專利名稱：：一種應用懸浮芯片技術檢測霍亂弧菌o1方法
技術領域：
：本發明涉及一種分子生物學檢測芯片，具體的是一種應用懸浮芯片技術對霍亂弧菌Ol進行檢測。
背景技術：
：懸浮芯片技術是將基因芯片技術與流式細胞儀技術結合產生的一種新技術，是一種多重數據獲取和分析平臺，全名為"多功能多指標同步分析體系"(FlexibleMultipleAnalyteProfiling,xMap)，也禾爾為Multi-AnalyteSuspensionArray,有機整合了熒光編碼微球、激光技術、微流體技術、快速信號處理和數據分析系統，即保證了信號質量，又提供高通量的新一代分子檢測技術平臺。懸浮芯片與傳統的基因芯片最大不同之處在于，傳統的基因芯片點樣在玻片或尼龍膜上，依靠坐標定位進行尋址，而懸浮芯片將檢測探針共價交聯到不同的色標微球上，根據色標微球上所帶的熒光素進行區分。懸浮芯片系統主要由三部分組成1、微球直徑5.6pm左右，由聚苯乙烯構成的，表面帶有約108個羧基位點，可與寡核苷酸探針和蛋白以肽鍵耦聯；2、熒光素微球中標記了紅色和橙色熒光素，每種分成10個濃度梯度，將微球分成可被識別的100種微球，當微球被635nm激光激發后，能發射658nm和712nm的熒光；3、檢測儀因微球直徑5.6pm，并被熒光標記，釆用流式細胞儀技術原理進行檢測。原理每一種色標微球可通過羧基，與特定的分析物質(寡核苷酸探針、抗原、抗體等)共價結合。將標記生物探針的微球與待測物進行特異性的結合，再和帶有第三種熒光素的報告分子反應，在一個反應孔內可同時對一個4樣本中的100種不同目的分子進行檢測。反應后，采用96孔板進行進樣。檢測儀自動將反應液吸起加入蠕動泵，泵入一個微細管中，在鞘液的作用下，單排分布的微球單個通過檢測通道。檢測通道中設有兩個激光探頭，一個探頭可發射635nm波長的激光，可激發標記微球的兩種熒光素，從而識別不同的色標微球，進行定性檢測；另一激光探頭可激發報告分子的熒光素，通過測定微球所帶報告分子熒光信號的強度，可進行定量檢測。因此，懸浮芯片可進行定性定量檢測目標分子。當樣本中含有目的分子，目的分子與特定的微球所帶的探針吸附在一起時，兩道激光所激發的熒光均可被檢測到；若樣本中不含目的分子，則僅能檢測到微球所帶的熒光。通過數字信號處理器與計算機自動統計軟件，分析兩道激光所激發熒光的波長和信號強度，從而判斷待檢樣本中幾種至數十種檢測目標物，并通過檢測熒光信號強度，對檢測物進行定量分析。自動加樣器依次將不同樣本加入蠕動泵中，樣本之間用一小段氣柱分隔開，這樣在連續分析過程中不但可以區分不同樣本，可還以防止樣本間的污染。與其它蛋白質和核酸檢測方法相比較，懸浮芯片具獨特優點1)應用范圍廣微球表面的羧基可與核酸探針和蛋白分子耦聯，能對目的核酸和蛋白分子進行定性定量研究；2)敏感性高以微球作為反應載體，增加了反應物接觸面積；每個微球表面帶有約108個羧基位點，以共價鍵方式耦聯寡核苷酸探針、抗體或抗原，探針密度高，產生的信號強；使用熒光檢測，放大了反應信號，敏感性大大提高。3)重復性好所進行的生物反應是在液相環境中進行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然構象，克服了傳統芯片空間效應的影響，也更利于探針和被檢物質的反應，提高了檢測的準確性；4)信噪比低在微細管中對單個微球進行檢測，不存在本底影響檢測的問題，無需洗脫去除本底；5)高通量可以同時對同一樣本中的多重不同目的分子進行定性定量分析，即提高了檢測信息通量，又節約了樣本用量；6)快速高效大大提高了反應速度和檢測速度。由于所進行的生物反應是在液相環境中進行的，雜交僅需15分鐘即可完成，提高了反應速度；在35—60分鐘內，可對96個不同樣本分別同時進行多達100種指標的檢測；利用96孔板和自動進樣系統，可連續進行nX96個樣品的檢測。7)成本低制備過程無需特殊設備，只進行羧基與氨基間的脫水成肽反應即可，簡單易行；由于是液體儲存方式，一次制備可多次使用，平均每個指標檢測成本僅需2.5—5.0元；8)易于標準化基于上述特點，使得該技術能夠做到標準化，易于試劑盒的研制和推廣。