以新的代謝途徑方式由可再生的原材料通過發酵獲得丙酮的制作方法

專利名稱：：以新的代謝途徑方式由可再生的原材料通過發酵獲得丙酮的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于生產丙酮的、新的酶學生物合成途徑，其不同于傳統的發酵方法之處在于不與乙醇和丁醇的形成相偶聯，還涉及用于該目的的酶和核酸。
背景技術：
：梭菌(C/o^r/力'ww)中的ABE法傳統的ABE發酵方法，即利用微生物生產丙酮、丁醇和乙醇，在世界范圍內早已成為第二大生物技術方法，僅次于利用酵母發酵生產乙醇的方法。商業化的ABE發酵于1916年始于英國，尤其是ChaimWeizmann發;見了丙百同丁醇梭菌(C7oWnW^/wacWo6w/y"CM附)具有形成溶劑丙酮、丁醇和乙醇的能力。這一方法在西方世界應用至十九世紀五十年代末，在南美甚至一直應用到1981年。放棄這一方法的兩個基本原因在于首先，丙酮和丁醇的化學合成日益流行，其次發酵底物的價格日益攀升。由于糖蜜被用作牲畜的飼料添加劑，使其價格大幅提高。石油化學產品前體成本的增長，以及微生物途徑工程領域的新技術的可能性，提供了研發高性能菌林和用于生產丙酮等溶劑的工業發酵方法的新選擇。傳統的ABE發酵基于丙酮丁醇棱菌和拜氏梭菌(C/oWA7VZ/ww6e(/en'wd^)。丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌均為革蘭氏陽性，在嚴格的厭氧條件下生長。這些微生物能夠轉化單糖，二糖和多糖，用于發酵的主要的底物是糖蜜和淀粉。上述利用丙酮丁醇梭菌的發酵方法分為兩個階段。第一階段中，生物量的形成與乙酸、丁酸以及痕量的乙醇的形成并行("酸化形成階段(acidogenephase)")。在第二階段中，即所謂的"溶劑形成階段(solventogenephase)，，，所迷的酸用于形成發酵產物丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。野生型的丙酮丁醇梭菌中，產物丙酮、丁醇和乙醇以大約3:6:1的比例形成。這一產物比率根據所選擇的培養條件(例如pH或營養素的供給)或所應用的底物可產生很大的變化。已基本上純化了溶劑丙酮、丁醇和乙醇的生物合成中的酶，并且對其進行了生化表征(參見圖1;Duerre，R，andBahl,H.1996.Microbialproductionofacetone/butanol/isopropanol.In:Biotechnology,vol.6，2nded.M.Roehr，(ed.)，VCHVerlagsgesellschaftmbH，Weinheim，Germany,p.229-268.Duerre,P.1998.Newinsightsandnoveldevelopmentsinclostridialacetone/butanol/isopropanolfermentation.Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639-648.)。丙酮丁醇梭菌的基因組序列也是可以獲得的(Noelling,J.,Breton,G.,Omelchenko，M.V.&16otherauthors(2001).GenomesequenceandcomparativeanalysisofthesolventproducingbacteriumC7o自Wwwac"o6M一cww.JBacteriol183，4823-4838.)。近年來，研究出了大量的可以實現靶定的途徑工程的遺傳工具。目前，可以獲得三個不同的、穩定獲得的復制子(pIM13,pCBU2和pAM1;Leeetal.(1992).Vectorconstruction,transformation,andgeneamplificationinCYo^nW/w/wacWoZw(y//cwmATCC824.Ann.N.Y.Acad.國Sci.665:39-51;Mintonetal.(1993),Clostridialcloningvectors.In:TheClostridiaandbiotechnology(D.R.Woods;editor).Butterworth-Heinemann.Stoneham，USA.pages119-150)以及抗紅霉素和抗甲i風氯霉素的兩個抗生素抗性標記(GreenandBennett(1998).GeneticmanipulationofacidandsolventformationinC7o自W/歸ac"o6w一cwwATCC824.Biotechnol.Bioeng.58:215-21.》另一方面，諸如插入失活或者基因缺失之類的方法還不能常規地進行，即使是基于反義技術的基因表達抑制在此類生物中也存在效力方面的差異，且尚未完全實現(DesaiandPapoutsakis(1999).AntisenseRNAstrategiesformetabolicengineeringofC7o^r/力'Mmac"o6w0^cw/w.Appl.Environ.Microbiol.65:936-45;Tummalaetal.(2003).AntisenseRNAdownregulationofcoenzymeAtransferasecombinedwithalcohol-aldehydedehydrogenaseoverexpressionleadstopredominantlyalcohologenicC7o欲Www"c柳Zw一c歸fermentations.J.Bacteriol.185:3644-53.)。許多公開出版物描述了所謂"溶劑形成的"和"酸形成的，，生物合成途徑代謝工程。基因6"(丁酸激酶)或/m(磷酸轉乙酰酶)的失活導致丁酸和乙酸濃度大幅下降(Greenetal.(1996).GeneticmanipulationofacidformationpathwaysbygeneinactivationinC/oy"W謂ace/o6"Wc謂ATCC824.Microbiology.142:2079-86.;Harrisetal.(2000).CharacterizationofrecombinantstrainsoftheC/oWnWwwac"o6w一c講butyratekinaseinactivationmutant:needfornewphenomenologicalmodelsforsolventogenesisandbutanolinhibitionBioteclmol.Bioeng.67:l-ll.)。不過，這些突變抹形成丁酸和乙酸，這酶。、可能是作為對丙酮酸積累的應答，兩菌林均形成高濃度的乳酸，而在野生型丙酮丁醇梭菌中沒有乳酸積累，乙醛/乙醇脫氫酶fl^五/^w/的失活導致丁醇形成被嚴重破壞，但與此同時丁酸濃度增加。當aW￡7flfld基因在這一突變體中的質粒上表達時，可以重建野生型中的正常丁酸和丁醇濃度。有趣的是，在爿^i五/a^/突變林或帶有互補的菌林中均不能檢測到丙酮的形成。這一現象基于極性作用(polareneffekten)，其對位于下游的兩個基因起作用。這兩個基因編碼對于丙酮合成所必需的、輔酶A轉移酶的兩個亞基(Green，E.M，andBennett,G.N.1996.Inactivationofanaldehyde/alcoholdehydrogenasegenefromC7os/"diMWace《o&w妙c訓ATCC824.Appl.Biochem.Biotechnol.57/58:213-221)。這是第一個被描述的、通過丙酮丁醇梭菌中的途徑工程可使丙酮與丁酸形成彼此解偶聯的實例。這一現象得到其他出版物的證實。在這些工作中所研究的微生物菌林由于缺乏192kb的大質粒(Megaplasmid)pSOLl喪失了形成丙酮和丁醇的能力。用于丙酮丁醇形成的基因大多位于該質粒上，這些基因中的一些也用于乙醇的合成(Comillot，E.，Nair，R，，Papoutsakis，E.T.，andSoucaille,P.1997.ThegenesforbutanolandacetoneformationinC/o加W歸flc"o&t/一CMWATCC824resideonalargeplasmidwhoselossleadstodegenerationofthestrain.J.Bacteriol.179:5442-5447)。這些退化菌林只能形成野生型菌抹所形成的乙醇量的一半。