專利名稱：：一種半纖維水解物的生物脫毒方法及脫毒活性菌株的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，涉及到一種半纖維水解物的生物脫毒方法及其專用脫毒活性微生物菌株。
背景技術：
：半纖維素是植物細胞壁中除纖維素之外的聚糖類，含量隨不同植物而有所差別，大致占植物體重量的20_35%，是地球上除纖維素之外最豐富的多糖。纖維素是完全由葡萄糖單元聚合成的均一性聚糖，而半纖維素則主要是由木糖以P-(l-4)糖苷鍵構成主鏈，阿伯糖、甘露糖和半乳糖形成支鏈結構的非均一性聚糖。半纖維素的木聚糖主鏈一般含有50-150個木糖單位，無結晶結構，結合在纖維素微纖維的表面。半纖維素比纖維素容易水解得多，用稀酸在100-13(TC條件下，就很容易將半纖維素，水解生成以五碳糖為主要成分的半纖維素水解物。發酵半纖維素水解物生產市場容量大的木糖醇、乙醇等各類化工產品，是能夠大規模利用半纖維素資源的有效途徑。雖然用稀酸將半纖維素水解生成以單糖為主要成分的水解物的過程并不困難，但是，稀酸水解過程會伴隨產生一系列微生物代謝抑制物，要改善半纖維水解物的發酵性能，必須除去其中的微生物代謝抑制物，即脫毒過程是必不可少的。目前在半纖維素水解物中已鑒定的毒物成分已經有幾十種，其中代表性毒物包括三大類，即糠醛類化合物，如糠醛，5_羥甲基糠醛；脂肪酸類化合物，如甲酸，乙酸，丙酸；木質素降解生成的一系列含有苯環的化合物，如愈創木酚，苯甲醛，阿魏酸等。已經報道真空蒸發，溶劑抽提，活性炭吸附，大孔樹脂吸附，離子交換樹脂處理，都可以脫去某些毒物，改善水解物的發酵性能。然而，一種物理或化學方法只能除去某一類有毒物質，通常需要聯合采用多種理化措施處理，半纖維水解物才能達到比較好的脫毒效果。但是，脫毒是一個耗費成本的過程，同時使用多種理化措施對半纖維素水解物進行脫毒處理，必須大幅度提高產物發酵的成本。事實上，自然界的一些微生物對半纖維素水解物中的某些毒物具有降解活性。例如，例如降解木質素及由木質素降解生成的一系列酚類化合物的白腐菌(林海陸鋼張慶娜，降解造紙廢水木質素菌種的篩選鑒定及應用，北京科技大學學報。2007,29(6):569-573;陶楊廖俊和羅學剛，生物制漿技術最新應用研究進展。纖維素科學與技術。2007，15(1):70-74，降解糠醛，5-羥甲基糠醛細菌，酵母(代書玲，張魯嘉，糠醛及其衍生物微生物降解(轉化)研究進展。氨基酸和生物資源2007，29(4):41-45;劉愛平許學書樊行雪，利用酵母生物轉化植物纖維為乙醇的研究進展。生物技術通訊，2004，15(2):193—196)，降解短鏈脂肪酸的子囊菌(何剛強堵國成劉立明，嗜熱子囊菌利用短鏈有機酸生產角質酶。生物工程學報，2008，24(5):821-828)近年有人開始嘗試以生物酶法去除水解物中的毒物。Jonsson等人用漆酶與過氧化物酶聯合處理木材酸水解物，能除去了大部分的單環酚性物(monoaromaticphenoliccopoimds)。處理后的水解物用于乙醇發酵，結果葡萄糖消耗速率與乙醇生成速率提高3了近5倍(JonssonJL，PalmqvistE，NilvebrantN0.，Detoxificationofwoodhydrolysateswithlaccaseandperoxidasefromthewhite—rotfungusTrametesversicolor.A卯l.MicrobiolBiotechnol.1998，(49):691-697))。但復雜的毒物成分需要復雜的酶系的聯合降解，這無疑大大增加了脫毒的成本。Lopez等人以微生物ConichaetaligniariaNRRL30616發酵處理木質纖維稀酸水解物，不僅去除糠醛、5-羥甲基糠醛的效果顯著，同時也明顯減少了水解物中的酚類物質。經過這一菌株處理的水解物再用產乙醇酵母發酵，80h產生1.66%0乙醇，而未處理的去卩沒有乙酉享產生(LopezJM，NicholsNN，DienBSetal.Isolationofmicroorganismsforbiologicaldetoxificationoflignocellulosechydrolysates.ApplMicrobiolBiotechnol.2004,64(1):125-131上述研究表明，利用微生物降解木質纖維水解物中復雜有毒物質是可能實現的。尤其是，如果能夠獲得一種同時具備降解半纖維水解物中的三大代表性毒物的代謝系統，即可以同時降解糠醛、脂肪酸及含有苯環結構化合物的微生物，并且這種微生物又不能利用木糖的話，那么直接利用這種微生物發酵半纖維水解物進行脫毒物質處理，就能有效克服現有理化脫毒方法工藝繁瑣、成本高的缺點，并具有環境友好的優勢。
