專利名稱：Hmg-1基因核酸原位雜交檢測試劑盒和檢測方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測和疾病診斷領域，更具體地涉及癌癥的基 因檢測技術。
背景技術：
根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌癥的新增人數170萬，死 亡人數近160萬，患者600萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數接 近800萬，患者約有8400萬人，到2020年以上人數將翻一番，這是一組可 怕的數字。
2005年美國衛生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做了一個 年度報告，"認為人類在抗癌大戰中是失敗"，也就是說癌癥死亡率沒有降低， 其列舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是l.腫瘤細胞異質性；2.腫瘤細胞 耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善等。同時，該報告中亦提出應重新審視 現有診治癌癥的措施。前段時間財經雜志的文章報道大標題中國在抗癌戰 斗中大潰敗。
本發明人在研究中發現，導致癌癥死亡率不降的另二個重要原 因是1.不能做到真正的早期診斷;2.轉移的病理機制不清楚。依照 傳統的醫學影像及和其它生化(如蛋白標記物)指標來診斷癌癥， 認為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些有時無 癥狀體征)，這一概念值得認真討論。影像醫學的2公分以下癌塊 屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角度，l公分的腫 塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠 不止2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2 公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實的是在這個過程中，腫塊是癌癥唯一的發生地和 單獨的病灶。臨床上已證實 一旦形成腫塊的同時，其他癌細胞通 過不同途徑遷移到其他部位克隆生長； 一旦切除原發灶后，其他器 官復發灶或多發癌塊灶先后形成或轉移。因此，在臨床上以2公分 以下的腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹，這時已經是晚期了， 這是導致癌癥死亡率不降的真正原因。美國的健康機構都認為早期 診斷是降低死亡率和降到醫療成本的關鍵。
癌癥的發生演變過程和癌基因得能、抑癌基因的失能以及癌癥 轉移基因的得能和癌癥轉移抑制基因的失能有關，也是多基因疾 病。隨著分子生物學技術日益完善，功能基因組學，疾病基因組學 和癌癥基因組學研究的深入開展，至今，有可能在基因水平上做到 更科學的早期診斷，特別是在癌變前期或癌細胞形成(單克隆時)、 突破血管壁早期轉移時，就能做到早期預測診斷。
HMG-1基因是一種致癌基因，它的過度表達引起白血病和人 類其它癌癥的發生。John Hopkins兒童中心研究人員利用遺傳工 程小鼠技術發現了 HMG-1的過度表達可導致兒童和成人白血病及 其它癌癥的發生。他們使用七只在淋巴組織和白細胞上過度表達 HMG-1基因的遺傳工程或轉基因小鼠，發現每只小鼠都很快發展 為人類白血病和淋巴瘤的病例。七只轉基因小鼠攜帶1至28個 HMG-1基因復制，所有小鼠都在1至8個月內出現淋巴瘤并死亡。 一只小鼠被成功的繁殖建立了遺傳工程鼠系，子系小鼠也都發生了 惡性淋巴瘤，多數情況下淋巴瘤發生在動物的胸腺，脾臟，骨髓， 淋巴結和外周血與白血病類疾病發展過程一致。這些小鼠百分之百 的早期發生惡性病變的事實提供的直接證據，證明過度表達 HMG-1基因與癌癥之間關系。同時在人類白血病的骨髓標本中該 基因表達亦過度，而HMG-1基因過度表達是如何干擾正常細胞生 長，導致人類癌癥和白血病發生，研究人員推測該基因的蛋白參與轉錄調節過程有關。過度表達的HMG-1可能與細胞內的信號移動 有關，有文章報道嚴重燒傷和膿毒血癥(炎癥)，機體細胞的修復 生長及炎癥時細胞因子遷移時均有HMG-1表達過度的現象。因此， 當發生癌癥和白血病時，癌細胞和白血病細胞在體內遷移和轉移， HMG-1基因會表達過度。同樣，腫瘤的病理學程度不同，HMG-1 基因的表達量也各不相同，惡性程度高的HMG-1基因的表達水平 高:輕度是18.2%;中度是60%;重度的是83.3%。以上的信息提示， HMG-1基因的表達水平與腫瘤的病理演變的程度有關。
已往對HMG-1基因的研究都采用高通量基因芯片技術，而這 些方法多用于科研方面，不適應臨床應用，特別是個性化的應用在 我國現階段沒有報道。
中國專利文獻CN1556221公開了"IC53基因及其相關產物診斷和治療 結腸癌的用途及一種診斷結腸癌的試劑盒"。中國專利文獻CN1769485公開 了"梓孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測方法及其試劑盒"。中國專利 文獻CN1556410公開了"一種魚類病毒的檢測試劑盒及其檢測方法"。中國 專利文獻CN1680597公開了"一種用于定量檢測丙型肝炎病毒(HCV)的熒光 定量PCR試劑盒"。中國專利文獻CN2918435，公開了"一種檢測肥胖相關 基因SNP的寡核苷酸芯片及試劑盒"。但是，關于HMG-1基因的原位雜交 檢測試劑盒及其檢測技術未見報道。