這些衍生自丙酮丁醇梭菌ATCC824的菌抹被稱作M5(經化學誘變產生)和DG1(由野生型的多次培養(mehrfacheKultivierung)獲得。這些菌林作為質粒受體，所述的質粒包含有輔酶A轉移酶亞基A和B(W/y4和的蛋白質編碼序列，以及乙酰乙酸脫羧酶基因(adc)，或丁趁/丁醇脫氫酶基因(fl^五/加J)。所得的菌株只產生丙酮或丁醇(MermelsteinWa/.(1993).MetabolicengineeringofC/oWrW歸acefo6w/y//cwwATCC824forincreasedsolventproductionbyenhancementofacetoneformationenzymeactivitiesusingasyntheticoperon.Biotech.Bioeng,42:1053-1060.;Nair，R.V.，andPapoutsakis,E.T,1994.Expressionofplasmid-encodedoac/inC7os,rW謂flc柳6wWc歸M5restoresvigorousbutanolproduction.J.Bacteriol.176:5843-5846;Cornillot，E.，Nair，R.,Papoutsakis,E.T.，andSoucaille，P.1997.ThegenesforandacetoneformationinC7o57nW謂ace/o6w(y//cwwATCC824resideonalargeplasimdwhoselossleadstodegenerationofthestrain.J.Bacteriol.179:5442-5447)。所測定的各溶劑的滴度總是低于野生型中的丙酮和丁醇濃度，并且乙酸和丁酸可積累至總濃度達240mM。通過帶有fld/^/aaJ基因的質粒可以使乙醇形成恢復至野生型水平。圖2描述了梭菌中丙酮合成的經典代謝途徑。該途徑由乙酰-輔酶A起始，是一種在所有微生物中形成的中心代謝(zentralenMetaboliten),無關乎是哪種碳源代謝或建立了哪種代謝途徑。所需的酶為-酮硫解酶，乙酰-輔酶A/丁酰-輔酶A轉移酶的兩個亞基以及乙酰乙酸脫羧酶。可以顯示出在大腸桿菌中異源表達這些由乙酰-輔酶A(乙酰乙酸脫羧酶，乙酰-輔酶A/丁酰-輔酶A轉移酶和硫解酶，起始催化丙酮形成的、來自丙酮丁醇梭菌的酶導致在所述微生物中形成約150mM的丙酮，盡管也以不利的方式形成了大量的乙酸鹽(50mM)(BermejoL.L.，N.E.Welker,E.T.Papoutsakis.1998.ExpressionofC7oWWcf!'wwac"oZm一c謂ATCC824Genesin五scAmc/naco//foracetoneProductionandAcetateDetoxification.Appl.Env.Microbiol.64:1079-1085)。上述情況的另外一個不利的方面在于丙酮只能在需氧條件下產生，這是因為在大腸桿菌中，由葡萄糖到乙酰-輔酶A的代謝中所產生的氧化還原等價物(Redoxequivalente)不能在厭氧條件下被再氧化。在該方法中，通過催化所述反應的酶使從乙酰乙酰基脫離的輔酶A再次轉移到受體分子。酰基輔酶A-切割酶水解酰基輔酶A的酶可以是，例如酰基輔酶A硫酯酶或酰基輔酶A硫激酶。通過酰基輔酶A硫酯酶或酰基輔酶A合成酶/酰基輔酶AGTP，這是因^與ATP的水解的Go，值(-31.8kJ)相匕，乙酰乙酰Jt酶A水解具有更高的Go，值(-44kJ)。乙瘋乙瘋^T雄j7入爽爽^:cj./.2.")該酶催化乙酰乙酰輔酶A水解為乙酰乙酸和輔酶A，且不同時將輔酶A分子轉移到如羧酸之類的受體分子。教差裙雄X碗游爽(^C3./.么/^來自流感嗜血桿菌(//aewo/)/n7wj^/7wew加e)的蛋白YbgC是一種特異于短鏈分子并接受丁酰-輔酶A和-羥基丁酸-輔酶A作為底物的酰基輔酶A硫酯酶(EC3.1.2.18)。相應于上述底物的Km值分別為24mM和20mM(Zhuangetal.(2002).TheYbgCproteinencodedbythe_y6gCgeneofthetol-palgeneclusterof//^歸//7^/"/7wewzaecatalyzesacyl-coenzymeAthioesterhydrolysis.FEBSLett516:161-3.)。也描述了枯草芽孢桿菌中的、具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列以及SEQIDNo.2所示的相應cDNA序列的硫酯酶II(TEIIsrf),其與酶相關(SchwarzerD.,H.D,Mootz，U.Linne，M.A.Marahiel.2002.RegenerationofmisprimednonribosomalpeptidesynthetasesbytypeIIthioesterases.PNAS99:14083-14088)。應Jt^雄J合4雜/教差裙獰」減Jf雄r伴趁v4MP合成/五C6.2丄2,合^/EC6.么厶/0"這兩種酶的生理功能是涉及酰基輔酶A合成，但已知也有這些酶催化形成ATP的、反向水解反應的實例，例如，三羧酸循環中的琥珀酰-輔酶A硫激酶。目前還沒有實例表明，上述的酶類可以在體外或體內水解乙酰乙酰輔酶A形成乙酰乙酸但不形成輔酶A。針對來自苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的AcsA2已描述了由酰基輔酶A合成酶降解多羥基烷烴類伴隨AMP形成(Anejaetal.(2002).IdentificationofanacetoacetylcoenzymeAsynthetase-dependentpathwayforutilizationofL-(+)國3勿droxybutyrateinSi"oA/zoZ^函J.Bacteriol.184:1571-7.)。利用來自銅綠假單胞菌(尸"w^/wo"w"en^/"o510！)的進一步純化(伴隨AMP形成；EC6.2.1.2)。該酶接受丁酰-輔酶A和-羥基丁酰-輔酶A和2-酮基丁酸作為底物，其分別具有很低的Km值10，25和25fjJVI(Shimizuetal.(1981).Butyryl畫CoAsynthetaseof尸"wdo歸wa^aen/gi"cwa-purificationandcharacterization.Biochem.Biophys.Res.Commun.103:1231-7.)。由此本發明的目的在于提供一種新的、簡化的、由乙酰-輔酶A起始合成丙酮的途徑。
發明內容本發明涉及重組酶技術的輔助下的、改良的丙酮生產由乙酰-輔酶A起始，由乙酰乙酰輔酶A產生乙酰乙酸，接下來再轉化成丙酮和C02。由此，本發明涉及權利要求1所述的生產丙酮的方法；涉及權利要求18所述的酶的用途，所述的酶使得本發明的方法中的步驟B得以實施；還涉及權利要求17所述的核酸序列，以及如權利要求19所迷的核酸序列的用途，所述的核酸序列的翻譯產物能夠催化本發明的方法。本發明的方法的有益之處在于，所述的丁酸-乙酰乙酸輔酶A轉移酶被一種能以單體形式發揮作用的酶替代，所述的丁酸-乙酰乙酸輔酶A轉移酶由兩個亞基組成、在常規的系統中將乙酰乙酰輔酶A轉化成乙酰乙酸。由此，本發明進一步的有益之處在于，在給定的系統中的丙酮產量高于利用已知的丁酸-乙酰乙酸輔酶A轉移酶所產生的丙酮的量。再一有益之處在于，在所述生產方法中乙酸鹽與丙酮的比率向有利于丙酮的方向偏移。本發明的方法的又一有益之處在于，事實上，丙酮合成不與丁醇和乙醇合成相偶聯，由此在施用時所產生的醇類副產物不對生產微生物產生毒害。這可使培養基中的產物濃度更高，由此提高時空產量。以與丁醇和乙醇不相偶聯地生產丙酮的另一有益之處在于成為一種簡化的發酵工藝，簡化了產品的分離與加工，這是因為該工藝不再需要將丙酮與醇類副產物相分離。與傳統的ABE發酵中的產品分離相比，本發明的工藝的能量消耗較小。本發明的方法的又一有益之處在于其可在多種已詳細表征了的微生物中進行，在好氧以及厭氧條件下均能良好地培養所迷的微生物，并已知對其施以多種遺傳操作以提供進一步改良的可能性。總之，由發酵可再生的原材料有效地制備丙酮進一步對環境友好、資源節約型工業化學品生產作出貢獻。具體實施例方式方法中的用途通過下述示例方式進行描述，本發明并不pi于下述示例性的實施方案。本發明的說明書中所引用的文獻意在將其所公開的全部內容納入本發明。多肽指具有任意鏈長的。因此，其還包括任何蛋白質、酶，特別是乙酰乙酸輔酶A水解酶，酰基輔酶A硫酯酶，酰基輔酶A合成酶或酰基輔酶A硫激酶。"