發明內容本發明的目的是為了解決現有的半纖維素水解物理化脫毒工藝所存在的過程煩瑣，成本高的問題。本發明的內容包括發明人自造紙廠，木糖廠，糠醛廠周圍土壤污泥樣富含培養、分離、篩選，獲得能有效改善木質纖維水解物發酵性能的兩個分離物S-7和Lj-3。發明人鑒定分離物S-7屬于東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)，不能利用木糖；分離物Lj-3屬于西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)，利用木糖的能力極微弱。發明人用這種脫毒活性新菌株建立了半纖維水解物的生物脫毒法；將脫毒活性菌株與發酵木糖生成木糖醇微生物混合接種，實現半纖維素水解物同步脫毒發酵生產木糖醇；將脫毒活性菌株與發酵木糖生成乙醇的微生物混合接種，實現半纖維素水解物同步脫毒發酵生產乙醇。上述兩種酵母的保藏信息參見本專利申請所附的兩份保藏受理通知書。屬于本發明的兩個生物脫毒活性菌株S-7(CCTCCN0:M206098)和Lj-3(CCTCCNO:M206097)，其分離篩選、及分類鑒定的過程如下用蔗渣半纖維素水解物為分離培養基的基本成分，適當真空后用堿調節pH5-6。如果制成平板，外加瓊脂20g/L作為固形劑。從紙漿廠廢水污染的環境采集的土壤、淤泥作分離樣品。250ml三角瓶裝量25ml，接入廢水或淤泥分離樣品約lg，3(TC，200rpm搖瓶富集培養72h。取有菌體生長的培養液在同一培養基平板上劃線分離，選擇能夠快速生長的類型，轉到斜面保存。斜面培養物轉移到半纖維稀酸水解物中并在搖瓶條件下培養24小時，離心除去菌體，然后接入能夠同化木糖的酵母菌株進行發酵，選留那些能夠有效改善半纖維素稀酸水解物發酵性能的脫毒活性菌株。如此經過十余個批次的樣品分離，獲得改善半纖維素水解物發酵性能活性最強的兩個分離物，編號分別為S-7和Lj-3。高效液相色譜的檢測結果表明，S-7和Lj-3對半纖維素稀酸水解物中的代表性毒物醋酸，糠醛及酚性物均有良好的降解活性，其中S-7不利用木糖，Lj-3只能微弱利用木糖。上述方法分離得到的兩個菌株于4t:冷藏或凍干法保藏。按照《酵母菌鑒定手冊》(青島海洋大學出版社)一書提供的方法，鑒定了S-7和Lj-3的細胞、菌落與生理生化特征(表l，表2)。分離物S-7的生理、生化特征與《酵母菌鑒定手冊》中所描述的東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)完全相同；分離物Lj-3的生理、生化特征與同一書中所述的西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)完全相同。用引物5，-GCATATCAAAAGCGGAGGAAAAG-3'禾P5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增S-7和Lj-3的26SrDNADl/D2區域核酸序列(方法參照KurtzmanCP，FournewCandidaspeciesfromgeographicallydiverselocations.AntonievanLeeuwenhoek，2001，79:353-361)。測定擴增產物的核酸序列(表3，表4)，并用此序列在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索(Nucleotide-nucleotideBLAST)。搜索結果表明，S-7的26SrDNADl/D2區域的核酸序列，與GenBank現有Issatchenkiaorientalis同一區域核酸序列同源性均達100%;Lj-3與其中與Issatchenkiaoccidentalis同一區域核酸序列的同源性達到100%。根據上述的細胞、菌落形態、生理生化與分子生物學特征的可以確定，S-7的分類地位屬于東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis);Lj_3的分類地位屬于的西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)。