本發明采用核酸原位雜交技術在單細胞水平上觀察HMG-1基 因的表達量和表達程度，及對臨床各類癌癥和白血病患者的血液標 本進行檢測分析，發現該基因與癌癥和白血病患者的病理演變和轉 移有密切相關，從HMG-1基因表達量的變化，早期從基因水平來 檢測癌基因的表達情況，對臨床癌癥和白血病的病理演變和轉移的 診斷有非常重要的臨床意義。
發明內容
為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下
本發明首先提供一種HMG-1基因核酸原位雜交檢測試劑盒，
其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針分別具有序列表
SEQ ID NO: l所示序列，其分別為HMG-1基因的DNA或RNA
序列。其中，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物，所 述的放射性核素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種，所述的非放射 性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的 一種，所述的非放射性標記物優選自地高辛。
本發明試劑盒的一個優選方案是還包括增強劑(堿性磷酸酶抗 體，購買自羅氏公司)。
本發明的白血病和癌癥早期HMG-1基因診斷試劑盒應用價值 在于，能在基因水平及早對白血病和癌癥的發生做檢測， 一旦病理 演變到癌前變時，就采取治療，降低癌癥的死亡率和發病率。
本發明還提供一種HMG-1基因原位雜交的檢測方法，包括以 下步驟
(1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體 的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體； 和
(2) 檢測所述雜交復合體。 本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的可形成穩定雜
交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42"C;核酸雜交的時間為16—24 小時。
本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的底物選用人的 血液白細胞標本或其他器官組織細胞標本。更優選地是，所述的血 液標本或腫瘤組織細胞標本。
本發明所述的檢測方法，對象是白血病和癌癥病人。本發明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相
結合，以HMG-1基因為檢測對象，合成探針是HMG-1基因的DNA 或RNA序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或腫瘤組織細胞 的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供HMG-1基因 的半定量或定量表達程度判定。根據雜交后免疫組化顯色判定以上 基因的表達量，正常人HMG-1基因不表達，即不顯色，HMG-1基 因在白血病和癌癥病人高表達，即深顯色，該基因在很多癌癥都有 高表達，有特異和廣譜性，臨床意義非常重大。
本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑， 增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均 熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、 鏡下進行定量分析、結果報告。 1.儀器操作
1 ).將待測標本放入反應槽中；
2) .儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3) .儀器自動棄去液體，自動后固定；
4) .儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5) .儀器自動棄去液體，自動清洗；
6) .儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7) .儀器自動棄去液體，自動清洗；
8) .儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；
9) .儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10) .取出封片鏡檢。
本核酸原位雜交的流程圖是分子生物學業內人士均熟知的雜交探針的 制作、標本處理、預雜交、雜交、結果檢測分析的全過程。
圖1是本發明實施例肝癌病人的HMG-1基因表達圖。
圖2是本發明實施例白血病癥病人HMG-1基因表達圖片。
圖3是本發明實施例中正常人HMG-1基因表達圖片。
具體實施例方式
下面將根據流程圖過程，展開實施的步驟，更具體地說明本發明的內容。 應該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發明內容，任何形式上的改變 或變通將落入本發明的保護范圍。 實施例1
按照常規方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以 HMG-1基因為檢測目的基因設計的雜交探針、標記物，其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。
試劑盒組成:
消化液100pL/管l管/盒無色透明液體