自發轉化"指一種產生能量的化學反應。"在嚴格條件下"雜交指試驗條件，例如在Northern印跡技術中在50-70。C，優選60-65°C下的洗滌溶液的應用，譬如應用含0.1%SDS的0.1xSSC緩沖液(20xSSC:3MNaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)洗脫非特異性雜交的cDNA探針和寡核苷酸。在該條件下，只有那些高度互補的核酸能夠保持彼此間的結合。設定嚴格條件是本領域技術人員已知的，并描述于例如Ausubeletal.，Ci^rewf尸rafocoZsMo/ecw/arB(o/ogy，JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。本發明包括由乙酰-輔酶A制備丙酮的方法，該方法包括下述步驟A由乙酰輔酶A酶促轉化為乙酰乙酰輔酶A;B:由乙酰乙酰輔酶A酶促轉化為乙酰乙酸和輔酶A;和C.由乙酰乙酸脫羧產生丙酮和C02,其特征在于在步驟B中，輔酶A不轉移到受體分子中。可以在本發明的步驟A中應用13-酮硫解酶來將乙酰輔酶A酶促轉化為乙酰乙酰輔酶A。優選使用來自梭菌屬菌種，即梭菌屬的微生物的！3-酮硫解酶，特別優選來自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的。步驟A中的酶促轉化優選由具有酮硫解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列與SEQIDNo.16的氨基酸序列至少90%，ii優選至少95%,更優選96，97,98，99或100%同一。在本發明的方法的步驟C中，可以應用乙酰乙酸脫羧酶將乙酰乙酰輔酶A酶促轉化為丙酮和C02。優選使用來自梭菌屬菌種，即梭菌屬的微生物的乙酰乙酸脫羧酶，特別優選來自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的。步驟C中的酶促轉化優選由具有乙酰乙酸脫羧酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列與SEQIDNo.18的氨基酸序列至少90%，優選至少95%,更優選96，97，98,99或100%同一。在本發明的方法的進一步優選的實施方案中，步驟C的轉化是自發進行的。本發明的丙酮生產方法的區別特征在于，在步驟B中輔酶A不轉移到受體分子之中。這可通過應用具有乙酰乙酰輔酶A水解酶活性的酶來實現。令人驚訝的是也可以通過迄今為止未知具有乙酰乙酸輔酶A水解酶活性的酶來實現這一目的，例如，選自酰基輔酶A>5危酯酶，酰基輔酶A合成酶或酰基輔酶A硫激酶的酶。因此，在本發明的方法的優選實施方案中，步驟B中的酶促轉化可由乙酰乙酸輔酶A水解酶，酰基輔酶A硫酯酶，酰基輔酶A合成酶或酰基輔酶A硫激酶催化進行。在本發明的方法優逸實施方案中，步驟B中的酶促轉化可以應用具有乙酰乙酸輔酶A水解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列與SEQIDNo.1的氨基酸序列至少90%,優選至少95%,更優選96，97,98，99或100%同一。在本發明的方法優選實施方案中，步驟B中的酶促轉化可以應用具有乙酰乙酸輔酶A水解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列與SEQIDNo.3的氨基酸序列至少90%,優選至少95%，更優選96，97，98，99或100%同一。在本發明的方法優選實施方案中，步驟B中的酶促轉化可以應用具有乙酰乙酸輔酶A水解酶活性、且具有下述氨基酸序列的多肽催化，所述的氨基酸序列與SEQIDNo.5的氨基酸序列至少90%,優選至少95%,更優選96,97,98，99或100%同一。本發明的方法優選地通過微生物實施。其它用于該方法的微生物可以是本身即具有合成丙酮的能力的微生物，也可以是通過遺傳途徑工程賦予其丙酮形成能力的微生物。這可以通過提高細胞濃度或酶的活性來實現，所述的酶催化由乙酰-輔酶A起始的、不依賴于乙酸鹽的丙酮合成。本發明的方法優選地在經遺傳修飾的微生物中實施。可能的例子來自下述的屬，即選自梭菌屬(C/o^nW/m/w)，發酵單胞菌屬(Z戸o膨w^y)，埃希氏菌屬(Eyc力e〃'c/i/fl)，沙門氏菌屬(5W歸we〃a)，紅球菌屬(//io(/ococci^)，假單胞菌屬(Pset^omowas),芽孢桿菌屬(5ac〃/ws)，專'L沖干菌屬(丄a"o6a"7/ws)，腸-求菌屬(五w"rococcw51)，產堿桿菌屬(爿/ca/!'ge"w)，克雷伯氏菌屬(A7eZwe//a)，類芽孢桿菌屬(尸ae"/6ac/〃t^),節桿菌屬(y4r/力w6flc/e")，棒軒菌屬(C0/7we6a"eWww)，#豆4干菌屬(5"W6ac《en'ww)，畢赤氏酵母屬(P/c/'a)，假絲酵母屬(Cam/!Wa),漢遜氏酵母屬(//a/we"w/a)和糖酵母屬(Sflcc/wro/nKes)。上述屬中的種的例子有大腸桿菌(5^cAen'c/^'aco//)，真養產堿桿菌(J/caZ/'gewesewZrop/wj)，地衣芽孑包桿菌(5a"7/w//c/jem/orw/s)，浸麻類芽孑包桿菌(尸aem'6a"7/1^wflcera/w)，紅串紅球菌(//iodococa^eo^AwpoMs),惡臭假單胞菌(■Ryewdowowfl^/7w"V/a)，屎腸球菌(E"&rococc"s/ae"'謂)，鴉雞腸球菌(￡w/eracoccuyg"〃/wcrWww)，類腸球菌(E",eracocct^^ecoZ/i1)，^古草芽孢桿菌(Bac"Zwssw&"7h)和酉良酒酵母(iSacc/iaromycescerevi's/ae)。優選選自下迷的生物，即大腸桿菌，谷氨酸棒桿菌(Coo^e6ac《enwwg/Wa/n/cw/n)，梭菌屬菌種(C/ojW力'w附j/7ec,),醋酸梭菌(C7oWnVZ/wm)，伍氏醋酸桿菌(爿ce^6a"er/wwwoo力7)，丙酮丁醇梭菌(C/oWnW/wwflc"o6"(y/z'cwm)，拜氏梭菌(C7oW^/zw附&e(/en>zd^),解脂耶氏酵母(FamnWa/!》o/y"ca),釀酒酵母屬的種(Sacc/iflrawycesspec.)，釀酒酵母和巴斯德畢赤氏酵母(尸z'c/n'fl/7flWon;y)，特別優選地，將"大腸桿菌pUC19ayt",參見實施例5和6，用于本發明的方法。本領域技術人員已知可以利用遺傳重組技術制備重組的微生物。一般而言，可以通過常規的轉化或轉染技術將帶有外源基因的栽體插入至'J細月包中。適用的方法可參見SambrookWa/.(MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,1989)。戶斤使用的微生物可以是通過誘變和篩選，通過重組DNA技術和通過上述兩種方法的組合產生的菌林。可以應用，利用如N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍或紫外光的經典體內誘變方法進行誘變。也可以利用體外誘變方法進行誘變，例如利用羥胺進行處理(Miller,J.H.:AShortCourseinBacterialGenetics.ALaboratoryManualandHandbookforEscAmc/i/aco//andRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，1992)或應用誘變寡核苷酸進行處理(T.A,Brown:GentechnologieftirEinsteiger，SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg,1993)或應用Newton和Graham所著手冊中描述的聚合酶鏈式反應(PCR)(PCR，SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg,1994)進行處理。有關產生突變的進一步的指導可參考現有技術以及已知的遺傳及分子生物學教科書，例如Knippers著("MolekulareGenetik"，6thedition,GeorgThiemeVerlag,Stuttgart,Germany,1995)，Winnacker著("GeneundKlone"，VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim，Germany,1990)或者Hagemann著("AllgemeineGenetik"，GustavFischerVerlag,Stuttgart,1986)。