東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)S_7在2006年9月18日到中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的保藏號為CCTCCNO:M206098，它的26SrDNADl/D2區域的核苷酸序列在GenBank的登記號為EF030708http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7db=皿cleotide&val=116834296;西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj_3在2006年9月18日到中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心CCTCC的保藏號為CCTCCNO:M206097，它的26SrDNADl/D2區域的核苷酸序列的GenBank登記號為EF030710http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7db=皿cleotide&val=116834298。表1分離物S_7、Lj-3的細胞與菌落形態特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2分離物S-7、Lj-3的生理生化特征(+，利用；-，不利用)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)S_7(CCTCCNO:M206098)26SrDNADl/D2區域的核酸序列(GenBank登記號EF030708):1t￡l￡lgCgg￡lgg朋C3ggg3ttgcctcagtagcggcgagtga3gCggC33g361gctcagatttga朋tcgtgctttgcggcacgElgttgt卿ttgcaggttggagtctgtgt121gg朋ggcggtgtccaagtcccttgg朋cagggcgcccagg鄉gtg卿gccccgtggga181tgccggcggaElgCElgtgElggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaa241gcgggtggteaattccatctactggcgagagaccgategc301tgtg￡l￡lgg￡l￡lcactttgaaa3g3gagtg朋3C3gC3Cgtg3朋ttgttga361￡l￡lggg￡l￡lgggtattgcgcccg￡lC￡ltgggg￡lttgcgcaccgctgcctctcgtgggcggcgc421tctgggctttccctgggccagcatcggttcttgctgcagg卿鄉ggttctggaacgtg481gctcttcggagtgttatagccagggccagatgctgcgtgcgggg3CCg3ggactgcggcc541gtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgc朋caccgcccgtcttgaaaC3Cgg3西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj_3(CCTCCNO:M206097)的26SrDNADl/D2區域核酸序列(GenBank登記號EF030710):1tetc朋t朋gcgg3gg朋朋g朋3cc朋c3gggattgcctcagtegcggcgagtg朋gcg61gc朋朋gctc3gatttg朋3tcgtgtttcggcacgagttgtegattgcaggttggagtct121ttgtggaagcgtgtgtctaagtcccttggaacagggtgccattgagggtgagagccccgt181g卿cgcgtgcggaagctgtaaggcccttctgacgagtcgagttgtttggg朋tgcagct241ctaagtgggtggtaaattccatctaaggcta朋tettggcgagagaccga301gtectgtg朋gg朋3gatg3aaagcacttttg朋3C3gC3cgtga朋ttg361ttg￡l￡l￡lggg￡lagggtattgggctcgacatgggatttgcgcaccgctgctccttgtgggcg421gcgctctgtgcttttcctgggccagcatcggtttttgccgC3gg卿3ggcgtgctggaa481tgtggctcttcggagtgttatagccagtgcg卿tgctgcgtgCgggg3Ccgaggactgc541gacatctgtctcggatgctggcac朋cggcgcaataccgcccgtcttgta本發明按下述方法制備所需要的半纖維素水解物將甘蔗渣、玉米芯、稻草等作物秸稈粉碎至適當粒度，按固液比1:67加入0.33%(w/w)的稀硫酸或稀鹽酸溶液，攪拌均勻，在耐酸的壓力容器內加熱至10013(TC，維持0.53小時。水解結束后濾除殘渣，濾液即為半纖維素水解物。用固體碳酸鈣或氫氧化鈣將半纖維素稀酸水解液調至pH值38，可直接或濃縮后再進行生物脫毒。