目前，懸浮芯片是美國FDA唯一批準用于臨床診斷(自身免疫病檢測和人類白細胞抗原分型)的生物芯片。霍亂是一種烈性傳染病，歷史上曾引起7次大流行，給人們生命財產造成了巨大損失。目前，已鑒定的霍亂弧菌達l卯多個血清型，其中引起霍亂大流行的為血清型Ol、0139。霍亂弧菌常規檢測以傳統培養方法為主，不僅操作繁瑣，耗時長，而且假陰性高。因此建立一種快速、特異、敏感的檢測方法對霍亂防治工作具有重要意義。對霍亂弧菌O-抗原基因簇生物信息學分析發現，在O-抗原合成酶基因rfb上具一段變異區，可在此區域篩選不同血清型特異性序列(FranciosaG.，1994)。
發明內容本發明的目的旨在提供一種檢測霍亂弧菌Ol的懸浮芯片。本發明所提供的檢測霍亂弧菌Ol的懸浮芯片，包括診斷微球和與此微球耦聯的特異性寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針序列為霍亂弧菌Ol特異性基因rfb的一段序列。本發明還公開了一段寡聚核苷酸探針序列，該序列為5'-NH2-(CH2)12-TGGTACAATCACTTCATCGCC-3'，如序列表中序列3所示，并在5'進行NH2-(CH2),2修飾。此外本發明的懸浮芯片還包括一對特異性引物，上游引物為B-Olrfb-F:5'-CACGCCACAACAGTATCTAAT-3'(見序列表中序列l，進行Biotin標記)；下游引物為Olrfb-R:5'-AACGGGTAACGCACCACAC-3'(見序列表中序列2)。上述引物可擴增包含上述探針序列的一段rfb序列。本發明的另一目的在于提供上述懸浮芯片的制備方法，該方法包括以下1)制備寡聚核苷酸探針；2)用純水稀釋氨基修飾的探針；3)將儲備的微球振蕩，然后轉移到棕色EP管中；4)離心收集微球，加入MES液進行振蕩；5)向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；6)在微球溶液中加入新配制的10mg/mlEDC，振蕩；然后進行溫育；7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然后進行溫育；8)向微球溶液中加0.02y。Tween-20，離心收集微球；9)用0.1。/。SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；10)用血球計數板計算微球的個數，2—8。C，避光保存。應用本發明懸浮芯片檢測霍亂弧菌Ol是通過以下方法進行的。根據霍亂弧菌Olrfb基因設計并合成用于PCR擴增的特異性引物，如序列表中序列1和2所示，并對其中一條引物進行Biotin修飾；按常規方法制備待檢樣本基因組DNA作為模板，使用上述特異性引物進行PCR擴增，同時使PCR產物帶上Biotin修飾；將PCR產物與制備的懸浮芯片雜交，也就是與耦聯在微球上的探針進行雜交，對雜交懸浮芯片進行鏈霉親和素化藻紅蛋白標記，然后通過流式細胞儀檢測熒光信號。本發明的另一目的提供一種克服PCR假陽性的方法。本發明采用的UNG—Taq酶體系，有效的控制了PCR假陰性產生。具體方法是PCR反應體系中，將dTTP量減半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR產物中被摻入一定量的dUTP，UNG通過打斷核酸鏈上dUTP上的糖苷鍵，使含dUTP的核酸不能作為模板被識別。在運行PCR程序之前先37'C溫育5min，使UNG充分消化PCR產物，94"C模板變性時，UNG失活，進行正常PCR反應。本發明的懸浮芯片可以對霍亂弧菌01進行鑒定和檢測，具有高特異性、高靈敏度、快速、低成本易于推廣等特點。圖1特異性試驗結果；圖2敏感性試驗結果；圖3UNG—Taq酶體系消化PCR產物試驗結果。具體實施例方式為進一步說明本發明在霍亂弧菌Ol檢測中的應用，特舉以下較佳實施例進行說明，但本發明的應用并不限于實施例。