核酸的定量方法

專利名稱：核酸的定量方法
技術領域：
本發明涉及DNA和RNA的定量分析方法。
背景技術：
基因的表達量的調查，在醫藥開發或疾病的因果關系的調查上是很重要的 事項。但是，以DNA為中心的生物領域中，多數情況是，作為靶物質的DNA 的拷貝數通常很少，要將其擴增來計測，對于正確求得其拷貝數的需求正在增 大。
作為現在使用的代表性的DNA定量方法，可以舉出(1)電泳法、(2) DNA微陣列法(專利文獻l)、 (3)實時定量PCR法(非專利文獻l) 3種。 其中，電泳法是，電泳分離帶負電的DNA,將分離的標準試樣和靶試樣的帶 染色，調查其強度比的定量方法。該方法的解析成本低，但缺點是定量精度低。
DNA微陣列法是，使以不同熒光體標記的靶試樣和標準試樣，與固定有 具有互補序列的低聚核苷酸或cDNA的DNA芯片竟爭雜交，調查熒光強度比 的定量方法。該方法能夠一次定量多達數萬個基因，但得到的熒光強度比容易 受到基因序列的2級結構和交叉雜交的影響。所以，該方法的缺點是定量精度 差，并且解析(裝置、DNA芯片、試劑)需要高額費用。
另一方面，實時定量PCR法是， 一邊同時PCR擴增靶試樣和標準試樣， 一邊觀測試樣發出的熒光，由PCR產物達到一定量時的PCR循環數來定量初 始存在的靶試樣的量的方法。作為調查PCR產物的手段，有使用SYBR GREEN 的嵌入劑(intercalate!")法、或使用基因特異性探針的所謂TaqMan探針法。 所謂該TaqMan探針，是通過DNA探針連接消光原子團和熒光原子團得到的 物質，最初其自身不發出熒光，但隨著PCR擴增的進行，探針部分分解，游 離的熒光原子團發出熒光。該方法的定量精度比較高，^f全測下限也低至幾分子 的程度。但是，實時監測PCR擴增過程，需要昂貴的裝置，并且在解析前必 須制作具有相同序列的標準試樣的稀釋系列(至少5個不同濃度)，每次必須與靶試樣同時進行實時解析，存在操作煩瑣、需要時間和勞動力的問題。
專利文獻1:日本特開2004-33160號公報
非專利文獻1: Higuchi R， et al, Bio. Techology, 10: 413-417, (1992)

發明內容
發明要解決的問題
本發明的課題是，提供克服以往的DNA定量方法的缺點的新型簡便的 DNA定量法。
解決問題的手段
為了解決上述問題，本發明中，使用3'末端附近加入單堿基錯配(單堿基 置換)的引物來擴增作為定量對象的靶DNA的一部分，制備具有與耙DNA 1'又有1石威基序歹。不同的序歹'j的"才示準DNA i式才羊"。才示〉偉DNA是向輩巴DNA的至 少一部分(例如作為解析對象的區域)導入了單堿基錯配的DNA。
將一定量的制備好的標準DNA試樣與靶DNA試樣混合。PCR擴增該混 合的DNA試樣后，進行定量分析，這時使用的PCR引物按照標準試樣制成時 導入的單堿基置換部分被包含在擴增區域中來設計。通過PCR擴增的區域的 序列為，除人為導入的單堿基置換部分以外全部是相同的序列，靶DNA和標 準DNA可以在保持其比例的狀態下同時進行擴增。
得到的擴增產物單鏈化后，計測單堿基置換部分的堿基的存在比，由加入 的標準DNA試樣的量和該存在比求出耙DNA的量。單堿基置換部分的存在 比如下計測進行使用終止子ddNTP的互補鏈合成反應，將作為該反應的副 產物的焦磷酸轉換為ATP,檢測以ATP為底物的熒光素酶引起的發光。互補 鏈合成反應所使用的探針是按照其3'末端在置換部分前一個部位來設計的。 即，最初獲取的核酸底物的模板為單堿基置換部分的堿基種類。
互補鏈合成所使用的4種核酸底物為ddATP、 ddCTP、 ddGTP和ddTTP， 這些順次加入反應槽，觀察發光。這里，預先測定各ddNTP對于一定量的模 板的發光強度，確定各堿基間的發光強度比。從而，通過比較對各核酸底物的 發光強度，來得知置換部分的堿基的存在比(即，標準DNA和靶DNA的存 在比)，可以由標準DNA試樣的量來定量分析靶DNA。
即，本發明涉及核酸的定量方法，所述方法包括(l)在靶DNA試樣中混合一定量的標準DNA試樣的工序，所述標準DNA試樣是在所述耙DNA的 至少一部分中導入單堿基置換而得到的；(2)使用引物擴增混合后的試樣的工 序，所述引物被設計成用于擴增包含所述單堿基置換部位的區域；(3)將擴增 后的試樣單鏈化，使其與結合于所述單堿基置換部位前一個部位的探針雜交， 將ddATP、 ddGTP、 ddCTP、 ddTTP—種一種地順次加入，進行互補鏈合成反 應的工序；(4 )通過熒光素酶反應檢測來自所述互補鏈合成反應中生成的焦磷 酸的發光的工序；(5)由檢測的發光量和所述標準DNA試樣的量來定量靶 DNA的工序。
某實施方式中，對置換堿基不同的多個標準DNA試樣進行所述(1 ) ~ ( 5 ) 的工序。另外，在別的實施方式中，對濃度不同的多個標準DNA試樣進行所 述(i) (5 )的工序。
本發明的方法中，通過對PCR擴增所使用的引物預先進行生物素標記， 使得可以使用鏈霉親和素結合微珠來精制擴增產物。
作為靶DNA試樣，可以使用由mRNA逆轉錄得到的cDNA試樣等。如 果預先向靶DNA附加錨定序列，則可以使用在該錨定序列中導入有單堿基置 換的引物來制備標準DNA試樣。
本發明的方法中，靶DNA和標準DNA可以是游離的狀態，也可以是被 固定在固相表面的狀態。例如，如果將靶DNA試樣固定于-茲微珠，則可以容 易地進行其精制、再利用。
發明的效果
根據本發明，使用靶DNA試樣的一部分，通過PCR擴增，可以簡單地制 作標準DNA。定量分析中利用的是利用了熒光素酶反應的發光反應，但互補 鏈合成中使用的ddNTP與dNTP (特別是dATP)不同，不作為熒光素酶反應 的反應底物，因此沒有背景發光，并且因為沒有獲取2堿基以上的核酸底物， 因此可以正確測定。進而，由于發光量與DNA量成線性比例，因此能夠進 行精度高的定量。另外，由于可以獨立進行PCR擴增和發光反應的計測，因 此本發明中使微量的試樣DNA大量PCR擴增后，可以高效進行分析。順便說 一下，本發明中，從加入ddNTP后開始到計測結束為止需要的時間為數分鐘， 與實時定量PCR相比，可以在短得多的時間內進行定量分析。如后所述，如
5果準備濃度不同的多種標準DNA試樣，則能進行更精確的定量。因為發光的 計測中可以使用將廉價的照度計改造而得到的儀器、或者具備光二極管的廉價 的光檢測器，不需要焚光探針等昂貴的試劑，因此整體上廉價的定量分析成為 可能。
即，對于以往方法中難以實現的(i)高定量精度、(ii)廉價的解析裝置、 (iii)低試劑成本、(iv)筒便的解析操作，根據本發明，全部可以實現。


圖1是本發明的方法的基本程序。 圖2是靶DNA試樣的結構。
圖3是靶DNA試樣和標準DNA試樣的混合以及PCR擴增。 圖4是單堿基延伸和發光強度的測定。 圖5是發光強度信號的算出。
圖6是發光強度比的算出(使用3種標準DNA的情況)。