保護液100pL/管l管/盒無色透明液體
預雜交液1300pL/管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10pL/管l管/盒無色透明液體
反義雜交液10pL/管l管/盒無色透明液體
封閉液1000pL/管l管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體l管/盒無色透明液體
顯色劑A175pL/管l管/盒黃色液體
顯色劑B320pL/管1管/盒無色透明液體
緩沖液I 10x90mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液II 10x80mL/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液ni iox20mL/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV 10x90mL/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體固定液 90mL/瓶 l瓶/盒 無色透明液體
陽性對照標本 6片/盒
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1. 消化液:20mg/mL蛋白酶K, 100mg蛋白酶K，加DEPC-H20 5mL;
2. 保護液0.2g的glycine加入ImL的lx緩沖液I;
3. 預雜交液lx緩沖液II7.5mL 50xD 3mL
10mg/ml yest t-RNA 750uL
11 mg/ml SALMON TESTES DNA 682uL
0.04M EDTA 3mL
50% formamide 15mL
4. 封閉液0.03g的bloking (購買自羅氏公司)加入ImL lx緩沖
液III;
5. lOx緩沖液I: (PH7.1-7.4) NaCl 80g
Na2HP04.12H20 360g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至IL,并高壓滅菌；
6. lOx緩沖液II: (PH7.0) NaCl 175.3g
檸檬酸鈉88.2g HC1幾滴
加三蒸水至1L,并高壓滅菌；
7. 緩沖液III: (PH7.9) Tris 121.1g
NaCl 87.66gHC160mL左右
加三蒸水至1L，并高壓滅菌；
8. 緩沖液IV:
lMTris-HCl(PH9.5): Tirs 121.1g加HC1 3ml左右，加水900mL，調PH 至9.5，加水至1L，并高壓滅菌；
1MNaCl: NaCl 58.44加水至1L，并高壓滅菌； 0.5MMgCl2: 101.65gMgCl2.6H20加水至1L，并高壓滅菌；
9. 固定液多聚甲醛40g加lx緩沖液I至1 L,稍加熱(約50-60度)攪 拌至溶解；
10. 顯色劑A: NBT lg加70。/。DMF11.44mL;
11. 1顯色劑B: BCIP lg加100%DMF30mL。
實施例2
標本處理:
1) .用10ml的離心管，裝4.5ml淋巴細胞分離液，再將3 ml抗凝血緩慢 加入含有淋巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液^:1.5)的離心管中,2000r/min 離心10 min
2) .吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的lx緩沖 液I,混勻，1500g/min離心10 min
3) .棄上清.沉淀加入約兩倍的lx緩沖液I，混勻，15Q0g/min離心10min
4) .棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液， 滴在玻片上推片,自然干燥。(有條件的醫院可以用制片機制片。)3 ml血， 可以做4張片子。
5) .用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用lx緩沖液I洗5min。 每缸可以放16片。
6) 標本可保存在-2(TC ，或繼續做實驗。實施例3
將試劑盒中試劑配制成使用濃度
1) .將10x緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液I ;
2) .將20x緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2x緩沖液I1;
按1:100稀釋成0.2x緩沖液II;按1:200稀釋成0.1 x緩沖液II;
3) .將iox緩沖液ni用三蒸水按i'.io稀釋成ix緩沖液in;
4) .10x緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成x緩沖液IV (取1#， 2#， 3#各 lOmL,加水至100mL既可)。
實施例4
實驗步驟
1) .取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復查用)及陽性對照標本兩 張(每次實驗做一對陽性對照)。
2) .在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加lx緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。 37。C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37。C處理12 min,再用 lx緩沖液I洗5min.