實施例一引物的設計和合成1)序列獲得通過對霍亂弧菌O-抗原基因簇序列分析，選取Ol特異性基因rfb作為靶序列，并從GenBank公共數據庫中獲得此基因序列，編號為X59554;2)設計引物采用PrimerPremier5.0軟件設計引物，相關參數為Tm值55.0°C—59.0°C，GC值40.0%—60.0%,PCR產物大小為lOObp—500bp，引物大小22士3bp;3)引物選擇將軟件輸出的引物進行適當的手動調節，增加或減少幾個堿基，然后在GenBank進行在線Blast比對，選取特異性高的引物，并將其中的一條進行5'末端Biotin標記。上游引物序列為B-Olrfb-F:5'-Biotin-CACGCCACAACAGTATCTAAT-3'，下游引物為01rfb-R:5'-AACGGGTAACGCACCACAC-3',擴增片段大小為153bp;4)引物合成上海生工合成下游引物Olrfb-R，大連TakaRa合成Biotin標記的上游引物B-Olrfb-F。實施例二探針的設計和合成1)序列獲得在上述擴增片段非引物區設計探針；2)設計探針采用PrimerPremier5.0軟件設計探針，選定HybridizationProbes命令，在Anti-sense鏈上設計探針，參數同實施例一；3)探針選擇將軟件輸出的探針進行適當的手動調節，增加或減少幾個堿基，然后在GenBank進行在線Blast比對，選取特異性高的探針，在5'末端進行NH2-(CH2)12修飾，選定的探針序列為Olrfb-Probe:5'-NH2-(CH2)12-TGGTACAATCACTTCATCGCC-3';4)探針合成大連TakaRa合成上述探針。實施例三懸浮芯片的制備方法1.用純水稀釋氨基修飾的探針到lmM(lnanomole/pl);2.將儲備的微球振蕩20sec;3.取20(^1微球轉移到棕色EP管中；4.收集微球，8000g，離心l-2min;5.棄上清，力口入50^10.1MMES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonicacid，2-(N-嗎啉代)乙磺酸)液pH4.5，振蕩20sec;6.向懸浮微球中加入2pllmM的探針，振蕩20sec;7.準備新鮮的10mg/mlEDC(l-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride,l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺)，用dH20;8.向微球溶液中加入2.5^1新配置的10mg/mlEDC，振蕩；9.在室溫黑暗條件下溫育30min;10.再次準備新鮮的10mg/mlEDC，用dH20;n.向微球溶液中加入2.5iul新配置的10mg/mlEDC，振蕩；12.在室溫黑暗條件下溫育30min;13.向微球溶液中加1.0mL0.02%Tween-20;14.8000Xg離心1—2min,收集微球；15.棄上清，用1.0mL0.1。/。SDS重懸微球；16.8000Xg離心1—2min，收集微球；17.用100fxlTE，pH=8.0，懸浮微球，18.用血球計數板計算微球的個數1019.將微球2—8'C,避光保存備用。實施例四懸浮芯片快速檢測霍亂弧菌Ol方法1)TIANampBacteriaDNAkit試劑盒提取待檢樣本基因組DNA。2)PCR擴增目的片段，反應條件如下表格1PCR反應體系組份加入體積10xPCRBuffer(含MgCl2)2|ildGTP、dCTP、dATP(2.5mmol/L)各1.6pidTTP、dUTP(2.5mmol/L)各O都lB-Olrfb-F(1,1/L)1|LllOlrfb-R(1|nmol/L)1|il7i^DNAPolymerase(5U/nl)0.1piUracil-DNAGlycosylase(lU/^il)0.05pi所提樣本基因組DNA1niddH208.45|xlTotal20nlPCR反應程序為94°C變性3min;運行35個循環94°C30sec，53°C30sec，72。