_R)瓊脂培養基(含1.0%羧甲基纖維素(carboxylmethylcellulose，CMC)、0.1%蛋白胨(p印tone)、0.03%尿素、0.14%(NH4)2S04、0.2%KH2P04、0.04%CaCl2H20、0.03%MgS047H20、5X10—4%FeS047H20、1.4X10—3%ZnS047H20、1.6X10—3%MnS044H20、2X10—4%CoCl26H20及1.5X瓊脂，調整pH至6.0并滅菌)(Mandel，M.andReese，E.T.Inductionofcelluloseinfungibycellobiose.J.Bact.I960.79:816-26)。此M-R瓊脂培養基于3(TC培養2天后，將3至4ml的0.1%剛果紅(CongoRed)覆滿M-R瓊脂培養基30分鐘，再以1M氯化鈉溶液洗去未結合的剛果紅，剛果紅通過氫鍵形成團塊(agglomerate)或膠體(colloid)、再與纖維素結合，而溶解圈的形成表示纖維素未與剛果紅結合。三重復的結果顯示液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1形成的溶解圈直徑為2.3cm。Alam等人(2008)證實哈茨木霉(Trichodermaharzia皿m)生產纖維分解酶用以在污水污泥的生物轉換中水解纖維素(Alam，M.Z.，Muyibi，S.A.andWahid，R.Statisticaloptimizationofprocessconditionsforcellulaseproductionbyliquidstatebioconversionofdomesticwastewatersludge.Bioresour.Technol.2008.99(11):4709-16)。Sangave及Pandit于2006也發表纖維素酶用于蒸餾廠污水的生物降解活性的前處理步驟，以將纖維素轉化為簡單的生物分子(Sangave，P.C.andPandit，A.B.Enhancementinbiodegradabilityofdistillerywastewaterusingenzymaticpretreatment.J.Environ.Manage.2006.78(1):77—85)。由于M_R瓊脂培養基的主要成分是羧甲基纖維素，所以液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl可生產纖維素分解酶以消化纖維素及在消化時顯現透明環是相當明顯的。因此，由于纖維素分解酶的生產及水解活性，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1在處理廢水的纖維素上具有顯著的經濟價值。新穎菌株_液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl可以生產纖維素分解酶，用以水解廢棄物處理的纖維素。實施例5:液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的脂質分解酶為了證明液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1生產脂質分解酶(脂酶)以分解脂質，脂酶水解測試如下所述。首先，接種液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的單菌落于5ml營養液，再以30°C、150rpm培養1天。之后，將5的培養菌液滴在羅丹明B瓊脂培養基(RhodamineBagarplate，含1%橄欖油、0.001%羅丹明B及1.5%營養瓊脂)上，于3(TC培養7天。作為染劑的羅丹明B嵌入脂質，在例如熒光顯微鏡的生物技術應用上作為熒光標志。溶解圈表示脂質被水解，且羅丹明B無法嵌入脂質。因此，實驗結果發現液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1顯現熒光菌落，且菌落周圍的溶解圈直徑為0.6cm。Ertugrul等人于2007年發表枯草桿菌屬生產的脂酶顯現其于分解橄欖研磨廠污水組成、甘油三乙酸酯(triacetin)、聚山梨醇酯80(Tween80)及乳清(whey)等的解脂活性(Ertugrul,S.，D6nmez,G.andTaka^，S.IsolationoflipaseproducingBacillussp.fromolivemillwastewaterandimprovingitsenzymeactivity.J.Hazard.Mater.2007.149(3):720_4)。甚至，固定化的脂酶(immobilizedlipase)被用于具有高油及油脂濃度的污水的水解(Jeganathan，J.，Nakhla，G.andBassi，A.Hydrolyticpretreatmentofoilywastewaterbyimmobilizedlipase.J.Hazard.Mater.2007.145(1-2):127-35)。因此，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1生產的脂質分解酶可應用于污水、廢棄物、農業及食品業的脂質分解。實施例6:液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的血栓分解酶纖維蛋白(fibrin)為負責止血的關鍵性血液成分，已被廣泛地作為組織工程的多功能生物聚合物骨架。