應用體外方法時，可以由自野生型菌抹中分離的總DNA通過聚合酶鏈式反應擴增現有技術中所描述的基因，并根據需要將其克隆到合適的質粒栽體中，接下來將所述DNA應用于誘變方法中。通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA序列的有關指導，本領域技術人員可以參考，特別是Gait所著的手冊寡核苷酸合成實用方法(OligonucleotideSynthesis:APracticalApproachIRLPress,Oxford,UK,1984)以及Newton和Graham所著的PCR(SpektrumAkademischerVerlag，Heidelberg,Germany,1994)。類似地，也可以應用體外誘變方法，例如Sambrook等所著的公知手冊中所描述的(MolecularCloning,ALaboratoryManual，2nde丄，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,USA,1989)。相應的方法也可通過所謂"試劑盒"的形式通過商業途徑實施，例如"QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit",參見Papworth等(Strategies9(3)，3-4(1996))以及由Stratagene(LaJolla，USA)所提供的那些。本發明也涉及包含用于本發明的多核苷酸的載體，特別是質粒，以及如果需要，在所述細菌中的適當復制。由此，本發明也涉及用上述栽體轉化的重組微生物。在此方面中涉及的多核普酸受控于一個或多個啟動子的作用。在此方面，術語"增強(Verstarkung)"指提高微生14物中的、由相應的DNA編碼的一種或多種酶或蛋白質的胞內活性或濃度，例如通過增加基因、ORF，至少1個拷貝的，拷貝數，將強啟動子功能性連接于所述基因，或者利用編碼具有高活性的所述酶或蛋白質的基因、等位基因或ORF，如果需要，將上述方法組合。大腸桿菌中的強啟動子的例子為/ac，fac和&/7。開放閱讀框(ORF)指在現有技術中未被賦予功能的、編碼或可以編碼蛋白質、多肽或核糖核苷酸的核苷酸序列節段。在被賦予功能后，所述核苷酸序列的相關節段通常被稱作基因。等位基因通常指所給定的基因的經改變的形式。由于核苷酸序列不同以使它們的形式相區別。基因產物通常指由核苷酸序列，即ORF,基因或等位基因所編碼的蛋白質，或所編碼的核糖核酸。相應蛋白質的活性或濃度通常通過上述的增強方法提高，特別是過表達基于野生型蛋白質的活性或濃度、或未進行所述蛋白質或酶的重組的微生物或親林中的蛋白質活性或濃度，至少10%,25%，50%,75%，100%，150%，200%，300%，400%或500%，最高達1000%或2000%。非重組微生物或親林指對其實施本發明的增強或過表達的微生物。基因或基因構建體可存在于具有不同拷貝數的質粒上，也可以整合并擴增于染色體上。作為實現相關基因過表達的另一種方式可以改變培養基的組成或培養方式。本發明還涉及一種方法，其中，經遺傳修飾的微生物表達編碼上述蛋白編碼酶的核酸，其可用于步驟A-C。本發明的方法的特征在于，所述的微生物至少包含核酸a，其至少編碼下述一個多肽，所述多肽具有酮硫解酶活性且具有與SEQIDNo.16的氨基酸序列至少90%,優選至少95%,更優選96，97,98,99或100%同一的氨基酸序列，核酸b,其至少編碼下述一個多肽，所述多肽是乙酰乙酸輔酶A水解酶，酰基輔酶A^5危酯酶，酰基輔酶A合成酶或酰基輔酶A>5充激酶，或具有乙酰乙酸輔酶A水解酶活性且具有與SEQIDNo.1的氨基酸序列至少90。/。，優選至少95%,更優選96，97，98，99或100%同一的氨基酸序列，或具有乙酰乙酸輔酶A水解酶活性且具有與SEQIDNo.3的氨基酸序列至少90%，優選至少95%,更優選96，97,98,99或100%同一的氨基酸序列，或具有乙酰乙酸輔酶A水解酶活性且具有與SEQIDNo.5的氨基酸序列至少90%,優選至少95%,更優選96，97，98，99或100%同一的氨基酸序列，以及核酸序列c，其至少編碼下述的一個多肽，所述多肽具有乙酰乙酸脫羧酶活性且具有與SEQIDNo.18的氨基酸序列至少90%，優選至少95%,更優選96，97，98，99或100%同一的氨基酸序列，所應用的核酸a,b和c保證所述多肽在所述微生物中的表達。優選用于本方面的核酸a選自aa序列17或其互補鏈所描述的DNA序列，bb與aa中所述的DNA序列在嚴格條件下雜交的DNA序列，cc在無遺傳密碼簡并的情況下，與aa和bb中所定義的DNA序列雜交的DNA序列。優選使用的核酸c選自dd序列19或其互補鏈所描述的DNA序列，ee與dd中所述的DNA序列在嚴格條件下雜交的DNA序列，ff在無遺傳密碼簡并的情況下，與aa和bb中所定義的DNA序列雜交的DNA序列。優選使用的核酸b選自gg序列2或其互補鏈所描述的DNA序列，hh與gg中所述的DNA序列在嚴格條件下雜交的DNA序列，ii在無遺傳密碼簡并的情況下，與gg和hh中所定義的DNA序列雜交的DNA序列。16或更優選地選自jj序列4或其互補鏈所描述的DNA序列，kk與jj中所述的DNA序列在嚴格條件下雜交的DNA序列，11在無遺傳密碼簡并的情況下，與jj和kk中所定義的DNA序列雜交的DNA序列，或特別優選地選自mm序列6或其互補鏈所描述的DNA序列，nn與mm中所述的DNA序列在嚴格條件下雜交的DNA序列，oo在無遺傳密碼簡并的情況下，與mm和nn中所定義的DNA序列雜交的DNA序列。在本發明的方法的優選實施方案中，所述的核酸a，b和c位于可是全部三個基因的產物表達的核苷酸鏈上。特別優選地，所述的核酸a，b和c位于一條核苷酸鏈上，且后者選自具有如SEQIDNo,7所示的核酸序列的質粒pSKatt，具有如SEQIDNo.8所示的核酸序列的質粒pKSatt，具有如SEQIDNo.9所示的核酸序列的質粒pUC19att，具有如SEQIDNo.10所示的核酸序列的質粒pUC18att,和具有如SEQIDNo.11所示的核酸序列的質粒pUC19ayt。本發明由此涉及具有如SEQIDNo.7所示的核酸序列的質粒pSKatt，具有如SEQIDNo.8所示的核酸序列的質粒pKSatt，具有如SEQIDNo.9所示的核酸序列的質粒pUC19att，具有如SEQIDNo.10所示的核酸序列的質粒pUC18att，和具有如SEQIDNo.11所示的核酸序列的質粒pUC19ayt。本發明還涉及酰基輔酶A疏酯酶，酰基輔酶A合成酶或酰基輔酶A硫激酶在將乙酰乙酰輔酶A酶促轉化為乙酰乙酸和輔酶A中的用途。鑒于大多數酶的高底物特異性，這些酶均接受乙酰乙酸輔酶A作為底物，對本領域技術人員而言出乎意料且無法預知的'具有酰基輔酶A疏酯酶，酰基輔酶A合成酶或酰基輔酶A硫激酶活性的多肽在將乙酰乙酰輔酶A酶促轉化為乙酰乙酸和輔酶A中的用途是優選的，所述的多肽為乙酰乙酰輔酶A水解酶，酰基輔酶A硫酯酶，酰基輔酶A合成酶或酰基輔酶A;充激酶，或者具有與SEQIDNo.l的氨基酸序列至少90%，優選至少95%，更優選96%,97%,98%,99°/。或100%同一的氨基酸序列，或具有與SEQIDNo.3的氨基酸序列至少90%，優選至少95%,更優選96%，97%，98%,99%或100%同一的氨基酸序列，或具有與SEQIDNo.5的氨基酸序列至少90%，優選至少95%，更優選96%，97%,98%，99%或100%同一的氨基酸序列。本發明還涉及選自gg到oo的至少一個核酸b在利用其基因產物將乙酰乙酰輔酶A轉化為乙酰乙酸和輔酶A中的用途。下述實施例，通過不將本發明限定到所述實施例的實施方案的示例性方式對本發明進行詳細描述，本發明的應用范圍由全部的說明書、權利要求書來體現。圖1:丙酮，丁醇和乙醇的生物合成圖2:丙酮的生物合成圖3:TEIIsrf在大腸桿菌M15中的表達圖4:由大腸桿菌中純化TEIIsrf圖5:為確定TEIIsrf對底物乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A的Km{直的ALineweaver-Burk圖圖6:AACS在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達圖7:由大腸桿菌中純化AACS圖8:YbgC的表達和純化圖9:連續向質粒pSK中克隆基因adc，"/Zy/"/和""的示意圖。