C40sec;最后，72°C延伸3min。3)雜交雜交液組成33.3^il1.5XTMAC(tetramethylammoniumchloride,氯化四甲銨)，5^1上述PCR產物，加入5000個與探針耦聯的微球，1XTE將體積補充到50pl。將雜交液在95"C變性4min，52'C雜交15min以上。4)檢測將上述雜交后的溶液全部轉移到96孔濾板中，真空過濾收集微球，用2pg/mlS-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，鏈霉親和素化藻紅蛋白)重懸微球，置52。C10min，Luminex檢測。實施例五懸浮芯片的特異性驗證11特異性試驗采用實施例四方法，對45株菌株進行特異性驗證，結果顯示霍亂弧菌Ol呈陽性結果，其它非霍亂弧菌Ol均為陰性，特異性達100%。菌株具體信息如下表格1_試驗編號51來源與編號試驗編號來源與編號^_枸櫞酸桿菌_CMCC48017_^_PCRBl加k靈敏度試驗按實施例三中的方法進行靈敏度試驗，以痢疾志賀IEM/PLA860084研究對象，將提取的模板進行定量，依次進行10倍稀釋，靈敏度試驗中加入的模板量分別為2.31fg、23.1fg、231fg、2.31pg、23.1pg、231pg,以純水做陰性對照。結果顯示，靈敏度達2,31fg(相當于2—3個細菌數)，可滿足臨床樣本及環境樣本檢測需要。實施例六UNG-Taq酶體系消除PCR產物污染是試驗按實施例三中的方法進行此試驗。對PCR產物進行定量，分別取107、ATCC25922ATCC8739國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株ATCC14028s國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株國家CDC分離株12副溶血霍亂弧菌ATCC3384713副溶血霍亂弧菌ATCC1180214金黃色葡萄球菌ATCC653815金黃色葡萄球菌CMCC2600316表皮葡萄球菌CMCC2606917甲型溶血性鏈球菌CMCC3221318乙型溶血性鏈球菌CMCC3221019丙型溶血性鏈球菌CMCC3220620肺炎克雷伯氏菌CMCC4611721陰溝腸桿菌CMCC4530122產氣腸桿菌CMCC4510324臘樣芽孢桿菌CMCC6330125甲型副傷寒沙門氏菌CMCC5000126乙型副傷寒沙門氏菌CMCC5009427丙型副傷寒沙門氏菌CMCC5001728痢疾志賀氏菌CMCC5119729痢疾志賀氏菌本室保30福氏志賀氏菌CMCC5106231鮑氏志賀氏菌CMCC5126532宋內志賀氏菌CMCC5133433霍亂弧菌Ol正M/PLA86008434霍亂弧菌0139贈35嗜肺軍團桿菌廣東CDC贈36嗜肺軍團桿菌廣東CDC贈37A型肉毒梭菌62A株38B型肉毒梭菌621株39E型肉毒梭菌619株40A型產氣莢膜本室保41B型產氣莢膜本室保42D型產氣莢膜本室保43綠膿桿菌ATCC卯2744單增李斯特菌本室保45小腸結腸炎耶爾森氏CMCC52203菌桿桿桿桿桿桿揚揚揚揚揚揚大大大大大大氏氏氏氏氏氏希希希希希希埃埃埃埃埃埃氏氏氏氏氏門「「JJJJ沙沙沙沙沙108、109、101Q、IO11、1012個PCR產物拷貝數作為模板，采用UNG—Taq酶體系進行反應，以純水為陰性對照，以所提全基因組為陽性對照，分別設無UNG、0.05UUNG作為對比。結果顯示UNG—Taq酶體系可消化108個PCR產物拷貝數，有效的克服了PCR假陽性產生。