符號說明201mRNA
202cDNA
203要解析的DNA擴增區域
204反向引物引發部位
205正向引物引發部位
301耙DNA試樣
302標準DNA ( A )
303標準DNA (B )
304標準DNA ( C )
305混合試樣
306正向引物E
3075'末端生物素標記反向引物F
401PCR擴增后單鏈化的靶DNA試樣
402PCR擴增后單鏈化的標準DNA (A)
403PCR擴增后單鏈化的標準DNA (B)C )
405 單堿基延伸用探針
501 最初投入ddNTP時得到的發光強度的峰
502 第二次投入ddNTP時得到的發光強度的峰 501 發光強度信號
601 由3種標準DNA (A) (B) ( C )做出的標準曲線
602 對應于耙DNA試樣的分子數
具體實施例方式
以下概述本發明的分析方法的基本程序。并且，本發明的方法的概略如圖 1所示。
(1) ddNTP的發光強y復比的測定
預先測定各ddNTp (ddATP、 ddGTP、 ddCTP和ddTTp)相對于一定量的 靶DNA試樣的發光強度，確定這4種堿基間的發光強度比。
(2) 靶DNA試樣與標準DNA試樣(已知濃度)的混合 標準DNA試樣如下制備。首先，準備用于制備標準DNA的引物組。引
物雜交于靶DNA的5'側和3'側。這些引物所夾的區域是擴增區域。引物的至 少一方在從3，端開始的第3~10堿基中具有與靶DNA不同的堿基(置換堿基)， 從該置換堿基開始的5，側的引物序列設計為至少16堿基以上。分取耙DNA 試樣的一部分，使用上述引物進行PCR擴增，從而制備標準DNA試樣。標準 DNA試樣單鏈化并精制后，根據吸光度對其量進行定量。將一定量的定量后 的標準DNA試樣與靶DNA混合。
(3) PCR擴增
使用不含從置換堿基開始的3'側的序列(即，比標準DNA試樣的制備中 所使用的引物短、不含置換堿基部分)的引物，同時擴增混合的靶DNA試樣 和標準DNA試樣。靶DNA試樣和標準DNA試樣在擴增對象區域中，除置換 堿基部分以往，為相同序列，因此PCR擴增率相同。
(4) 延伸用探針的雜交 將靶DNA和標準DNA的擴增產物精制后，進行單鏈化，加入延伸用探
針和DNA聚合酶。這里，在可能殘留擴增用PCR引物的情況下，加入DNA
7聚合酶和ddNTP，封閉有助于互補鏈合成的3'末端，然后再次進行精制。 (5 )單堿基延伸和發光計測
順次加入4種ddNTP進行單堿基延伸，計測熒光素酶反應所引起的發光。 這里，延伸用探針設計為與單堿基置換部分的3'側雜交。從而，單堿基延伸反 應中獲取的核酸底物ddNTP的種類不同。發生單堿基延伸，ddNTP被獲取而 生成焦磷酸，其轉化為ATP,帶來由焚光素酶所反應引起發光。即，得到的發 光強度與生成的焦磷酸的量成比例。由于靶DNA和標準DNA中獲取的堿基 種類不同，因此由發光量的比例以及標準DNA試樣的量可以對靶DNA的量 進行定量。
以下，通過實施例具體說明本發明，但本發明不限于這些實施例。 實施例1
第1實施例是對人大腸癌細胞(HCT116)中的EFF1G基因的表達量進行 定量的例子。
按照程序1由人大腸癌mRNA( 201 )制備包含作為耙的區域的全長cDNA (202)。 cDNA很長，包含作為定量分析的輩巴要解析的DNA序列區域(203)。 靶序列是序列表所示的序列號1的序列。該序列如圖2所示，包含反向引物引 發部位(204)、.要解析的擴增區域(203)和正向引物引發部位(205)。
分取cDNA試樣的一部分，按照程序2制作包含單堿基置換部分、具有與 靶相同序列的單鏈DNA片段。本實施例中，設計為從正向引物的3'末端開始 的第7堿基包含置換部分，但當然不限于此。這里所示的例子是，制作3種對 應于靶DNA的包含單堿基置換的標準DNA片段，將它們以不同的量加入靶 中。靶DNA的量與標準DNA的量越接近，定量精度越高。因此，以3梯度 的濃度加入標準DNA試樣，其中之一成為4妄近靶的量的標準DNA試樣，乂人 而可以更高的精度進行定量分析。
將一定量的這里制作的標準DNA試樣加入靶DNA試樣中。接照程序3 對混合試樣進行PCR擴增。PCR引物序列均相同，擴增區域僅l堿基不同， 所以能夠以幾乎相同的效率擴增靶DNA和標準DNA試樣。PCR擴增使用的 引物由于位于導入的單堿基置換部分的外側(5'側)，因此引物序列中不包含 置換部分。擴增后，進行精制，得到單鏈DNA。這是在靶DNA和一定量的標準DNA試樣在保持最初的存在比的形態下擴增出的拷貝數。
將得到的DNA試樣、DNA聚合酶、用于將焦磷酸轉化為ATP的酶(ATP 硫酸化酶(ATP sulfiuylase )或PPDK)、熒光素酶以及這些酶反應底物與緩沖 溶液一起加入反應槽，充分攪拌。順次加入核酸底物ddNTP，測定得到的發 光強度。以標準DNA試樣的量為縱軸、以發光強度為橫軸作圖，得到標準曲 線。由該圖以及以靶DNA為模板的l堿基互補鏈合成得到的發光強度，可以 知道靶DNA的量(圖6)。核酸底物ddNTP中有時含有ATP、焦磷酸，有時 即使不發生互補鏈合成，也會得到發光信號。為了消除這些的影響，計測后再 次加入ddNTP，測定背景發光，以其差為發光量，可以得到高精度的結果。 程序1:靶DNA試樣的制備
4吏用RNeasy Midi試劑盒(RNeasy Midi Kit, QIAGEN么、司)，從約106 細胞左右的人大腸癌細胞(HCT116 )提取.精制總RNA (約400ng/|iL、 25pL、 總計IO嗎)。向放在冰上的PCR管添加總RNA 2.5pL (約1 ju g )、寡聚(dT) 20引物(50|liM ) lpL、 dNTP混合物(各10mM) l(iL和滅菌水8.5pL，并混合。 為了破壞RNA的高級結構，雜交寡聚(dT)2o引物，使用擴增儀(ABI公司) 在65°C加熱5分鐘。將相同PCR管再次放在水上，添加5x第 一鏈緩沖液(5xFirst Strand Buffer) ( 250mM Tris-HCl (pH 8.3 ), 375 mM KC1, 15 mM MgCl2) 4(iL、 DTT (0.1 M) lpL、 RNase OUT (核酸酶抑制劑)(40 unit/(^L、 Invitrogen公 司)IjiL和Super Script III (200unit/|iL、 Invitrogen7^司)lj^L,并混合。將其用 擴增儀在50。C加熱50分鐘，進行逆轉錄反應。接著，為了使逆轉錄酶失活， 在70。C加熱15分鐘。為了除去mRNA,將cDNA單鏈化，而添加RNase H( RNA 酶H) (2unit/pL) 1jiL，用擴增儀在37。C加熱20分鐘。從而，從來自人大腸 癌細胞的總RNA( l嗎)得到單鏈cDNA21^L。進而，用滅菌水將該cDNA 稀釋5xl()3倍，作為靶DNA試樣(5mL )(來自總RNA 10pg的cDNA/^L )。