圖10:制備pUC19構建體圖ll:在帶有不同表達栽體的大腸桿菌HB101的5ml培養物中形成丙酮和乙酸鹽圖12:在帶有pUC19ayt(YbgC)和pUC19act(對照CtfA/B)的大腸桿菌HB101的100ml培養物中形成丙酮和乙酸鹽。實施例實施例1:來自枯草芽孢桿菌的硫酯酶II(TEIIsrf)該酶與用于在枯草芽孢桿菌ATCC21332中形成表面活性肽(肽抗生素)的非核糖體肽合成酶相關。Schwarzer等能將相應的基因克隆到介導靶蛋白與C末端His標記物(pTEIIsrf)相融合的質粒pQE60中并純化所述蛋白質(28kDa)(SchwarzerD.，H.D.Mootz，U.Linne，M.A.Marahiel.2002.RegenerationofmisprimednonribosomalpeptidesythetasesbytypeIIthioesterases,PNAS99:14083-14088)。在接下來的研究中證明了該蛋白以乙酰一輔酶A和丙酰一輔酶A為底物的水解活性。帶有SEQIDNO.13的質粒pTEIIsrf的制備如SchwarzerD,MootzHD，LinneU,MarahielMA所迷(RegenerationofmisprimednonribosomalpeptidesythetasesbytypeIIthioesterases.ProcNatlAcadSciUSA.2002Oct29;99(22):14083-8)。在LBAmp培養基中于30。C、150轉/分鐘條件下培養的大腸桿菌M15中表達所述蛋白，在光密度(OD6oonm)0.6-0.8用1mMIPTG誘導。2小時后收集所述培養物。在培養過程中采集的樣品證實了蛋白質的成功表達。圖3顯示的是Coomassie染色后的12%SDS聚丙烯酰胺凝膠，所述凝膠中的每一泳道中添加了15pl粗提物；1:誘導前，2:誘導后1小時，3:誘導后2小時。利用確定游離SH基團的DTNB試驗[5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)]確定待分析的活性要求將蛋白質進行純化。這依賴于在Ni2+-NTA瓊脂糖和遞增的咪唑梯度上進行的金屬螯合親和層析的方式，通過TEIUf的融合His標記物在FPLC的協助下完成。為實現該目的，開始，收獲所述細胞(5000xg，15min，4°C)，將其懸浮于3ml/g鮮重的細胞裂解緩沖液(50mMHEPES,300mMNaCl，pH7.8)中，需要時儲存于-20。C。通過超聲處理(SonicatorBandelinSonopuls，BandelinBerlin)裂解細胞，離心(30000xg，30min，4。C)收集粗提物，在FPLC系統(PharmaciaBiotechGmbH)中進行純化。將3.5ml粗提物上樣于根據制造商的說明制備并平衡(50mMHEPES，300mMNaCl,30niM咪唑，pH7)的Ni2+-NTA瓊脂糖柱(QiagenSuperflow,床體積5ml)。隨后用50ml的平衡緩沖液洗柱。用50ml(30-300mM咪唑于50mMHEPES,300ml的NaCl中，pH7)線性梯度咪唑洗脫。圖4上部示出依照下述程序在N產-NTA瓊脂糖(QiagenSuperflow，床體積5ml)上的FPLC洗脫圖語洗0-50ml,用30-300mM咪唑(線性梯度)洗脫50-100ml，級分大小各1ml;圖4下部示出Coomassie染色的12%SDS-PAGE凝膠，其上，洗脫級分23-31,每種情況下，每一泳道上樣lMg蛋白。將所述級分合并用于活性測定。所用的底物為乙酰乙酰輔酶A，以及用于比較的乙酰-輔酶A。在所述的DTNB試驗中，輔酶A末端已通過向乙酰乙酸或乙酸鹽的酶促轉化游離出來的巰基與DTNB反應，形成可通過光度測定法在412nm檢測到的顯色產物。測定了下述的kM值乙酰-輔酶A為2x10"mol.1"(0.2mM)，乙酰乙酰輔酶A為7.7xlO^mol.r1(0.77mM)。由此，TEIIsrf對乙酰-輔酶A顯示出更高的底物親合性。圖5顯示用于確定TEIIsrf對底物乙酰-輔酶A和乙酰乙酰輔酶A的Km值的Lineweaver-Burk圖。實施例2:來自苜蓿中華根瘤菌的乙酰乙酰輔酶A合成酶(AACS)具有SEQIDNo,3所示氨基酸序列以及SEQIDNo.4所示的相應cDNA序列的、來自苜蓿中華根瘤菌的乙酰乙酰輔酶A合成酶(AACS)催化伴隨ATP消耗的、由乙酰乙酸和輔酶A轉化為乙酰乙酰輔酶A和AMP。但在本發明的框架下，所關注的是其逆反應。如Aneja,P.，R.Dziak，G.-Q.Cai，T.C.Charles,2002.IdentificationofanAcetoacetylCoenzymeAsynthetase-DependentPathwayforUtilizationofL-(+)-3勿droxybutyrateinSinorhizobiummeliloti.J.Bacteriol.184:1571-1577所迷將相應基因acW2克隆到表達栽體pET30Xa/LIC中。通過此種方式獲得的質粒"pRD112"介導靶蛋白N末端與His標記物融合，籍此利于在N嚴-NTA瓊脂糖上由親和層析進行純化。所述的蛋白的表達在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中于37。C下180轉/分鐘條件下進行。在光密度(OD60()nm)0.5-0.6下，用1mMIPTG20誘導培養物，然后繼續培養3小時。由生長過程中采集的樣品證明了所述蛋白質(約72kDa)的成功表達。圖6顯示出Coomassie染色后的7.5%SDS-PAGE凝膠；所迷凝膠中的每一泳道中添加了15nl粗提物(快速細胞裂解物)；1:誘導前，2:誘導后1小時，3:誘導后2小時。利用類似于TEIIsrf的方式，通過Ni2+-NTA瓊脂糖和20-250mM的咪唑(圖.7A)梯度上金屬螯合親和層析進行純化。其間出現了兩個峰(1和2)，檢測了所述級分的蛋白質含量。接下來利用7.5%SDS-PA凝膠分析表明，特別是對于第一個峰，在約55kDa處出現一個另外的帶。由于這條帶在第二個峰中很弱或者說并不存在，將這一峰的級分合并用于活性測定。用于DTNB試驗的底物還是乙酰乙酰輔酶A以及作為比較的乙酰-輔酶A。Km值的確定給出了以乙酰-輔酶A作為底物的7xl0-4mol.r1(0.7mM)。另一方面，所測定的針對乙酰乙酰輔酶A的值不足以確定Km。但由于該酶與乙酰乙酰輔酶A的特異活性僅為0.0038pmol.min".mg",來自苜蓿中華根瘤菌的AACS以及與梭菌屬的基因一起克隆的相應基因均沒有繼續應用。圖7顯示來自大腸桿菌的AACS的純化，上部示出依照下述程序在Ni2+-NTA瓊脂糖(QiagenSuperflow，床體積5ml)上的FPLC洗脫圖譜洗0-100ml，用20-250mM咪唑(線性梯度)洗脫100-150ml級分大小各1ml;圖7下部示出經銀染的7.5%SDS-PAGE凝膠，其上.，由峰1和峰2選擇的洗脫級分，每種情況下，每一泳道上樣lpg蛋白。CE:粗提物，FT:流通(Durchlauf;flow-through)。實施例3:來自流感嗜血桿菌的酰基輔酶A硫酯酶YbgC具有SEQIDNo.5所示氨基酸序列以及SEQIDNo.6所示的相應cDNA序列的、來自流感嗜血桿菌的YbgC蛋白表現出與來自大腸桿菌的相應蛋白質的相似性，后者作為胞漿蛋白屬于所謂的Tol-Pal系統。其廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中。其對于維持細胞壁的完整性是重要的，并且可能具有轉運底物通過周質的功能。YbgC在流感嗜血桿菌中的功能以及其與Tol-Pal系統的功能之間的任何聯系迄今并未被公開。但是，Zhuang等(2002)描述了該蛋白的催化功能以及硫酯酶活性分析的相關研究。此種情況下可以顯示出YbgC水解短鏈脂肪族酰基輔酶酰基-輔酶A(Km值11-24mM)(ZhuangZ.,RSong,B.M.Martin,D.Dunaway-Mariano.2002.TheYbgCproteinencodedbytheybgCgeneofthetol畫palgeneclusterof//ae膨//^7wj/"yi/e"z"ecatalyzesacyl-coenzymeAthioesterhydrolysis.FEBSLett.516:161-163)。在這方面的范圍內，體外檢測與乙酰-輔酶A和乙酰乙酰輔酶A的活性同樣依賴于蛋白的純化。