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所<120>—種應用懸浮芯片技術檢測霍亂弧菌01方法<140><141><160>3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1CACGCCACAACAGTATCTAAT21<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2AACGGGTAACGCACCACAC19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3TGGTACAATCACTTCATCGCC211權利要求1.一種用于霍亂弧菌O1檢測的懸浮芯片，包括診斷微球和與診斷微球耦聯的寡聚核苷酸探針，其特征在該寡聚核苷酸探針是霍亂弧菌O1O-抗原合成酶基因rfb上的一段序列。2.根據權利要求1所述霍亂弧菌Ol檢測的懸浮芯片，其中寡聚核苷酸探針是序列如序列表中序列3所示，在其5'進行NH2-(CH2:h2修飾。3.根據權利要求1或2所述霍亂弧菌Ol檢測的懸浮芯片，其特征是該芯片可鑒定和檢測霍亂弧菌Ol。4.根據權利要求1或2所述霍亂弧菌01檢測的懸浮芯片，其特征在于包括一對特異性引物，引物序列如序列表中序列1和2所示，并對序列1進行5'Biotin修飾。5.權利要求1或2所述用于志賀氏菌檢測的懸浮芯片的制備方法，包括如下步驟制備寡聚核苷酸探針；用純水稀釋氨基修飾的探針；將儲備的微球振蕩，然后轉移到棕色EP管中；離心收集微球，加入MES液進行振蕩；向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；在微球溶液中加入新配制的EDC溶液，振蕩；然后進行溫育；再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振蕩，然后進行溫育；向微球溶液中加0.02。/。Tween-20,離心收集微球；用0.1。/。SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；用血球計數板計算微球的個數，2—8i:，避光保存。6.權利要求1或2所述用于霍亂弧菌Ol檢測的懸浮芯片使用方法，包括以下步驟a)根據霍亂弧菌Olrfb基因設計并合成用于PCR擴增的特異性引物，并對其中一條引物進行Biotin修飾；b)按常規方法制備的待檢樣本基因組DNA，并使用步驟a)中的引物對待檢樣本基因組DNA進行PCR擴增，同時使PCR產物帶上Biotin修飾；c)將步驟b)中的PCR產物與權利要求1中所述懸浮芯片雜交；d)對步驟c)中雜交懸浮芯片進行鏈霉親和素化藻紅蛋白標記，并對其檢測熒光信號。7.根據權利要求4所述的一種檢測霍亂弧菌Ol的方法，其特征是上述步驟b)所建立的PCR反應體系如下-表格1PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>PCR反應程序為37°C溫育5min;94°C變性3min;運行35個循環94°C30sec，53。C30sec，72°C40sec;最后，72°C延伸3min。8.根據權利要求6所述的一種檢測霍亂弧菌01的方法，其中雜交溫度為52°C，雜交時間為大于15min。全文摘要本發明涉及一種用于霍亂弧菌O1檢測的懸浮芯片及其檢測方法，該懸浮芯片包括微球載體和固定在載體上的寡聚核苷酸探針，其中該寡聚核苷酸探針是從霍亂弧菌O-抗原基因簇篩選的霍亂弧菌O1特異性基因rfb中的一段DNA序列。利用設計的引物將待檢樣品基因組DNA擴增并標記后，利用上述懸浮芯片進行雜交，根據雜交熒光強度，可判斷待檢樣品中是否含有霍亂弧菌O1。懸浮芯片檢測靈敏度高，可達到fg級基因組DNA水平，可滿足臨床樣本和環境樣本檢測需要，并具特異性高、操作簡單、成本低等特點，易于推廣。并采用UNG-Taq酶PCR反應體系，大大降低了PCR假陽性結果。文檔編號C12Q1/68GK101487047SQ20081018119公開日2009年7月22日申請日期2008年11月27日優先權日2008年11月27日發明者劉艷華,琳康,王景林,趙金銀,姍高申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所