3) .用0.2%的保護液(保護液lml力B lx緩沖液I99ml即為使用濃度)洗 10min,三蒸水洗5min,以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥。
4) .將玻片放入保濕盒內，加預雜交液20ul/片:蓋上蓋玻片,蓋緊保濕盒，放 在42。C恒溫水浴箱中3h以上。
5) .取出玻片,棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內,用70%,90%，95%的乙醇 各洗2min，自然干燥
6) .將玻片放入保濕盒內，每位病人標本兩張， 一張加正義雜交液20ul/片， 另一張加反義雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42'C恒溫水浴 箱中16-24h。
7) .取出玻片，棄去蓋玻片,將玻片放入玻璃缸內
在42'C恒溫水浴箱中用2x緩沖液II洗兩次,每次15min在42"C恒溫水浴箱中用0.2x緩沖液II洗一次,每次15min 在42"C恒溫水浴箱中用O.lx緩沖液n洗兩次，每次15min
8) .用lx緩沖液m洗30s,取出玻片,自然干燥
9) .將玻片放入保濕盒內,加0.5%1封閉液(lml封閉液加5ml1 x緩沖液III) 100ul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。
10) .取出玻片，用lx緩沖液m洗30s，自然干燥
11) .將玻片放入保濕盒內，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8mllx緩沖液 m)100ul/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min
12) .取出玻片，用lx緩沖液III洗3次，每次15min
13) .lx緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73.3ul,顯色劑B157.5ul加到 30mllx緩沖液IV中，混勻),室溫避光12h以上
14) .用三蒸水洗5min,自然干燥，(用甘油加10%的lx緩沖液I混勻)封片
鏡檢
實施例5
結果判斷
在光鏡下計數100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。 陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。 所有加正義雜交液的陰性內對照應無色。
本發明的一個優選實施例的方案是以HMG-1基因為目的基因合成的 核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、 RNA和寡核苷酸探針，不 但探針的具有生物素標記優點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程 中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待 測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的 存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的基因的表達量。從而獲得癌癥的 診斷信息。 一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例6
白血病人IO名，淋巴瘤癌病人5名，正常對照組10名。抽所 有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示， 所有癌癥患者HMG-1基因有過度表達，細胞染色；正常對照組 HMG-1基因不表達，細胞無染色。具體結果請見圖1是淋巴瘤癌 病人的HMG-1基因表達圖，圖2是白血病癥病人HMG-1基因表 達圖片，圖3是正常人HMG-1基因表達圖片。
本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及 影像醫學檢查有顯著不同。本發明可以在基因水平上(癌變前期或 癌細胞增殖)檢測HMG-1基因異常表達，在影像醫學檢査及其它 檢査未發現占位性癌塊病灶之前，癌癥生化指標未產生異常之前， 亦未形成腫塊之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給 臨床癌癥病患一個真正的早期診斷。這樣才有可能實施癌癥的早期 診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根除癌癥惡疾。
此外，本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點， 同時，本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍 使用和推廣。序列表
SEQUENCE LISTING <110>芮屈生物技術(上海)有限公司
<120> HMG-l基因核酸原位雜交檢測試劑盒和檢測方法與應用 <130〉 /
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<212> DM
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgggcaaag. g.agatcctaa gasigccgaga cggaaaatgt catcatatgc attttttgtg 60
caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120
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tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420
aagcagcctt atgaaaagaa ggctgaaaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480
gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540
agcaaga纖agaaggaaga ggaggaaggt gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600
gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648
權利要求
1. 一種HMG-1基因核酸原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQ ID NO1所示。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的雜交探 針序列如SEQIDNO: 1所示的RNA序列。
3. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的標 記物選自放射性核素或非放射性標記物。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的放射性 核素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種。
5. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一 種。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的非放射 性標記物優選自地高辛。
7. 根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8. —種HMG-1基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法 包括以下步驟a、 將權利要求1或2所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA 接觸，形成雜交復合體；b、 檢測a步驟得到的雜交復合體。
9. 根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成 雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16 —24小時，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其他器官組織細胞 標本，優選地是，所述的血液標本或腫瘤組織細胞標本。
10. 根據權利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測癌癥早期疾病 藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種癌癥早期的原位雜交檢測試劑盒，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物、增效劑，其中所述的雜交探針序列如SEQ ID NO1所示。本發明還提供了一種HMG-1基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a.將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b.檢測a步驟得到的雜交復合體。本發明另外還提供了試劑盒在制備檢測癌癥早期疾病藥物中的應用。本發明優點在于本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點；本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101429551SQ20081017960
公開日2009年5月13日 申請日期2008年11月25日 優先權日2007年11月30日
發明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司