程序2:標準DNA (單鏈)的制備
準備如下引物以3'末端的第7堿基對與其不同的作為模板的靶序列的堿 基種類進行置換的3種5'末端生物素標記正向引物A (序列號2)、 5'末端生 物素標記正向引物B (序列號3)、 5，末端生物素標記正向引物C (序列號4) 和反向引物D (序列號5)。首先，將3個PCR管(管A、 B和C)放在冰上，分別添加滅菌水29jxL、 xlO PCR緩沖液10pL、 dNTP混合物(各2.5 mM )10pL、 x5 Q溶液(Q-solution )20 pL、反向引物D( 10|iM)(序列號5 ) 10pL、 Taq DNA 聚合酶(5 unit/pL、 QIAGEN公司)lpL和靶DNA試樣IO)liL。進而，向管A 添加5'末端生物素標記正向引物A ( 10pM) 10pL,向管B添加5'末端生物素 標記正向引物B (10|xM) 10|iL，向管C添加5'末端生物素標i己正向引物C
(lOpMMOpL,分別使其充分混合。使用擴增儀，將它們在94°C1分鐘—(94°C 30秒鐘、58。C30秒鐘、72°C 1分鐘)x50循環—72°C7分鐘加熱，進行PCR 擴增，得到3種雙鏈PCR產物A、 B和C。接著，為了除去試樣中殘留的dNTP 和PCR引物，使用QIAquickPCR產物純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit， QIAGEN公司)，對各PCR產物進行精制(50jxL )。用吸光光度計測定各 DNA濃7復，確^人均為約1 [xg/[iL 。
向這些的PCR產物A、 B和C添加lx結合漂洗緩沖液(5 mM Tris-HCl
(pH7.5)、 0.5mMEDTA、 lMNaCl) 150jaL，稀釋為200jxL。另夕卜，向1.5mL 管收集鏈霉親和素包被的磁微珠(直徑lpm、 107個/^、 DYNAL BIOTECH 公司)600iiL,使磁鐵接近管來捕捉磁微珠，除去上清。用結合漂洗緩沖液600jiL 洗滌磁微珠3次后，懸濁于相同溶液600^L中。向各PCR產物試樣添加該磁 微珠懸濁液各200[xL,用轉子(600rpm，室溫)充分攪拌60分鐘，通過鏈霉 親和素-生物素結合使PCR產物結合在磁微珠表面上。為了除去沒有與磁微珠 結合的過剩的PCR產物，用磁鐵捕捉磁;敞珠，除去上清，用結合漂洗緩沖液 200pL進行2次微珠的洗滌。接著，將結合有PCR產物的磁微珠分別懸濁在 0.1NNaOH300jxL中，在室溫靜置5分鐘。用磁鐵捕捉磁微珠，將上清分別采 集在新的管中。向該上清分別添加1M Tris (pH 7.5 ) 60pL和0.1% Tween (pH 7.5 )300pL，進行中和。向各試樣添加苯酚氯仿異戊醇(25:24:1 、v/v、Invitrogen 公司)lmL,渦旋3分鐘后，離心(15000 rpm、 5分鐘、室溫)(苯酚'氯仿精 制)。將分離溶液的上層分別采集在新管中(約650pL)，使用QIAquickPCR 產物純化試劑盒進^f亍精制濃縮(約250pL)。進而，向這些試樣中添加醋酸鈉
(3M)25|iL、乙醇(99.5%, -30°C ) 625|iL，在-8(TC冷凍15分鐘后，離心
(15000 rpm、 15分鐘、4°C )。向各試樣添加乙醇(70%, -30°C ) 180fiL，離 心(15000 rpm、 5分鐘、4'C ),除去上清(乙醇沉淀精制)。使顆粒千燥后，
10懸濁于滅菌水IOjiL中，用吸光光度計測定DNA濃度，確認均為約2嗎4iL(約 2xlO^分子/^iL)。用滅菌水將其稀釋，制成標準DNA(A)(序列號6)約1000 分子4iL、標準DNA (B )(序列號7 )約500分子&L和標準DNA ( C )(序列 號8 )約100分子/^L各lmL。這些標準DNA是相對于耙DNA僅單堿基被取 代的單鏈DNA。
程序3:靶DNA試樣和標準DNA試樣的混合以及PCR擴增 在放在冰上的管中添加無單堿基置換的序列即靶DNA試樣10|liL (301 )、 標準DNA( A) (302 )、 (B ) ( 303 )和(C ) ( 304 )各10|iL,制成混合試樣(305 )。 向其中混合滅菌水U6pL、 xlOPCR緩沖液40pL、 dNTP混合物(各2.5mM ) 40pL、 x5 Q溶液(Q-solution ) 80jiL、正向引物E (序列號9 ) (10pM) (306 ) 40fiL、 5,末端生物素標4己反向引物F( 10|iM)(序歹il號5 )( 307 )40|iL、 Taq DNA 聚合酶(5unit/pL、 QIAGEN公司)4pL。使用擴增儀，將它們在94。C1分鐘 —(94。C30秒鐘、58。C30秒鐘、72°C 1分鐘)x50循環—72°C7分鐘加熱， 進行PCR擴增。由于是使用位于標準DNA (A) (B) (C)所含的人為導入的 單堿基置換部位的外側的引物進行PCR擴增，因此混合試樣中存在的4種模 板以相同效率擴增。即，PCR擴增后的試樣內的4種模板比例與擴增前保持 相同。為了除去PCR產物400pL中殘留的dNTP和PCR引物，使用QIAquick PCR產物純化試劑盒對PCR產物進行了精制(500pL)。用吸光光度計測定各
DNA濃度，確認約為100ng/pL。 程序4:單鏈化
向得到的PCR產物中添加lx結合漂洗緩沖液500^L。另外，向1.5mL管 中收集鏈霉親和素包被的磁微珠500ML，使磁鐵接近管來捕捉磁微珠，除去上 清。用結合漂洗緩沖液500nL洗滌磁微珠3次后，懸濁于相同溶液500fiL中。 將該磁微珠懸濁液500pL添加到PCR產物試樣中，用轉子(600rpm,室溫) 充分攪拌60分鐘，通過鏈霉親和素-生物素結合使PCR產物結合在磁微珠表 面。為了除去沒有與磁微珠結合的過剩的PCR產物，用磁鐵捕捉磁微珠，除 去上清，用結合漂洗緩沖液500pL進行2次微珠的洗滌。接著，將結合有PCR 產物的磁微珠分別懸濁在0.1N NaOH 450|iL中，在室溫靜置5分鐘。用磁4失 捕捉磁微珠，將上清分別采集在新的管中，添加lMTris(pH7.5)90^iL和0.10/0Tween (pH7.5) 450|iL，進行中和。進而，添加苯酚氯沐異戊醇(25:24:1、 v/v) 1 mL，渦旋3分鐘后，離心(15000 rpm、 5分鐘、室溫)(苯酚.氯仿精 制)。將分離溶液的上層采集在新管中(約90(^L)，使用QIAquickPCR產物 純化試劑盒進行精制濃縮(約250^L)。進而，向這些試樣中添加醋酸鈉(3M) 25pL、乙醇(99.5%,曙30。C ) 625pL,在-80。C冷凍15分鐘后，離心(15000 rpm、 15分鐘、4°C)。添加乙醇(70%, -30°C) 180|aL,離心(15000 rpm、 5分鐘、 4°C),除去上清(乙醇沉淀精制)。使顆粒干燥后，懸濁于滅菌水lOOpL中， 用吸光光度計測定DNA濃度，確認約為150ng/nL (約5xl011分子/^iL )。 程序5:單堿基延伸引起的化學發光的測定