由基因組DNA開始，將所迷基因克隆到不同的表達系統，來自NEB(Frankfurta.M.)的系統IMPACT(InteinMediatedPurificationwithanAffinityChitin-binding-Tag)。其有益之處在于該方法可以簡單地以天然的形式，即，無標記物，純化重組蛋白質。將克隆到栽體pTYB1(NEBFrankftirta.M.)中，以便于由大腸桿菌表達并接下來純化所述的酰基輔酶A硫酯酶YbgC。利用引物ybgcTYBlNdefw(ATATACATATGTTGGATAATGGCTTTTC)和ybgcTYBlXhorev(TCCGAACTCGAGTTTTAAGTGATG)通過PCR由基因組DNA擴增y6gc基因。此情況下，引物介導在所述擴增片段的5'端摻入A^el切割位點，在3，端摻入屈o1切割位點。所述的TaqMastermix(Qiagen，Hilden)根據制造商的說明在下述條件下應用<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>獲得了所期望的、大小約為430bp的片段。根據制造商的說明(pJet_ybgcTYB,410bp)，將其首先亞克隆到pJET栽體(Fermentas，St.Leon-Rot)。接下來利用內切核酸酶AWel和Wol再將y6gc片段從該質粒上切割下，并通過凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；peqlabBiotechnologieGmbH,Erlangen,根據制造商的說明進行)。類似地，將栽體pTYB1(7477bp)用M/d和屈o1切割(7439bp),然后利用快速連接試劑盒(FermentasGmbH,St.Leon-Rot)根據制造商的建議將其與經切割并凝膠洗提的片段連接。用10nl連接混合物轉化100pl的CaCb-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。所得的克隆在LB-氨芐青霉素液體培養基中生長，分離質粒DNA。利用限制性酶切(A^el/屈oI)分析檢測所分離的質粒并測序(AgowaGmbH，Berlin)。所得質粒稱作pTYBybgc(SEQIDNo.15)，并于進一步轉化大腸桿菌BL21DE3。在37。C、LB紐p培養基中培養的大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，直至于OD6qo腦0,5時用0.5mMIPTG誘導，此后，所述培養物在20。C、150轉/分鐘條件下繼續培養6小時。異源表達的融合蛋白(約70kDa)與殼多糖結合。通過添加DTT引起構象變化并使靶蛋白(約15kDa)切割出來，所述靶蛋白接下來可被洗脫出來。圖8示出SDS-PAGE凝膠。上部顯示用于分析YbgC的表達的SDS-PAGE。其是Coomassie染色后的10-20%梯度SDS-PA凝膠。所述凝膠中的每一泳道中上樣15nl粗提物(快速細胞裂解物)；1:誘導前，2,3:誘導后6小時。下部示出在殼多糖柱上，經銀染的10-20%梯度SDS-PAGE凝膠中YbgC的純化過程。每一泳道上樣2ng蛋白。CE:粗提物，FT:流通(flow-through),W:洗滌級分，洗脫含蛋白的洗脫級分(級分大小各1ml)。如洗脫級分所顯示的，除了所期望的15kDa蛋白質之外，還有融合蛋白條帶以及切割下來的內含肽結構域的條帶，其可用于在DTNB試驗中進行體外活性檢測。盡管用于確定Km的測定方法不同(數據未示出)，但可以確定對乙酰-輔酶A作為底物的Km為5.3x10^mol'r1(0.53mM)，對乙酰乙酰輔酶A作為底物的Km為1.4x10"mol.r1(0.14mM)。由此，可以通過直接地比較確定針對乙酰乙酰輔酶A的酶的底物親和性實際上提高了。這些結果利于將YbgC用于進一步的克隆試驗。實施例4:用于構建表達栽體的克隆策略為了在大腸桿菌中生產丙酮，將合適的酰基輔酶A硫酯酶、或酰基輔酶A合成酶/酰基輔酶A硫激酶基因與來自丙酮丁醇梭菌的AW基因(基因產物具有SEQIDNo.16所示的氨基酸序列以及相應的cDNA序列SEQIDNo.17,疏解酶A)以及(基因產物具有SEQIDNo.18所示的氨基酸序列以及相應的cDNA序列SEQIDNo.19，乙酰乙酸脫羧酶)一起克隆。為了實現該目的首先選出質粒pSK和pKS。它們是克隆栽體，其主要區別在于多克隆位點(MCS)的方向不同。所述的MCS均位于編碼-半乳糖苷酶N-末端片段的/flcZ'基因序列內部，由此可以通過藍-白篩選選擇重組質粒。在這一方面所涉及的試驗中，優先在可誘導的lac啟動子的控制下表達所克隆的基因。提供栽體pSK用于此目的。此外，還制備了整合到質粒pKS中所產生的變體，在此情況下所迷的基因在來自丙酮丁醇梭菌的組成型硫解酶啟動子的控制下表達。依次將各基因克隆到栽體中。為實現該目的，首先設計用于擴增所述基因的寡核苷酸，向其中引入合適的切割位點，然后進行聚合酶鏈式反應。擴增出全部的片段，并如上所述克隆到所述栽體中。制備策略以及應用pSK時所使用的限制性切割位點如圖9所示。利用質粒pKS的制備方法與上述類似。克隆步驟詳述如下將基因czdc，,e//，MM克隆到質粒pKS中目的是將基因(來自丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脫羧酶)，(來自枯草芽孢桿菌的硫酯酶n)和WM(來自丙酮丁醇梭菌的硫解酶)一起克隆到栽體中，接下來在大腸桿菌中表達它們。利用引物AdcXhofwneu(CATGCTCGAGACGCGTTACGTATC)和AdcAparevneu(GATGGGGCCCTGAATTCTATTACTTAAG)通過PCR方法由質粒pDrive_adc(SEQIDNo.20)擴增所述的乙酰乙酸脫羧酶基因a&。此情況下，引物介導在所述擴增片段的5'端摻入Wol切割位點，在3，端摻入力/7fll切割位點。根據制造商的說明應用聚合酶GoTaq(PromegaGmbH，Mannheim)以及4mMMgCl2在下述條件下進行<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>獲得了預期大小約800bp的片段。通過凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；p叫labBiotechnologieGmbH，Erlangen，按照制造商的說明進行)，然后進行切割，類似于質粒pKS，用限制性內切核酸酶WoI和(788bp)，將栽體脫磷酸(Antarctic磷酸酶，NewEnglandBiolabsGmbH，Frankfurta.M.,按照制造商的說明進行)。然后將經此種方式處理的所述栽體與片段用T4連接酶連接(NewEnglandBiolabsGmbH,Frankfurta.M,),按照制造商的說明進行。用10pi的連接混合物轉化lOOul的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。對于每一混合物，100^的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞轉移到預冷的1.5ml反應容器中，各加入10pi的連接混合物，小心混合，將所述混合物在冰上培養30分鐘。隨后于42°C下熱激90秒，將所述細胞再次置于水上2min，各加入0.5ml預溫的LB培養基。將所述混合物在37。C下輕柔地振蕩培養60min。各100-300pi混合物鋪于LB-氨千青霉素培養基，于37。C下培養過夜。所得的克隆在LB-氨千青霉素液體培養基中生長，如下所述分離所述質粒DNA:應用無柱純化(Qiagen，HiWen)的"Qiagenmini-kit"的經修飾的步驟，依照Birnboim和Doly(Birnboim,H.C.,J.Doly.1979.ArapidalkalineextractionprocedureforscreeningrecombinantplasmidDNA.NucleicAcidsRes,7:1513-1523)快速分離質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切(/^aIA\7zoI)分析檢測，然后將陽性克隆測序(AgowaGmbH，Berlin),該質粒稱作pKSadc并用于后續的克隆步驟。CAGA)和TeIIXhorev(CTATCAACTCGAGTCCAAGCTCAGCTAATTAA),通過PCR由質粒pTEIIsrf擴增硫酯酶II基因/e//,r/。