單獨的纖維蛋白或與其他材料結合(例如纖維蛋白原(fibrinogen)和凝血酶(thrombin))已被用作干細胞或初生細胞的生物骨架，用以再生脂肪組織、心臟組織、軟骨、肝臟、神經組織、眼球組織、皮膚、肌腱及韌帶，并顯現組織再生及傷口愈合的重大潛力(Ahmed，T.A.E.，Dare，E.V.andHincke，M.Fibrin:aversatilescaffoldfortissueengineeringapplications.TissueEng.PartBRev.2008.14(2):199-215)。然而，若纖維蛋白在血管或心臟凝集為血栓(fibrinclot或thrombus)，將導致心血管疾病或使人致死(Hua，Y.，Jiang，B.，Mine,Y.andMu，W.PurificationandcharacterizationofanovelfibrinolyticenzymefromBacillussp.nov.SK006isolatedfromanAsiantraditionalfermentedshrimppaste.J.Agric.FoodChem.2008.56(4):1451-7)。枯草桿菌屬菌株被證明生產血栓分解酶用以通過自血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)形成具活性的血纖維蛋白溶酶(plasmin)或通過直接血栓溶解(fibrinolysis)分解血栓。因此，由微生物生產的血栓分解酶在組織再生、傷口愈合及性命急救上相當重要。在本發明中，接種液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1的單菌落于5ml營養液，于3(TC培養12小時。離心5ml營養液中的100ill菌液后，將20iU上清液滴入事先以移液管尖頭(tip)在挖出的纖維蛋白瓊脂培養基(fibrinagarplate)的淺洞內，再將該纖維蛋白瓊脂培養基以37t:培養12小時，觀察其溶解圈的形成。結果顯示溶解圈直徑為1.8cm，證實液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1具有生產血栓分解酶以水解血栓的能力，并涉及例如血栓形成(thrombosis)、動脈硬化(arteriosclerosis)、子宮內膜異位(endometriosis)及癌癥的病理狀態。實施例7:液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的伊枯草菌素及芬薺素伊枯草菌素(一種生物表面活性劑)是一種抗真菌脂多肽(antifungallipop印tide)，作為一種具生物活性的微生物二次代謝產物，并顯示具吸引力的抗生素特性(Hsieh，F._C.，Lin，T._C.，Meng，M.andKao，S._S.ComparingmethodsforidentifyingBacillusstrainsc即ableofproducingtheMitifimgallipopeptideiturinA.Curr.Microbiol.2008.56(1):1-5)。枯草桿菌屬生產的伊枯草菌素A(iturinA)與固醇分子在致病真菌(例如立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani))的細胞膜表面形成復合物，以致擴大離子通道大小、改變膜滲透壓，并進一步導致致病真菌的菌絲分解及抑制孢子萌芽。由此達到植物病原菌的抑制效果。因此，伊枯草菌素A及枯草桿菌屬被應用于飼料及/或食物保存，動物及植物的預防及/或治療，可用作工業、農業、環境的生物降解及清除的表面活性素(或生物表面活性劑)，以及作為動物及/或植物感染的抗生素(Mizumoto，S.andShoda，M.Mediumoptimizationofantif皿gallipop印tide，iturinA，productionbyBacillussubtilisinsolid—statefermentetionbyresponsesurfacemethodology.Appl.Microbiol.Biotechnol.2007.76Q):101_8)。請參閱圖1，為根據本發明實施例7，由液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的伊枯草菌素A的液相色譜分析儀/飛行時間質譜儀(liquidchromatogr即hy/time-to-flight-massspectrometry,LC/T0F-MS)分析圖譜。在圖1中，伊枯草菌素A同源物(A2至A8)的分子量鑒定為1043、1057、1065、1079、1095及1119Da，這些伊枯草菌素A同源物及液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1可應用于食品業及農業。芬薺素是另一種由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)生產的具生物活性的脂多肽及抗真菌物質，在枯草芽孢桿菌拮抗葫蘆粉霉菌(Podosphaerafusca，cucurbitpowderymildew)(Deleu，M.