對單鏈化的PCR擴增物8pL (401、 402、 403和404),混合單堿基延伸 用探針(50pM、序列號10) (405 ) 3pL、 IOx雜交緩沖液(100 mM Tris-乙酸 酯、20mMMg-乙酸酯、pH7.75) 3^L和滅菌水16(iL。用擴增4義，將該混合 溶液在92。C加熱30秒鐘、50。C加熱3分鐘，冷卻至4°C。向該溶液4pL中混 合120jiL的發光試劑(0.065 U/|iiL測序酶、100 mM Tricine、 2mMEDTA、 20 mMMg-乙酸酯、33.8 U/ml PPDK-E、 523.0 GLU/ml熒光素酶(LUC-H)、三 磷酸腺香雙磷酸酶(apyrase ) 1.5U/ml等級VI、0.4mM熒光素、0.04 mM PEP 、 0.2 mM AMP、 0.10°/。 BSA、 2 mM DTT， pH 7.75 ),在30。C孵育1分鐘。各30^L 分注到4連管中，添加用PPase預先分解了 PPi的ddNTP ( IOOjiM )各0.5pL, 進行發光4全測(測定時間l分鐘)。接著，添加相同量的ddNTP,再次進行 發光檢測(測定時間1分鐘)(圖4 )。
圖5顯示了如此得到的發光強度的時間變化。這里，曲線圖的縱軸表示發 光強度(V)，才黃軸表示經過時間。如圖5所示，伴隨著2次的ddNTP添加， 出現2個發光強度峰501和502。 501是最初4殳入ddNTP時的峰，502是第2 次投入ddNTP時得到的峰。由于第2次的峰502對應于背景發光，因此發光 強度信號是這些峰的差，即503。
對于混合有30(iL的發光試劑的4種標準DNA lpL (2xl0^分子)，測定 發光強度信號，根據與來自ddATP的信號值相對的4種標準DNA的發光強度 信號得到延伸強度比(表l的中行)。通過用這些數值來除發光強度信號值， 校正堿基種類不同引起的延伸度的差。表l的上行表示校正前的發光信號值，下行表示校正后的信號值。為了使用該校正后的信號值，對靶DNA試樣的分 子數進行定量，制作如圖6所示的標準曲線601。曲線圖的橫軸是發光強度信 號值(校正后)，縱軸為PCR擴增前的標準DNA的分子數，進行作圖。接著， 通過由靶DNA試樣得到的發光強度信號值(校正后)，使用標準曲線601,得 到如箭頭602所示的對應于靶DNA試樣的分子數(15500 )。該值與已知量的 靶分子數15000幾乎一致，可以確認能夠十分精確地進行定量。
表1發光強度信號的校正
ddNTP種類ddTTPddCTPddGTPddATP
發光強度信號7.324.222.000.37
延伸強度比1.24Ul1.031.0
發光強度信號 (校正后)5.903.801.940.37
表2顯示，僅1種標準DNA與靶DNA試樣混合時的靶DNA試樣的分子 數的定量結果。表2的上行表示向靶DNA試樣添加的PCR擴增前的標準DNA 分子數。中行表示靶DNA試樣相對于混合時的各標準DNA的發光強度信號 比。下行表示由此推定的靶DNA試樣的分子數(分別為15500、 15200和 15900)。這時，靶DNA試樣分子數為15000,可以得到良好的定量精度。
表2發光強度比的算出
標準DNA種類標準DNA (A)標準DNA ( B )標準DNA ( C)
PCR擴增前的標 準DNA分子數1000050001000
混合試樣發光強 度比1.553.0415.9
定量值(分子數)155001520015900
實施例2
第2實施例是對在寡聚(dT) 3o磁微珠上逆轉錄mRNA得到的靶DNA試 樣進行定量的例子。
與實施例l相同，定量的是人大腸癌細胞(HCT116)中的EFF1G基因的 表達量。本實施例中，按照程序1從大腸癌細胞制備的RNA是最初的材料。 使用按照程序6準備的寡聚(dT) 3o固定化磁微珠制備cDNA。 cDNA的制備 如程序7所示。按照程序2制備3種標準DNA試樣。以不同比例將這些標準
13DNA試樣與靶DNA試樣混合，按照程序8使用相同引物進行PCR擴增。將 該擴增產物單鏈化(與實施例1的程序4操作相同)，按照程序5進行單堿基 延伸引起的發光測定，進行靶DNA試樣的定量分析。 程序6:寡聚(dT) 30固定化磁孩i珠的制備
將表面包被著鏈霉親和素的磁微珠(直徑lpm、 107個/(^、 DYNAL公司) 充分懸濁，將100pL(含磁微珠109個)采集到1.5mL管中。使,茲4夾接近1.5mL 管來捕捉磁微珠，除去上清。進而，用結合漂洗緩沖液100pL使磁微珠再懸 濁，用磁鐵捕捉磁微珠后，除去上清，從而洗滌磁微珠。該洗滌操作反復進行 3次。另一方面，向在5，末端修飾2分子生物素，接著含有6個-友作為間隔序 列的寡聚(dT) 3o (100 pmolVL) 6.67pL中加入結合漂洗緩沖液，制成寡聚 (dT) 30稀釋液400jiL ( 1.67 pmoi/fiL、 4、有4.0 x 10!4分子)。將該寡聚(dT) 30稀釋液400]iL與洗凈的》茲微珠混合，用轉子充分攪拌60分鐘，利用鏈霉親 和素-生物素結合，使寡聚(dT) 3o結合于磁微珠表面。為了除去沒有與磁微 珠結合的過剩的寡聚(dT) 3Q，用磁鐵捕捉磁微珠，除去上清，用結合漂洗緩 沖液進行2次微珠的洗滌。進而，為了除去RNase,用溶液A ( O.lNNaOH、 0.05MNaCl、 DEPC處理)洗滌2次，用溶液B (O.lMNaCl、 DEPC處理)洗 滌1次后，添加100pL滅菌水，制成固定有寡聚(dT)3Q的磁微珠懸濁液(lx107 個/liL,推定寡聚(dT) 30固定數約2.0xl()s分子/l個磁微珠)。
程序7:使用寡聚(dT) 3o固定化磁微珠的單鏈cDNA試樣的制備 使用RNeasy Midi試劑盒(QIAGEN公司)，從約106細胞左右的人大腸 癌細胞(HCT116)提取精制總RNA (約400ng/pL、 25pL、總計10嗎)。將其 用滅菌水稀釋至約100pg/pL的濃度。向放在冰上的PCR管添加總RNA l(iL (約100ng)、寡聚(dT) 3o固定化磁微珠l(iL ( lx107個/pL )、 dNTP混合物 (各10mM) l(iL和滅菌水20pL,并混合。為了使磁微珠上的寡聚(dT) 30 引物與mRNA聚腺苷酸尾雜交，使用擴增儀(ABI公司)在70。C加熱55分 鐘。將相同PCR管再次放在冰上，添加5x第一鏈緩沖液(250mMTris-HCl (pH 8.3 ) ， 375 mM KC1, 15 mM MgCl2 ) 6|iL、 DTT ( 0.1 M) lpL、 RNase OUT ( 40 unit/(iL、 Invitrogen公司)lpL和Super ScriptIII (200unit/(xL、 Invitrogen公司) l|iL,并混合。將其用擴增儀在50。C加熱50分鐘，進行逆轉錄反應。接著，為了使逆轉錄酶失活，在85。C加熱3分鐘。為了除去mRNA,將cDNA單鏈 化，而添加RNaseH (2unit/(iL) lpL,用擴增儀在37。C加熱20分鐘。使磁鐵 接近PCR管，捕捉固定有cDNA的磁微珠，除去舍有殘留試劑的上清。進而， 用洗滌液(1 OmM Tris， 0.1 %Tween20) 50^iL洗滌該石茲孩O朱2次，再懸濁于相 同溶液10pL。從而，從來自人大腸癌細胞的總RNA ( lOOpg),得到固定于磁 微珠表面的靶DNA試樣(單鏈cDNA )。