一般地，較高酸濃度的條件可以使用較低的水解溫度，或相應縮短水解時間，較低的酸濃度則必須提高水解溫度或延長水解時間。本發明按下述方法培養用于半纖維水解物生物脫毒，木糖醇發酵，乙醇發酵的微生物菌種脫毒菌株種子液的培養將CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097的斜面培養物接入液體種子培養基，裝液量為搖瓶容量的20^，在27—3(TC，轉速200rmp條件下搖床培養1218小時，即可獲得可用于脫毒的種液。種子培養基組成為葡萄糖50g/L，MgS04.7H202g/L，K2HP044g/L，KH2P046g/L，酵母膏5g/L。發酵木糖生成木糖醇的菌株種子液培養所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067(見發明專利"熱帶假絲酵母菌株的分離及其用于木糖醇生產的方法"，發明專利申請號200510037580.2)，含葡萄糖20g/L，木糖20g/L，其余成分與培養條件同脫毒菌株種子培養。發酵木糖生成乙醇的菌株種子液培養所用的菌株為保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)的嗜單寧管囊酵母(Pachysolentannophilus)CICC1770，培養基成分及培養條件同發酵木糖生成木糖醇的菌種培養。本發明按下述方法進行半纖維素水解物生物脫毒半纖維素水解物總糖含量為420%(w/V)，其中還原性單糖占總糖含量>90%以上，以木糖為主成分。用堿液(氫氧化鈣，氨水等)調節至pH3-7，按10X(v/v)接種量接入培養好的CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097種子液，在2535°C，通氣條件下發酵脫毒520小時，其中的大部分微生物有毒成分即可被降解除去。收集離心沉淀的菌體重復用于下一批新鮮的半纖維素水解物脫毒，離心上清液可直接或者濃縮后用于木糖醇發酵，或乙醇發酵。本發明按下述方法發酵脫毒后的半纖維素水解物生產木糖醇已經過CCTCCNO:M206098，或CCTCCNO:M206097發酵脫毒過的半纖維素水解物，真空濃縮至木糖約150g/L，氨水調節至pH=6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇發酵的半纖維素水解物培養基。木糖醇發酵用搖瓶進行，搖瓶裝量10%，按5%(v/v)接種量接入熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067種子液，200rmp，33。C進行發酵至木糖消耗完。收集離心沉淀的菌體，投入到新鮮的半纖維素水解物培養基中繼續新一輪的木糖醇發酵，離心上清液用于制備木糖醇。本發明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發酵生產木糖醇真空濃縮半纖維素水解物至木糖含量約100—150g/L，用堿(氫氧化鈣，或氨水)調至pH3—pH7，，離心或過濾除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纖維素水解物培養基，分裝于三角瓶；取培養好的株CCTCCNO:M206098種子液，或者CCTCCNO:M206097的種子液，并與等體積的CCTCCN0:M205067種子液混合，然后按5X(v/v)和用種量接入半纖維素水解物中，搖瓶培養至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞并用于新鮮的培養基中，繼續同步脫毒發酵。如此不斷地循環，直至酵母細胞不能利用。本發明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發酵生產乙醇同步脫毒發酵生產乙醇所用的半纖維素水解物的培養基，與同步脫毒發酵生產木糖醇的培養基相同。取培養好的株CCTCCN0:M206098種子液，或者CCTCCNO:M206097的種子液，與等體積的CICC1770種子液混合，然后按5%(v/v)和用種量接入半纖維素水解物培養基搖瓶中，培養至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞循環用于發酵新鮮的培養基，繼續同步脫毒發酵，如此不斷地循環，直至酵母細胞不能利用。蒸餾回收離心上清液中的乙醇。本發明用高效液相色譜法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物中的代表性毒物質，及主要酚類物質降解活性。