此情況下，引物介導在所述擴增片段的5'端摻入Sa/I切割位點，在3，端摻入^TwI切割位點。根據制造商的說明應用協同聚合酶(synergypolymerase)(GeneCraftGmbH，Ltidinghausen)在下述條件下進行溫<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>獲得了大小約為850bp的預期片段。通過凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；p叫labBiotechnologieGmbH,Erlangen，按照制造商的說明進行)，而后，類似于質粒pKSadc，用限制性內切核酸酶Sa/1和屈oI切割(831bp),將栽體脫磷酸(蝦堿性磷酸酶SAP,FermentasGmbH,St.Leon-Rot,按照制造商的說明進行)。然后將經此種方式處理的所述栽體與片段用快速連接試劑盒連接，按照制造商的說明進行(FermentasGmbH,St.Leon-Rot)。用10^1的連接混合物轉化100n的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。將各100-300^的混合物鋪于LB-氨芐青霉素培養基并于37°C下培養過夜。所得的克隆在LB-氨節青霉素液體培養基中生長，并分離所述的質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測G狄oI/5WI)，將陽性克隆測序(AgowaGmbH,Berlin)。所述質粒稱作pKSadcte用于后續的克隆步驟。通過PCR由來自丙酮丁醇梭菌的基因組DNA擴增硫解酶基因A"，包括硫解酶啟動子。由丙酮丁醇梭菌分離染色體DNA:原則上才艮才居Bertram(Bertram,J.1989.EntwicklungeinesSystemszumDNA-TransferandzurTransposon-MutageneseftirC7oW"'J/wwacWo6w/y//a^w.Dissertation,Universit站G6ttingen)由丙6同丁醇梭菌分離染色體DNA。為了這一目的，細胞在2xYTG培養基中厭氧生長，并在OD600收集約1.2。通過離心(5min,5000xg,4。C)使所迷細胞沉降。用10ml的lxTAE緩沖液(添加10%[w/v]蔗糖)將所述細胞沉淀物洗三次，并于-20。C下儲存。如下所迷由通過此種方式處理的90ml細胞懸液中獲得DNA:1.用3.8ml含蔗糖的lxTAE懸浮所述沉淀(Pellet)2.添加1ml的溶菌酶-RNA酶溶液3.培養30min，37°C4.添加500^的0.5MEDTA(pH8.0),40pl的tris-HCl(pH8.0)，30pl的SDS(10%[w/v])5.培養10min，37。C6.添加200pl的蛋白酶K溶液7.培養2h，37°C8.添加1.4ml的5M高氯酸鈉9.添加7.3ml置于冰上的氯仿-異戊醇(24:1[v/v])10.離心10min，5000xg，40C11.去除上層，水相12.重復步驟9.-11.兩次13.加入1vol.的異丙醇由水相中沉淀DNA14.培養5min,RT15.離心20min，16000xg，4。C16.在RT下干燥所述沉淀最長2h17，在2ml的TE緩沖液中懸浮所述沉淀18.添加200^1的蛋白酶K溶液19.培養過夜，37°C20.用雙蒸水使體積增加到4ml21.添加600^1的3MNa乙酸鹽(pH5.2)22.氯仿-異戊醇抽提三次(參見步驟9.-11.)23.加入1vol.的異丙醇沉淀DNA24.培養5min，RT25.離心20min，16000xg，4。C26.用96o/。(v/v)乙醇(特純的，水冷的)洗沉淀兩次27.在RT下干燥所述沉淀最長2h28.在200nl的TE緩沖液中懸浮所述沉淀用于PCR的引物PthlAXmafw(CATGATTTCCCGGGGGTTAGCATATG)和PthlASalrev(CAGAGTTATTTTTAAGTCGACTTTCTAGCAC)介導在所述擴增片段的5'端摻入義w"I切割位點，在3，端摻入So/I切割位點。根據制造商的說明應用TaqMastermix(Qiagen，Hilden)在下述條件下進行<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>獲得了大小約為1400bp的預期片段。首先將其亞克隆到pJET栽體(Fermentas，St.Leon-Rot)中，按照制造商的說明進行(pJet—PthIA)。接下來用限制性內切核酸酶A7wI和C戶9I再由所述質粒中切出A"片段(1397bp)并通過凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；peqlabBiotechnologieGmbH,Edangen，按照制造商的說明進行)。所述質粒pKSadcte用Wol和C/r9I進行類似地處理并脫磚酸(蝦堿性砩酸酶SAP,FermentasGmbH,St.Leon-Rot,按照制造商的說明進行)。然后將經此種方式處理的所述載體與片段用快速連接試劑盒連接，按照制造商的說明進行(FermentasGmbH,St.Leon-Rot)。用10|nl的連接混合物轉化100pi的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。所得的克隆在LB-氨芐青霉素液體培養基中生長，并分離所述的質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(Sa/I/Cfrl9I)，將陽性克隆測序(AgowaGmbH，Berlin)。具有SEQIDNo.8的質粒稱作pKSatt并用于進一步轉化不同的大腸桿菌菌抹，接下來用其研究丙酮的形成。將基因&//sr/，A"克隆到質粒pSK中為了將這三個基因克隆到栽體pSK中，首先用限制酶^7"I和S"/1將已存在于pKS中的"^:W/^片段切除(1625bp)并經凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；p叫labBiotechnologieGmbH,Erlangen,按照制造商的說明進行)并將其連接到同樣經切割并且去磷酸的pSK栽體(SAP，FermentasGmbH，St.Leon-Rot,按照制造商的說明進行)。應用快速連接試劑盒(NewEnglandBiolabsGmbH,Frankfurta.M.),按照制造商的說明進行，以實現這一目的。接下來使所得克隆在LB-氨節青霉素液體培養基中生長進行檢測，并分離質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(/^alASa/1)。通過此種方式獲得的質粒稱作pSKadcte,并進一步在后續的克隆步驟中使用。利用引物ThlAXmafW(GTCGACCCGGGTCAAAATTTAGGAG)和ThlASalrev(GCTTGTCGAATTCAGATCAGAG),通過PCR由質粒pDrive—linethl(SEQIDNo.21)擴增硫解酶基因A"。此種情況下，所述引物介導在所述擴增片段的5，端摻入7wal切割位點，在3，端摻入5WI切割位點。根據制造商的說明應用TaqMastermix(Qiagen，Hilden)在下述條件下進行<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>獲得了預期大小約為1250bp的片段。將其首先亞克隆到pJET栽體(Fermentas，St.Leon-Rot),按照制造商的說明進行)(pJetJhlA)中。接下來用限制性內切核酸酶A7joI和C/r9I再由所迷質粒中切出AM片段(1243bp)并通過凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；p叫labBiotechnologieGmbH,Erlangen，按照制造商的說明進行)。所述質粒pSKadcte同樣用Ji7wl和C,9I進行處理并脫磷酸(蝦堿性磷酸酶SAP,FermentasGmbH，St.Leon-Rot，按照制造商的說明進行)。然后將所述載體與經此種方式處理的片段用快速連接試劑盒連接，按照制造商的說明進行(NewEnglandBiolabsGmbH,Frankfurta.M.)。