程序8:靶DNA試樣和標準DNA的混合以及PCR擴增 向如上所述固定于磁微珠的耙DNA試樣lO^L中，添加如程序2制備的 標準DNA(A)(序列號6)、標準DNA(B)(序列號7 )和標準DNA ( C )(序 列號8 )各10^L，制成混合試樣。在該混合試樣中，添加滅菌水116pL、 xlO PCR 緩沖液40fiL、 dNTP混合物(各2.5mM) 40jiL、 x5 Q溶液(Q-solution) 80jiL、 正向引物E (序列號9 ) ( 10|iM) 40pL、 5'末端生物素標記反向引物F ( 10pM) (序列號5)40pL、 TaqDNA聚合酶(5unit/^L、 QIAGEN公司)4pL，進行 混合。使用擴增儀，將它們在94°C1分鐘~>( 94°C 30秒鐘、58°C 30秒鐘、72°C 1分鐘)x50循環—72。C7分鐘加熱，進行PCR擴增。由于是使用設計成位于 標準DNA (A) (B) ( C)所含的單堿基置換部位的外側的引物進行PCR擴增， 因此混合試樣中存在的4種模板以相同效率擴增。即，PCR擴增后的試樣內 的4種模板比例與擴增前保持相同。使磁鐵接近管，將含PCR產物的上清采 集到另外的管中。為了也采集在殘留的磁微珠上合成的PCR產物，用0.1N NaOH 10pL洗滌該》對敬珠，將洗滌液于剛才采集的上清混合。為了除去在該 PCR產物410pL中殘留的dNTP和PCR引物，使用QIAquickPCR產物純化試 劑盒對PCR產物進行了精制(500pL)。用吸光光度計測定各DNA濃度，確 認約為100ng4iL。按照程序4，進行試樣的單鏈化后，按照程序5，進行單堿 基延伸引起的化學發光的測定，進行靶DNA試樣的定量解析。 實施例3
實施例3是，再利用磁微珠固定化cDNA,對人大腸癌細胞(HCT116) 中的EFF1G基因的表達量進行定量的例子。
如實施例2所示，以固定于磁微珠上的單鏈cDNA的形態得到解析對象時， 以固定的cDNA為模板進行第二鏈cDNA合成，除去引物等后使合成的互補鏈游離在溶液中，能夠使用其作為定量分析靶。以不同的比例，在互補鏈合成
的試樣中添加3種標準DNA(實施例1的程序2),用相同引物進行PCR擴增。 由于這時使用的PCR引物被設計為雜交于單堿基置換部位的外側，因此與實 施例1和2相同地，靶DNA試樣和標準DNA的擴增效率完全相同。將擴增 產物單鏈化(與實施例1的程序4操作相同)，按照程序5進行單堿基延伸引 起的發光測定，進行靶DNA試樣的定量分析。
本實施例中，由于可以將原來的cDNA殘留在磁微珠上，因此具有可以根 據需要反復操作對試樣進行定量解析的優點。
程序9:第二鏈cDNA的合成
首先，按照實施例2的程序6制備寡聚(dT)3o固定化磁微珠。接著，按 照程序7，制備使用上述寡聚(dT) 3o固定化磁微珠的單鏈cDNA試樣(來自 總RNA1 OOpg的cDNA )。接著，向磁微珠固定化單鏈cDNA懸濁液1 OpL中， 添加滅菌水39pL、 x lo PCR緩沖液10|aL、 dNTP混合物(各2.5mM) 1 OpL、 x5Q溶液(Q-solution)20fxL、正向引物E(序列號9) ( 10pM)10^L、 TaqDNA 聚合酶(5unit/pL、 QIAGEN公司)I(jL，進行混合。使用擴增儀，將它們在 94°C1分鐘—(94。C 30秒鐘、58°C 30秒鐘、72°C 3分鐘)加熱，合成第二鏈 cDNA。使磁鐵接近管，捕捉磁微珠，除去含有反應中沒有使用的過剩引物的 上清，用洗滌液100|iL洗滌磁微珠2次。將磁微珠懸濁在加熱至95。C的滅菌 水10pL中，使用磁鐵捕捉磁微珠后，采集上清。該上清中含有第二鏈cDNA。 該操作進行2次，得到作為靶DNA試樣的第二鏈cDNA溶液20nL ( 20pL )。 程序10:第二鏈cDNA和標準DNA混合液的PCR擴增 向第二鏈cDNA 20|iL中，添加如程序2制備的標準DNA( A)(序列號6 )、 標準DNA (B)(序列號7)和標準DNA (C)(序列號8)各10pL,制成混合 試樣。在該混合試樣50|jL中，添加滅菌水106fiL、 xlO PCR緩沖液40pL、 dNTP 混合物(各2.5mM) 40jiL、 x5 Q溶液(Q-solution) 80pL、正向引物E (序列 號9) (1(VM)40(iL、 5'末端生物素標記反向引物F(10pM)(序列號5)40pL 以及TaqDNA聚合酶(5unit/pL、 QIAGEN公司)4pL,進行混合。使用擴增 儀，將它們在94。C1分鐘~> (94。C30秒鐘、58。C30秒鐘、72°C 1分鐘)x50 循環—72。C7分鐘加熱，進行PCR擴增。由于是使用設計為位于標準DNA(A)(B) ( C )所含的單堿基置換部位的外側的引物進行PCR擴增，因此混合試樣 中存在的4種才莫^=反以相同效率擴增。即，PCR擴增后的試樣內的4種才莫^1比 例與擴增前保持相同。為了除去該PCR產物400pL中殘留的dNTP和PCR I 物，使用QIAquickPCR產物純化試劑盒對PCR產物進行了精制(500pL )。用 吸光光度計測定各DNA濃度，確認約為100ng/VL。 ^接照程序4,進行試樣的 單鏈化后，按照程序5，進行單堿基延伸引起的發光測定，進行靶DNA試樣 的定量解析。 實施例4
實施例4是，使用帶有錨(anchor)的引物組，如實施例3所示再利用磁 微珠固定化cDNA，對人大腸癌細胞(HCT116)中的EFF1G基因的表達量進 4亍定量的例子。
首先，以固定于磁微珠的cDNA為模板，使用帶有錨的引物進行PCR擴 增，給靶DNA附加錨定序列。將該附加有錨定序列的靶DNA采集到另外的 管中。接著，使用僅錨定序列的單堿基置換為其他堿基種類的帶有錨的引物， 制備3種標準DNA (單鏈)。對先制備的附加有錨定序列的靶DNA試樣，以 不同的量混合該3種標準DNA,進行PCR擴增。這時的PCR引物由于是設 計為雜交于單堿基置換部位的外側，因此靶DNA試樣和標準DNA能夠以相 同擴增效率進行擴增。將該擴增產物單鏈化，使置換堿基部分單堿基延伸。當 發生互補鏈合成反應時則生成焦磷酸，將其轉化為ATP，通過熒光素酶反應檢 測發光。得到的發光強度與焦磷酸的量成比例。因為靶和標準試樣中組入的堿 基種類不同，所以進行識別，計測發光量，由其比例和添加的標準試樣的量來 定量靶的量。此時，即使不是3種，而是僅1種標準DNA混合于靶DNA試 樣，也能夠進行定量解析。