選擇乙酸、糠醛及愈創木酚作為半纖維素水解物中不同類型抑制物的代表，將這三種化合物一起加入到普通酵母培養基中，并接入脫毒活性菌株(CCTCCNO:M206097，或CCTCCN0:M206098)進行發酵。利用這三種化合物均在198nm處均有較強的紫外吸收的特點，在如下色譜條件Waters486高效液相色譜儀，ZORBAXXDB-C18色譜柱，流動相甲醇磷酸(0.2X，w/w)=75:25(v/v)，對比檢測這三種化合物在發酵前后的含量變化，判斷這兩個菌株對這三種代表性有毒成分均具有降解活性(圖1)。由于酚類化合物在270nm附近均有強的紫外吸收，故以270nm為檢測波長，以高效液相對比檢測實施例1的蔗渣半纖維素水解物、實施例3的經東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098生物脫毒，經西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097生物脫毒的蔗渣半纖維素水解物(圖2)。并分析這一檢測波長條件下的一些特征峰的信息(表4)，可知半纖維素水解物經生物脫毒處理之后，其中的糠醛及許多有毒的酚類物質已被降解。本發明用對比生物發酵的方法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物的脫毒效果用CCTCCNO:M205067對比發酵經CCTCCNO:M206097，或經CCTCCNO:M206098脫毒處理前后半纖維素水解物，檢測發酵產物木糖醇；或用CICC1770對比發酵經CCTCCNO:M206097，或經CCTCCNO:M206098脫毒處理前后半纖維素水解物，檢測發酵產物乙醇。可以發現，經過本發明所提供的生物菌株及脫毒方法處理后的半纖維水解物，無論用于木糖醇發酵或乙醇發酵，發酵物的產量、生成速率均有大幅度提高。由此即可肯定，本發明提供的生物脫毒菌株及生物脫毒方法能有效地提高半纖維素水解物的發酵性能。8本發明突出的實質性特點和顯著進步是1.本發明發現并提供的東方伊薩酵母CCTCCN0:M206097，西方伊薩酵母CCTCCNO:M206098這兩個菌株，對半纖維水解物中三大代表性微生物代謝抑制物以醋酸為代表的有機酸，以糠醛為代表的糖類降解產物，及以愈創木酚為代表的酚類化合物，均同時具有降解活性，它們對半纖維水解物均具有突出的生物脫毒活性。2.本發明利用東方伊薩酵母CCTCCNO:M206097，或西方伊薩酵母CCTCCNO:M206098生物降解半纖維素水解物中的多種有毒成分，事實減少了基質中的雜質。與傳統的理化脫毒工藝相比，用本發明對半纖維素水解物進行脫毒，顯然具有簡捷、低成本、及環境友好的突出優勢。3.本發明提供的兩個脫毒活性菌株，其中CCTCCNO:M206097完全不能同化木糖、CCTCCNO:M206098對木糖的代謝能力也十分微弱，利用它們對半纖維素水解物脫毒，并并不會造成其中的木糖損失。由于這一特點，將它們與發酵木糖生成木糖醇，或發酵木糖生成乙醇的微生物置于同一發酵系統中，可實現半纖維水解物脫毒過程與木糖醇發酵，或與乙醇發酵相偶聯，極大地簡化發酵半纖維素水解物生產木糖醇發酵，或生產乙醇的工藝。圖1為抑制物經脫毒活性菌株降解后的高效液相色譜變化。其中參數為(A)抑制物，(B)培養基，(C)添加了抑制物的培養基，(D)含抑制物的培養基經CCTCCN0:M206097發酵脫毒，E含抑制物培養其經CCTCCNO:M20609S發酵脫毒。峰號與化合物1乙酸，2糠醛1，3愈創木酚，4、5培養基成分，6糠醛降解產物，7愈創木酚降解產物。圖2為蔗渣半纖維水解物生物脫毒前后的HPLC圖譜(檢測波長270nm)。其中參數為A，糠醛標樣；B，蔗渣半纖維水解物；C，經CCTCCNO:M206098脫毒的蔗渣半纖維水解物；D，經CCTCCNO:M206097脫毒的蔗渣半纖維水解物。具體實施方式實施例1稱已經水洗并重新干燥過的蔗渣3kg，按固液比(w/v)為1:7加入H2S04溶液(2.5%，w/w)，12(TC水解2h，離心收集濾液，濾渣水洗一次，合并濾液，用碳酸鈣固體調pH值至3，抽濾除去沉淀，得蔗渣半纖維素水解物。此水解物還原糖含量3%，木糖單糖占總糖的80%以上。實施例2取已經粉碎的干玉米芯2kg，按固液比1:7加入2%(w/w)的H2S04溶液，12(TC水解2h，收集液體部分，碳酸鈣中和至pH值3，抽濾除去沉淀物，得以玉米芯半纖維素稀酸水解液。此水解液總糖含量5%，其中木糖約占總糖的60%。實施例3將東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098斜面接種到液體種子培養基上，200rmp，30°C搖床培養12h，得活化種子液。