，Paquot，M.andNylander，T.Effectoffengycin，alipopeptideproducedbyBacillussubtilis，onmodelbiomembranes.Biophys.J.2008.94(7):2667-79，Romero,D.，deVicente,A.，Rakotoaly，R.H.，Dufour，S.E.，Veening，J._W.，Arrebola，E.，Cazorla，F.M.，Kuipers，0.P.，Paquot，M.andP6rez_Garcia，A.TheiturinandfengycinfamiliesoflipopeptidesarekeyfactorsinantagonismofBacillussubtilistowardPodosphaerafusca.Mol.PlantMicrobeInteract.2007.20(4):430-40)扮演重要角色。如同伊枯草菌素A，芬薺素也應用于飼料及/或食物保存，作為工業、農業、環境的生物降解及清除的表面活性素(或生物表面活性劑)，以及作為動物及/或植物感染的抗生素。請參閱圖2，為根據本發明實施例7，由液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的芬薺素的LC/T0F-MS分析圖譜。在圖2中，芬薺素同源物的分子量鑒定為1449、1463、1477、1491及1505Da，這些芬薺素同源物及液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl可應用于食品業及農業。實施例8:液化淀粉芽拘,桿菌Ba-BPDl牛產的表面活件素表面活性素是一種細菌性環狀脂多肽或表面活性劑，作為抗生素，其兩親性(amphiphilic)特性幫助此物質存在于疏水及親水兩種環境。例如，表面活性素在牛奶中可顯現其對大腸桿菌(Escherichiacoli)的抗微生物活性，以對牛奶殺菌(Huang，X.，Wei，Z.，Zhao，G.，Gao，X.，Yang，S.andCui，Y.OptimizationofSterilizationofEscherichiacoliinmilkbysurfactinMidfengycinusingaresponsesurfacemethod.Curr.Microbiol.2008.56(4):376-81)。Whang等人(2008)證實表面活性素具有對柴油污染的水及土壤的生物降解能力(Whang，L.-M.，Liu，P._W.G.，Ma，C._C.andCheng，S._S.Applicationofbiosurfactants，rh咖nolipid，andsurfactin，forenhancedbiodegradationofdiesel—contaminatedwaterandsoil.J.Hazard.Mater.2008.151(1):155-63)。因此，表面活性素可以作為食品制造及食品保存的殺菌劑，并作為工業、農業、環境的生物降解及清除的表面活性素(或生物表面活性劑)。為了證明液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl可生產表面活性素，大規模的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl菌液及表面活性素制備如下。以3(TC、200rpm培養液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD116小時，培養后的菌液再以1/100比例接種于Cooper's培養基，并于3(TC培養120小時。Cooper's培養基為具有4X葡萄糖的無機鹽類(mineralsalts，含O.05MNH4N03、0.03MKH2P04、0.04MNa2HP04、8.0X10—4MMgS04、7.0X10—6MCaCl2、4.0X10—6MFeS04及4.0X10—6M乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA))。離心移除菌體后，加入濃鹽酸至液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl培養菌液，分離出天然的表面活性素。收集、干燥、以二氯甲烷萃取，在pH2生成沉淀物。以減壓移除二氯甲烷以獲得黃白色固體。以再結晶進一步純化。二氯甲烷萃取物溶解于含有足量氫氧化鈉的無菌水以達到pH8。此溶液進一步以WhatmanNo.1濾紙過濾，并以濃鹽酸滴定至pH2。離心后獲得白色固體沉淀物。此外，精煉的表面活性素購自Sigma公司(Steinheim，Germany)或由枯草芽孢桿菌菌液純化，以作為校正標準品。分離出的表面活性素沉淀物溶解于1ml甲醇，再以活性炭處理，并以0.22iim孔徑的濾紙過濾，過濾液注入高效液相色譜儀(HPLC)的反向管柱(RP-18，5iim，4x250mm;Merck)。該管柱以3.8mM乙月青_三氟乙酸(acetonitrile-trifluoroaceticacid，80:20(v/v))、1.0ml/min的流速洗提，并以210nm波長檢測。表面活性素的濃度以Sigma公司購買的精煉表面活性素作為校正曲線而測定，并以6種表面活性素異構物的總量作為表面活性素的濃度。實驗證明液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的表面活性素濃度為460mg/L。