程序12:導入有錨定序列的耙序列的制備
按照程序7，制備使用寡聚(dT) 3Q固定化^茲微珠的單鏈cDNA試樣10pL (來自總RNA100pg的cDNA )。接著，向單鏈cDNA試樣10pL中，添加滅 菌水39iliL、 xio PCR緩沖液10pL、 dNTP混合物(各2.5mM) 10(iL、 x5 Q 溶液(Q-solution) 20pL、帶有錨的正向引物G (序列號11 ) ( lO(iM) 10(iL和 TaqDNA聚合酶(5unit/pL、 QIAGEN公司)l(iL,進行混合。使用擴增儀，
17將它們在94。C加熱1分鐘、55。C加熱30秒鐘、72。C加熱2分鐘，僅進行1次 的延伸反應。使其在水上冷卻1分鐘左右之后，使磁鐵接近反應管，除去含有 在反應中沒有使用的過剩引物等的上清。用洗滌液lOO(iL洗滌i茲微珠2次后， 將磁微珠懸濁在加熱至95。C的滅菌水10^iL中，采集上清。該操作進行2次， 通過熱變性，得到在磁微珠上合成的帶有錨的靶DNA試樣(20jiL)。 程序13:含有錨定序列的標準DNA的制備
與程序1相同地，得到來自大腸癌細胞的cDNA試樣(來自總RNA10pg 的cDNA/)aL)。準備在上述中使用的帶有錨的正向引物G (序列號11),以及 僅1堿基不同的3種引物，即帶有錨的正向引物H (序列號12)、帶有錨的正 向引物I(序列號13)、帶有錨的正向引物J(序列號14)。將3個PCR管(管 H、 I和J)放在水上，分別添加滅菌水29|iL、 xio PCR緩沖液10)iL、 dNTP 混合物(各2.5mM) 10pL、 x5 Q溶液(Q-solution ) 20pL、 5，末端生物素標記 反向引物F(10(iM)(序列號5) 10pL、 TaqDNA聚合酶(5unit/jiL、 QIAGEN 公司)l|iL以及耙DNA試樣IOjiL。進而，向管H添加正向引物H ( lOpM) 10pL，向管I添加正向引物I (lOpM) 10|iL，向管J添加正向引物J ( lOpM) 10|iL，分別使其充分混合。使用擴增儀，將它們在94。C1分鐘—(94°C 30秒 鐘、58°C 30秒鐘、72°C 1分鐘)x50循環—72。C7分鐘加熱，進行PCR擴增， 得到3種雙鏈PCR產物H、 I和J。接著，為了除去試樣中殘留的dNTP和PCR 引物，使用QIAquickPCR產物純化試劑盒(QIAGEN公司)，對各PCR產物 進行精制(5(HiL)。用吸光光度計測定各DNA濃度，確認均為約l|ig/ML。
向這些的PCR產物H、 I和J添加1 x結合漂洗緩沖液(5 mM Tris-HCl( pH 7.5)、 0.5mMEDTA、 lMNaCl) 150pL,稀釋為200pL。另外，向1.5mL管 收集鏈霉親和素包被的磁微珠(直徑lpm、 107個4^、 DYNAL BIOTECH公 司)600|iL,使磁鐵接近管來捕捉磁微珠，除去上清。用結合漂洗緩沖液600ML 洗滌》對鼓玉朱3次后，懸濁于相同溶液600pL中。向各PCR產物試樣添加該磁 微珠懸濁液各200jiL，用轉子(600rpm,室溫)充分攪拌60分鐘，通過鏈霉 親和素-生物素結合使PCR產物結合在磁微珠表面上。為了除去沒有與磁微珠 結合的過剩的PCR產物，用磁鐵捕捉磁微珠，除去上清，用結合漂洗緩沖液 200)^L進行2次微珠的洗滌。接著，將結合有PCR產物的磁微珠分別懸濁在0.1NNaOH300pL中，在室溫靜置5分鐘。用,茲鐵捕捉磁微珠，將上清分別采 集在新的管中。向該上清分別添加1M Tris (pH 7.5 ) 60pL和0.1% Tween ( pH 7.5 )300nL，進行中和。向各試樣添加苯酚氯仿異戊醇(25:24:1、 v/v、Invitrogen 公司)lmL，渦旋3分鐘后，離心(15000rpm、 5分鐘、室溫)(苯酚.氯仿精 制)。將分離溶液的上層分別采集在新管中(約650)iL),使用QIAquickPCR 產物純化試劑盒進行精制濃縮(約250pL)。進而，向這些試樣中添加醋酸鈉 (3M)25(oL、乙醇(99.5%， -30°C ) 625pL,在-80。C冷凍15分鐘后，離心 (15000 rpm、 15分鐘、4°C )。向各試樣添加乙醇(70%， -30°C ) 180|aL，離 心(15000 rpm、 5分鐘、4°C ),除去上清(乙醇沉淀精制)。使顆粒干燥后， 懸濁于滅菌水IOmL中，用吸光光度計測定DNA濃度，確認均為約2jug/VL(約 2xlO'"分子/iiL)。用滅菌水將其稀釋，制成標準DNA(H)(序列號15)約1000 分子/^L、標準DNA (I)(序列號16 )約500分子/mL和標準DNA ( J)(序列 號17 )約100分子/^iL各lmL。這些標準DNA是具有相對于靶DNA僅單堿 基非互補堿基的單鏈DNA。
程序14:靶DNA試樣和標準DNA試樣的混合以及PCR擴增 在放在冰上的管中添加如程序12制備的帶有錨的靶DNA試樣(20(iL)、 標準DNA (H)、標準DNA (I)和標準DNA (J)各lO^L,制成混合試樣。 向其中混合滅菌水106|iL、 x 10 PCR緩沖液40pL、 dNTP混合物(各2.5mM ) 4(VL、 x5Q溶液(Q-solution)80^iL、正向引物K(序列號18) (10(oM)40nL、 5'末端生物素標記反向引物F U0pM)(序列號5) 40|iL、 Taq DNA聚合酶 (5unit/pL、 QIAGEN公司)4pL。使用擴增儀，將它們在94°C 1分鐘—(94°C 30秒鐘、58。C30秒鐘、72°C 1分鐘)x50循環—72°C7分鐘加熱，進行PCR 擴增。由于是使用設計為雜交于標準DNA (H) (I) (J)所含的單堿基置換部 位的外側的引物進行PCR擴增，因此混合試樣中存在的4種具有不同置換堿 基的DNA以相同效率擴增。即，PCR擴增后的試樣內的4種DNA比例與擴 增前保持相同。為了除去PCR產物400;jL中殘留的dNTP和PCR引物，使用 QIAquickPCR產物純化試劑盒對PCR產物進行了精制(500jiL)。用吸光光度 計測定各DNA濃度，確認約為100ng/|aL。與程序4相同地進行操作，得到單 鏈化的PCR產物lOOpL (約5xlO"分子/)iL)。程序15:單堿基延伸引起的化學發光的測定