按15%(v/v)的接種量接入實施例l，所得的蔗渣半纖維素稀酸水解液中，200rmp，33。C搖床發酵脫毒45h，離心上清液即為經東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098生物脫毒的蔗渣半水解物。按同條件，用西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097處理實施例1的蔗渣半纖維素水解物，得到經西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097生物脫毒的蔗渣半纖維素水解物。實施例4實施例3所得的經生物脫毒處理的蔗渣半纖維素水解物，繼續真空濃縮至木糖150g/L，氨水調節至pH=6，另加入酵母膏5g/L，接入熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067種子液，接入量為5%(v/v)，200rmp，33。C進行發酵。對比HPLC檢測結果(表3)，經過生物脫毒處理后的半纖維素水解物用于木糖醇發酵，不僅產物生成速率提高了一倍以上，產物轉化率也接近提高一倍。表3.生物脫毒處理對木糖醇發酵的影響(初始木糖濃度，150g/L;發酵時間，61.5h)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5將實施例1所得的半纖維素水解物，減壓濃縮至可溶性固形物木糖含量約120g/L，氨水調節至pH5，一組等量接入離心收集的東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098和熱帶假絲酵母CCTCCNO:M205067細胞，另一組則等量接入西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097細胞和熱帶假絲酵母CCTCCNO:M205067細胞。它們的總接種量均約為干細胞50g/L。33°C，200rpm條件下搖瓶同步脫毒發酵30小時。結果(表4)表明，同步脫毒發酵能明顯提高發酵產物濃度，產物生成速率與產物轉化率。表4.半纖維素水解物同步脫毒發酵與直接發酵生產木糖醇性能的比較(初始木糖，120g/L;發酵時間，30小時)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例6.將實施例2所得的半纖維素水解物，減壓濃縮至可溶性固形物木糖含量約60g/L，氨水調節至pH5，分別按東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098與熱帶假絲酵母CCTCCNO:M205067組合，西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097與熱帶假絲酵母CCTCCNO:M205067組合的方式，進行等量混合細胞接種，總接種量約為培養其體積的5X，33t:，200rpm條件下搖瓶同步脫毒發酵80小時。結果(表5)表明，同步脫毒發酵能明顯提高發酵產物乙醇的生成速率與乙醇濃度。表5生物脫毒處理對木質纖維素水解殘渣同步糖化發酵乙醇性能的影響千細胞殘余木糖乙醇濃度組合處理_^_(g/L)(g/100g)CICC1770(對照)740<5CCTCCNO:M206097/CICC1770101025CCTCCNO:M206098/CICC1770122020參見圖1.抑制物經脫毒活性菌株降解后的高效液相色譜變化。其中參數為(A)抑制物，(B)培養基，(C)添加了抑制物的培養基，(D)含抑制物的培養基經CCTCCNO:M206097發酵脫毒，E含抑制物培養其經CCTCCNO:M206098發酵脫毒。峰號與化合物1乙酸，2糠醛1，3愈創木酚，4、5培養基成分，6糠醛降解產物，7愈創木酚降解產物。圖2為蔗渣半纖維水解物生物脫毒前后的HPLC圖譜(檢測波長270nm)。其中參數為A，糠醛標樣；B，蔗渣半纖維水解物；C，經CCTCCNO:M206098脫毒的蔗渣半纖維水解物；D，經CCTCCNO:M206097脫毒的蔗渣半纖維水解物。