請參閱圖1，為根據本發明實施例8，由液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1生產的表面活性素的LC/TOF-MS分析圖譜。在圖1中，表面活性素同源物的分子量鑒定為1022及1036Da。因此，由液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl生產的表面活性素可應用于食品殺菌、食品保存、生物降解，及工業、農業及環境的清除。實施例9:液化淀粉芽拘,桿菌Ba-BPDl與病原直菌的對峙試驗根據實施例7和8的結果，可知三種脂多肽_伊枯草菌素A、芬薺素及表面活性素可抑制病原真菌及病原細菌的生長。為了確定液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的拮抗病原真菌能力，對峙培養及試驗操作如下。對峙試驗顯示出一種生物對另一種生物的生長抑制。培養液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl及21種真菌。接種液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的單菌落于5mlLB培養液，并以3(TC、200rpm培養7天。在每一片馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potatodextroseagar(PDA)plate)中央放置lcm直徑的真菌菌絲塊(mycelialdisc),再培養于25t:直到長滿，共培養21株真菌。對峙試驗開始時，放置上述lcm直徑的真菌菌絲塊于一片PDA培養基中央，并放置3片9mm直徑濾紙于PDA培養基上，每片濾紙距離真菌菌絲塊邊緣1.8cm，放置在PDA培養基的3片濾紙看似等邊三角形的三個頂點。在實驗組方面，在PDA培養基的每一片濾紙上滴入30的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl菌液；在對照組方面，在PDA培養基的每一片濾紙上滴入30iU無菌水。將這些PDA培養基培養于25t:直到長滿。濾紙周圍將會形成新月形的抑制。紀錄液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl與真菌菌株間的對峙培養，并計算液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1濾紙到真菌菌絲塊間的對峙距離。請參閱表1，為本發明實施例9的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1濾紙與真菌菌絲塊間的平均對峙距離。對峙距離越長，抑制真菌效果越佳。在表l中，可知此21種真菌生長可被液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl有效地抑制，其中液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl與柑橘青霉菌(Penicilliumitalic咖，縮寫為Pil3)間的對峙距離最長(13.5mm)，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1與檬果炭疽病菌(Glomerellacingulata，縮寫為Gc)間的對峙距離最短(3.1mm)。因此，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl對真菌的生長抑制效果被加以證實。實施例10:液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl與病原細菌的對峙試驗另一個液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl與病原細菌間的對峙試驗如下所述。首先，將601待測試的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1滴在營養瓊脂培養基的濾紙上，于3(TC培養24小時。每一待測試的病原細菌均勻噴灑到培養好的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl的營養瓊脂培養基上，再將此培養基以3(TC培養24小時。每一病原細菌進行三重復測試。測定液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1對每一種病原細菌的抑制圈大小。請參閱表2，為本發明實施例10的液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1對病原細菌的抑制圈大小。在表2中，可知液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl可有效抑制這些病原細菌的生長。因此，由這些細菌引起的病原植物及果實疾病被預防、治療或控制。此外，液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl可抑制蠟狀芽孢桿菌(BacilluscereusJSR01)及沙門氏菌(SalmonellaTA100)，而且液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPD1可預防及治療由這些細菌引起的細菌性食物中毒。