對于單鏈化的PCR合成物8jiL，混合單堿基延伸用探針(50pM、序列號 19) (405) 3jiL、 10x雜交緩沖液(100mMTris-乙酸酯、20mMMg-乙酸酯、 pH7.75) 3pL和滅菌水16pL。用擴增儀，將該混合溶液在92。C加熱30秒鐘、 50。C加熱3分鐘，冷卻至4。C。向該溶液4^iL中混合120piL的發光試劑(0.065 U/pL測序酶、100 mM Tricine、 2 mM EDTA、 20mMMg-乙酸酯、33.8 U/ml PPDK-E、 523.0 GLU/ml熒光素酶(LUC-H)、三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase ) 1.5U/ml等級VI、 0.4 mM焚光素、0.04mMPEP、 0.2mMAMP、 0.10% BSA、 2mMDTT,pH7.75),在30。C孵育1分鐘。各30pL分注到4連管中，添加用 PPase預先分解了 PPi的ddNTP ( 100(^M)各0.5pL，進行發光檢測(測定時 間l分鐘)。接著，添加相同量的ddNTP，再次進行發光沖全測(測定時間1 分鐘)。
將從第1次測定的發光強度減去作為背景的第2次測定的發光強度的值， 作為發光強度信號。對于混合有30pL的發光試劑的4種標準DNA lpL( 2xl01G 分子)，實施如上操作而得到發光強度信號，由4種發光強度信號相對于ddATP 引起的信號值的比得到延伸強度比。通過用這些數值來除發光強度信號值，從 而校正堿基種類不同引起的延伸度的差。表1的上行表示校正前的發光信號 值，下行表示校正后的信號值。
為了使用該校正后的信號值，對靶DNA試樣的分子數進行定量，首先， 由混合的3種標準DNA (H) (I) (J),如圖6所示，制作標準曲線601。曲線 圖的橫軸是發光強度信號值(校正后)，縱軸為PCR擴增前的標準DNA的分 子數，進行作圖。接著，通過由靶DNA試樣得到的發光強度信號值(校正后)， 使用標準曲線601，如箭頭602所示，得到對應于靶DNA試樣的分子數 (15500)。該值與已知量的靶分子數15000幾乎一致，可以確認能夠十分精確 地進行定量。
工業上的可應用性
本發明在需要進行核酸試樣的定量分析的醫療、科學、食品等領域是很有 用的。
20序列表自由文本 序列號2-引物
序列號3-引物 序列號4-引物 序列號5-引物 序列號6-標準DNA (A) 序列號7-標準DNA (B) 序列號8-標準DNA (C) 序列號9 -引物 序列號10-延伸用探針 序列號11 -引物 序列號12-引物 序列號13-引物 序列號14-引物 序列號15-標準DNA (H) 序列號16-標準DNA (I) 序列號17-標準DNA (J) 序列號18 -引物 序列號19-引物
序列表
<110>抹式會社日立制作所 <120>核酸的定量方法 <130> OIJP0811740 <160> 19< 170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 319
<212> DNA <213>人類
<220>
<223>發明人Taniguchi， Kiyomi; Kanbara, Hideki <400> 1
tgatggcaag agatgttcac ttgaagatct tgccctgatt gaaggctttg cccacatgct 60
ggaaggcccc ctcccaggaa aagtactctc gaaccagcgt ctgggtctcc tcgctgccag 120
gatccagttt ccgccatgtg tatgactcgt agtccacctg ccaatctgga ctcagcggaa 180
aggcaagctc ctggcctcgg aagacccaga ctccagaaat ggagctgcta ttgttggttc 240
caaaaaggat gacactggcg aaggcattct tcctcagctt gtccagtcgc tggaacattc 300
cagtgatgag attgcagct 319
<210> 2
<211> 27
<212> DNA <213>人工序列<220>
<223> 引物
<400> 2
agctgcaatc tcatcactgg gatgttc
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
agctgcaatc tcatcactgg catgttc
<210> 4
<211> 27
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4agctgcaatc tcatcactgg tatgttc 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 <400> 5
Aatctggact cagcggaaag 20
<210> 6 '
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>標準DNA(A) <400> 6
tgatggcaag agatgttcac ttgaagatct tgccctgatt gaaggctttg cccacatgct 60 gga堪gcccc ctccc鄉a3 aagtactctc gaaccagcgt ctgggtctcc tcgctgccag 120 gatccagttt ccgccatgtg tatgactcgt agtccacctg ccaatctgga ctcagcggaa 180
24<formula>formula see original document page 25</formula><formula>formula see original document page 26</formula><400> 9
agctgcaato tcateactgg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>延伸用探針 <400> 10
tgtccagtcg ctggaacat 19
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
agcggataac aatttcacac aggaaacagc tgcaatctca tcactgg 47<210> 12
<211> 47
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
agcggataac aatttcacac agggaacagc tgcaatctca tcactgg 47
<210> 13
<211> 47
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