表6生物脫毒處理之后蔗渣半纖維水解物中某些紫外吸收物的含量變化(檢測波長270nm)0102]200810180438.7.txt0103]OrganizationApplicant0104]----------------------0105]Street:海滄區翁角路289號703單元0106]City:廈門市0107]State:福建省0108]Country:中國0109]PostalCode:3610120110]PhoneN咖ber:0川]FaxNumber:0112]EmailAddress:0113]〈110〉0rganizationName:唐傳生物科技(廈門)有限公司0114]ApplicationProject0115]-------------------0116]〈120〉Title:—種半纖維水解物的生物脫毒方法及脫毒活性菌株0117]〈160>20118]〈170>Patent-In3.50119]〈140〉CurrentAppN咖ber:200810180438.70120]〈141〉CurrentFilingDate:2008-11-270121]Sequence0122]--------0123]〈213>0rganismName:東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)0124]〈400〉PreSequenceString:112出峰時間脫毒前CCTCCNO:M206098CCTCCNO:M206097(min)成分峰面積脫毒后峰面積減少比例(%)脫毒后峰面積減少比例(%)1.4Un1506.6364.975.801001.8Un138.6010001001.9Un575.3384.833.1373.8352,4Uii622.0010001003.2furfursl10747.1467.495.7329.296.97.2Un1195.5071.7162.286.49.1Un500.5234.253.2010010.0Un837.3625.925.3509.139.241.1Un2692.52078.222.8860.368.0峰編號60120180240300360420■54059660120180240300360t肌gcggagg肌肌ga肌cc肌cagggattgcctcagtagCggCg3gtg33gCggC肌g3gctcagatttgaaatcgtgctttgcggcacgagttgtagattgcaggttggagtctgtgtggaaggcggtgtccaagtcccttggaacagggcgcccaggagggtgagagccccgtgggatgccggcggaagcagtgaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaagcgggtggta肌ttccatct肌ggct肌at3ctggcgag3gaccgatagcg肌c肌gtactgtg肌gg肌3g3tg肌肌gC3Ctttg肌33g3g3gtg肌3C3gC3Cgtg3肌ttgttg3aagggaagggtattgcgcccgacatggggattgcgcaccgctgcctctcgtgggcggcgctctgggctttccctgggccagcatcggttcttgctgcaggagaaggggttctggaacgtggctcttcggagtgttatagccagggccagatgctgcgtgcggggaccgaggactgcggccgtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgcaacaccgcccgtcttgaaacacgga〈212〉Type長〈211〉Length:596SequenceName:東方伊薩酵母Sequence〈213X)rganismN咖e:兩方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)〈400>PreSequenceString:2t3tC肌t肌gCgg3gg肌肌g肌3CC肌C3gggattgcctcagtagcggcgagtg肌gcggcaaaagctcagatttgaaatcgtgtttcggcacgagttgtagattgcaggttggagtctttgtggaagcgtgtgtctaagtcccttggaacagggtgccattgagggtgagagccccgtgagacgcgtgcggaagctgtaaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctct肌gtgggtggta肌ttccatct肌ggct3肌tattggcg3gagaccg3tagcg肌c肌gt3Ctgtg肌gg肌3gatg3肌3gC3Ctttg肌肌g3g3gtg肌3C3gC3cgtg肌attgttgaaagggaagggtattgggctcgacatgggatttgcgcaccgctgctccttgtgggcg420gcgctctgtgcttttcctgggccagcatcggtttttgccgcaggagaaggcgtgctggaa■tgtggctcttcggagtgttatagccagtgcgagatgctgcgtgcggggaccgaggactgc540gacatctgtctcggatgctggcacaacggcgcaataccgcccgtcttgtaa591〈212>Type:DNA〈211〉Length:591SequenceName:西方伊薩酵母Sequence--------權利要求一種具有脫毒活性的微生物菌株東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)S-7，它在中國典型培養物保藏中心的編號為CCTCCNOM206098，它的26SrDNAD1/D2區域核苷酸特征序列在GenBank的登記號為EF030708。