本發明的新穎液化淀粉芽孢桿菌具有獨特的16S核糖體RNA序列，且可制造多種酶用以分解淀粉、蛋白質、纖維素、脂質及血栓，并可生產抗生素，對病原真菌及病原細菌皆具有顯著的抑制效果，實屬難能的創新發明，深具產業價值，因此依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附權利要求所要保護的范圍。參考文獻1.Ahmed，T.A.E.，Dare，E.V.andHincke，M.Fibrin:aversatilescaffoldfortissueengineeringapplications.TissueEng.PartBRev.2008.14(2):199-215.2.Alam，M.Z.，Muyibi，S.A.andWahid，R.Statisticaloptimizationofprocessconditionsforcellulaseproductionbyliquidstatebioconversionofdomesticwastewatersludge.Bioresour.Techno1.2008.99(11):4709-16.3.Bodour，A.A.，Drees，K.P.andMaier，R.M.Distributionofbiosurfactant—producingbacteriainundisturbedandcontaminatedaridsouthwesternsoils.Appl.Environ.Microbiol.2003.69(6):3280-7.4.Deleu，M.，Paquot，M.andNylander，T.Effectoffengycin，alipopeptideproducedbyBacillussubtilis，onmodelbiomembranes.Biophys.工2008.94(7):2667-79.5.Drouin，M.，Lai，C.K.，Tyagi，R.D.andSurampalli，R.Y.Bacilluslicheniformisproteasesashighvalueaddedproductsfromfermentationofwastewatersludge:pre_treatmentofsludgetoincreasetheperformanceoftheprocess.WaterSci.Technol.2008.57(3):423_9.6.Elsheikh，L，E.，Bergman,R.，Cryz，S.J.Jr.andWretlind，B.AcomparisonofdifferentmethodsfordeterminingelastaseactivityofPseudomonasaeruginosastrainsfrommink.ActaPathol.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.B，Microbiol.1986.94(3):135-8.7.Emtiazi，G.，Naghavi，N.andBordbar，A.BiodegradationoflignocellulosicwastebyAspergillusterreus.Biodegradation，2001.12(4):257-61.8.Ertugrul,S.，Dd歸ez,G.andTakas,S.IsolationoflipaseproducingBacillussp.fromolivemillwastewaterandimprovingitsenzymeactivity.J.Hazard.Mater.2007.149(3):720-4.9.Hsieh，F._C.，Lin，T._C.，Meng，M.andKao，S._S.Comparingmethodsforidentif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12或14所述的用途，其特征在于，該菌株的型態用于全肉湯培養液、上清液、可濕性粉劑、粒劑、水分散性粒劑、濃縮懸劑及微囊形式。17.—種如權利要求1所述的菌株的突變株，其中該突變株具有序列為SEQIDN0:1的16S核糖體RNA序列。18.—種包含液化淀粉芽孢桿菌Ba-BPDl菌株的組合物，其中該液化淀粉芽孢桿菌菌株具有生物材料樣品保藏編號DSM21836。全文摘要本發明涉及一種新穎液化淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensBa-BPD1)(德國微生物菌種保藏中心，生物材料樣品保藏編號DSM21836)，其具有命名為SEQIDNO1的獨特16S核糖體RNA序列，且可制造淀粉分解酶、蛋白分解酶、纖維素分解酶、脂質分解酶及血栓分解酶以顯示其生物降解活性。該液化淀粉芽孢桿菌還可生產抗生素，例如伊枯草菌素、芬薺素及表面活性素，用以抑制真菌或細菌生長。本發明的新穎液化淀粉芽孢桿菌及其產物可應用于農業、污水處理、食品業及化學工業。文檔編號C12P21/06GK101748078SQ200810182428公開日2010年6月23日申請日期2008年12月5日優先權日2008年12月5日發明者謝奉家,高穗生申請人:農業藥物毒物試驗所