agcggataac aatttcacac aggcaacagc tgcaatctca tcactgg 47
<210> 14
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
28<220>
<223> 引物
<400> 14
agcggataac aatttcacac aggtaacagc tgcaatctca tcactgg 47
<210> 15 <211> 346
<213>人工序列
<220>
<223> 標準DNA(H) 〈400〉 15
agcggataac aatttcacac agggaacagc tgcaatctca tcactggaat gttccagcga 60 ctggacaagc tgaggaagaa tgccttcgcc agtgtcatcc tttttggaac caacaatagc 120 agctccattt ctggagtctg ggtcttccga ggccaggagc ttgcctttcc gctgagtcca 180 gattggcagg tggactacga gtcatacaca tggcggaaac tggatcctgg cagcgaggag 240 acccagacgc tggttcgaga gtac加cc tgggaggggg ccttccagca tgtgggcaaa 300 gccttcaatc agggcaagat cttcaagtga acatctcttg ccatca 346<210> 16
<211> 346
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 標準DNA(I) <400> 16
agcggataac aatttcacac aggcaacagc tgcaatctca tcactggaat gttccagcga 60
ctggacaagc tgaggaagaa tgccttcgcc agtgtcatcc tttttggaac caacaatagc 120
agctccattt ctggagtctg ggtcttccga ggccaggagc ttgcctttcc gctgagtcca 180
gattggcagg tggactacga gtcatacaca tggcggaaac tggatcctgg cagcgaggag 240
acccagacgc tggttcgaga gtacttttcc tgggaggggg ccttccagca tgtgggcaaa 300
gccttcaatc agggcaagat cttcaagtga acatctcttg ccatca 346
<210> 17
<211> 346
<212> DNA <213>人工序列
<220>2008 agcggataac aatttcacac aggtaacagc tgcaatctca tcactggaat gttccagcga 60
ctggacaagc tgaggaagaa tgccttcgcc agtgtcatcc tttttggaac caacaatagc 120
agctccattt ctggagtctg ggtcttccga ggccaggagc ttgcctttcc gctgagtcca 180
gattggcagg tggactacga gtcatacaca tggcggaaac tggatcctgg cagcgaggag 240
acccagacgc tggttcgaga gtacttttcc tgggaggggg ccttccagca tgtgggcaaa 300
gccttcaatc agggcaagat cttcaagtga acatctcttg ccatca 346
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
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<210> 19
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3權利要求
1. 核酸的定量方法，其包括以下工序(1)在靶DNA試樣中混合一定量的標準DNA試樣的工序，所述標準DNA試樣是在所述靶DNA的至少一部分中導入單堿基置換而得到的；(2)使用引物擴增混合后的試樣的工序，所述引物被設計成用來擴增包含所述單堿基置換部位的區域；(3)將擴增后的試樣單鏈化，使結合于所述單堿基置換部位前一個部位的探針雜交，將ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP一種一種地順次加入，進行互補鏈合成反應的工序；(4)通過熒光素酶反應，檢測來自在所述互補鏈合成反應中生成的焦磷酸的發光的工序；(5)由檢測的發光量和所述標準DNA試樣的量來定量靶DNA的工序。
2. 根據權利要求1記載的核酸的定量方法，其中，對置換堿基不同的多 個標準DNA試樣進行所述(1 ) ~ ( 5 )的工序。
3. 根據權利要求1記載的核酸的定量方法，其中，對濃度不同的多個標 準DNA試樣進行所述(1 ) ~ ( 5 )的工序。
4. 根據權利要求1記載的方法，其包括所述引物被生物素標記，使用鏈 霉親和素結合纟效珠來精制擴增產物的工序。
5. 根據權利要求1記載的方法，其中，所述靶DNA試樣是cDNA試樣。
6. 根據權利要求1記載的方法，其中，預先向所述靶DNA附加錨定序列， 使用具有在該錨定序列中導入單堿基置換而得到的序列的引物來制備所述標 準DNA試樣。
7. 根據權利要求1記載的方法，其中，所述靶DNA和所述標準DNA均 為游離狀態。
8. 根據權利要求1記載的方法，其中，耙DNA和標準DNA的至少一方 被固定于固相表面。
9. 根據權利要求1記載的方法，其中，所述耙DNA試樣是固定于磁微珠 的試樣。
全文摘要
本發明提供一種核酸的定量方法。本發明提供的方法是克服以往的方法的缺點、新型簡便的DNA定量分析方法。本發明的方法中，制備在靶DNA中導入有單堿基置換的標準DNA試樣，將一定量的該試樣與靶DNA試樣混合，用相同的引物擴增靶DNA和標準DNA，使其包含所述單堿基置換部位，使用結合于所述單堿基置換部位前一個部位的探針，將ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP一種一種地順次加入，進行互補鏈合成反應，通過熒光素酶反應檢測來自生成的焦磷酸的發光，由檢測的發光量和加入的標準DNA試樣的量來對靶DNA進行定量。
文檔編號C12Q1/68GK101445828SQ20081018155
公開日2009年6月3日 申請日期2008年11月27日 優先權日2007年11月29日
發明者神原秀記, 谷口妃代美 申請人:株式會社日立制作所