2.—種具有脫毒活性的微生物菌株西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj-3，它在中國典型培養物保藏中心的編號為CCTCCNO:M206097，它的26SrDNADl/D2區域核苷酸特征序列在GenBank的登記號為EF030710。3.—種半纖維水解物的生物脫毒方法，是以東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098的純培養物，或西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097的純培養物接種至半纖維4.一種用于木糖醇生產的半纖維水解物同步脫毒發酵方法，是以東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098的純培養物，或西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097的純培養物接種至半纖維水解物，并同時接種能發酵五碳糖生成木糖醇的微生物，如熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CCTCCNO:M205067，使半纖維素水解物脫毒與木糖醇發酵在一個反應器內同時完成的過程。5.—種用于乙醇生產的半纖維水解物同步脫毒發酵方法，是以東方伊薩酵母CCTCCNO:M206098的純培養物，或西方伊薩酵母CCTCCNO:M206097的純培養物接種至半纖維水解物，并同時接種能發酵五碳糖生成乙醇的微生物，如嗜單寧管囊(Pachysolentannophilus)CICC1770，使半纖維素水解物脫毒與乙醇發酵在一個反應器內同時完成的過程。6.權利要求3所述的半纖維水解物，其特征在于將木質纖維按固液比(w/v)l:1-7加入濃度為13%(w/w)的稀鹽酸或稀硫酸溶液，在10013(TC下水解0.53小時，使其中半纖維素發生水解。水解結束壓濾出的溶液部分即為半纖維素水解物，用堿調至PH值37，即得可用于生物脫毒的半纖維水解物，最常使用的木質纖維素是禾本科作物的秸稈。7.如權利要求3所述的生物脫毒方法，其特征在于半纖維素稀酸水解物pH值為37、可溶性固形物含量為120%，五碳糖含量點總糖的60%以上，接入CCTCCNO:M206098或CCTCCNO:M206097活細胞，培養溫度2033°C，通氣培養一定時間，然后除去菌體，即可得到發酵性能良好的，以五碳糖為主要成分的半纖維素水解物。8.如權利要求4所述的用于木糖醇生產的半纖維水解物同步脫毒發酵方法，及權利要求5所述的用于乙醇生產的半纖維水解物同步脫毒發酵方法，其特征在于所用的半纖維素水解物必須外加氮源，如無機氮源尿素、硫酸銨；或有機氮源，酵母，米糠熱水浸出物等。全文摘要本發明公開了一種以脫毒活性微生物菌株降解除去存在于半纖維稀酸水解物中的微生物代謝抑制物的方法。本發明所指的脫毒活性微生物菌株，包括東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)CCTCCNOM206098和西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)CCTCCNOM206097，它們均能同時降解存在于半纖維水解物中包括醋酸，糠醛及酚類物質在內的微生物代謝抑制物，具有耐低pH值、不利用五碳糖或其糖醇的特點。可以用本發明活性菌株對半纖維水解物進行單獨的生物脫毒處理，也可以與發酵木糖生成木糖醇，或生成乙醇的菌株混合、接種于半纖維素水解物進行同步脫毒發酵。這種生物脫毒方法能有效改善半纖維素水解物的發酵性能，提高發酵產物乙醇，木糖醇的收率，并具環保、節能的優勢。文檔編號C12P19/02GK101735958SQ200810180438公開日2010年6月16日申請日期2008年11月27日優先權日2008年11月27日發明者周玉恒,張厚瑞,蔡愛華,覃香香,陳海珊申請人:唐傳生物科技(廈門)有限公司