用10^的連接混合物轉化100pi的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。所得的克隆在LB-氨芐青霉素液體培養基中生長，并分離所述的質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(S"/I/Cfrl9I),將陽性克隆測序(AgowaGmbH，Berlin)。具有SEQIDNo.7的質粒稱作pSKatt并用于進一步轉化不同的大腸桿菌菌株。可以基于具有SEQIDNo.14(pUCadc_ctfA/B—thlA;參見圖10)、且其中已克隆了梭菌基因adc，c(/^/5和AM的pUC18構建體，在栽體pUC19中生成附加的變體，在pUC19中基因盒在/M啟動子控制下表達。也可以將基因"/4/5特異切割出來，在向所述片段引入適當的切割位點后插入基因和y6gC(圖9)。在pUC18構建體中，還將原有的片段去除，由A"片段替代，其還包含位于"上游"的啟動子序列。圖10顯示pUC19構建體的生成；圖的上部示出將基因盒acjfc/"/4A^"克隆到質粒pUC19的過程；圖的下部示出由質粒pUC19act克隆&//5//和y6gC的過程。所述的克隆過程詳迷如下質粒pUC19act的構建作為該構建基礎的是質粒pUCadc_ctfA/B_thlA，其具有代表克隆到栽體pUC18中的梭菌基因——乙酰乙酸脫羧酶(a&)，輔酶A轉移酶("/4/5)和疏解酶(f/iM)基因，的SEQIDNo.14。所述的基因是以與/acZ基因相反的方向克隆的。對于可在lac啟動子控制下轉錄的基因，再次將adc_ctfA/B_thlA片段(33Ubp)用限制性內切核酸酶和EcoRI切割下來，連接到已用相同的酶進行切割的栽體pUC19中(快速連接試劑盒，按照制造商的說明進行；FermentasGmbH,St.Leon-Rot)。用10pi的連接混合物轉化100pl的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。所得的克隆在LB-氨芐青霉素液體培養基中生長，并分離所迷的質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(Sa/IAE:co及I)。這一具有SEQIDNo.12的質粒被稱作pUC19act并用于進一步轉化不同的大腸桿菌菌抹，接下來用其研究丙酮的形成。該包含用于丙酮生成的梭菌基因的構建體還可以用于與其他構建體進行比較。質粒pUC18att的構建作為該構建基礎的是質粒pUCadc一ctfA/B一thlA，其具有代表克隆到載體pUC18中的梭菌基因一一乙酰乙酸脫羧酶(^/c)，輔酶A轉移酶("/^/5)和硫解酶0/7/J)基因，的SEQlDNo.14。利用引物TeIIpUCBamfw(CAATTGGGATCCGATAACAATTTCACACAG)和TeIIpUCAccrev(GAGATCTGGTACCCGGTTAAATGATCGGA)通過PCR由質粒pTEIIsrf擴增硫酯酶11基因&/;/。此種情況下，所述的引物介導在所述擴增片段的5，端摻入^wHI切割位點，在3'端摻入灰c65I切割位點。根據制造商的說明應用協同聚合酶(GeneCraftGmbH，LUdinghausen)在下述條件下進行<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>獲得了大小約為800bp的預期片段。首先將其亞克隆到pJET栽體(Fermentas，St.Leon-Rot)，按照制造商的說明進行(pJet_teIIpUC)。用限制性內切核酸酶5"wHI和J"65I再將所迷的片段從該質粒上切割下來(776bp)并進行凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；p叫labBiotechnologieGmbH,Erlangen，按照制造商的^兌明進行)。栽體pUCadc_ctfA/B—thlA也同樣用限制酶5amHI和爿cc651處理以提取片段(1331bp)。將混合物在瓊脂糖凝膠中分離，將包含剩余栽體的帶(4633bp)用凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；p叫labBiotechnologieGmbH,Erlangen,按照制造商的說明進行)。然后將所述載體和所述片段用快速連接試劑盒，按照制造商的說明進行(FermentasGmbH,St.Leon-Rot)連接。用10pi的連接混合物轉化100pi的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。所得的克隆在LB-氨芐青霉素液體培養基中生長，并分離所述的質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(B"wHIA4cc651)。所得的質粒pUC18att_sub進一步用于克隆帶有硫解酶啟動子的^M片段。通過PCR由丙酮丁醇梭菌的基因組DNA擴增包括硫解酶基因啟動子的硫解酶基因A/丄利用PCR的引物PthlApUCSalfw(CATGATTTGTCGACGGTTAGCATATG)和PthlApUCBamrev(CAGAGTTATTTTTAAGGATCCTTTCTAGC)介導在所述擴增片段的5，端摻入^/I切割位點，在3，端摻入5a/nHI切割位點。根據制造商的說明應用TaqMastermix(Qiagen，Hilden)并添加2.5mMMgSO4在下述條件下進行<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>獲得了大小約為1400bp的預期片段。首先將其亞克隆到pJET栽體(Fermentas,St,Leon-Rot),按照制造商的說明進行(pJet_PthlApUC)。接著用限制性內切核酸酶<Sa/I和5awHI將A"片段再從該質粒上切割下來(1397bp)并進行凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；p叫labBiotechnologieGmbH,Erlangen，按照制造商的說明進行)。用Sa/I和BawHI將硫解酶片段(無啟動子，1217bp)從先前構建的質粒pUC18att_sub上切割下來，剩余的栽體(4192bp)經凝膠洗提，在將包含啟動子的硫解酶片段(1397bp)連入(快速連接試劑盒，按照制造商的i兌明進行；FermentasGmbH,St.Leon-Rot)。用10pi的連接混合物轉化100pi的CaCl2-感受態大腸桿菌XL1-B細胞。所得的克隆在LB-氨芐青霉素液體培養基中生長，并分離所述的質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(Sa/IABawHI)并測序(AgowaGmbH，Berlin)。所述質粒稱作pUC18att(SEQIDNo.10)并用于進一步轉化不同的大腸桿菌菌林，接下來用其研究丙酮的形成。質粒pUC19att的構建作為該構建基礎的是質粒pUC19act，其代表克隆到載體pUC19中的梭菌基因一一乙酰乙酸脫羧酶("c/c)，輔酶A轉移酶(c(/^/5)和硫解酶(A")基因。用限制酶5awHI和Jcc651將fe仏r,片段由pJet_teIIpUC切出(776bp)并進行凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；peqlabBiotechnologieGmbH,Erlangen,按照制造商的說明進行)。用相同的限制酶切割栽體pUC19act以提取c(/^/5片段。在瓊脂糖中分離后，包含剩余栽體的帶(4633bp)經凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；peqlabBiotechnologieGmbH,Edangen，按照制造商的說明進行)。而后將栽體片段與^//;f/C片段相連。為此，應用快速連接試劑盒(NewEnglandBiolabsGmbH,Frankfurta.M.)，按照制造商的說明進行。轉化如上所述進行。為了檢測所得的克隆，使其接下來在LB-氨節青霉素液體培養基中生長，并分離質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(5"wHIA4cc651)。通過上迷方式所得的質粒稱作pUC19att(SEQIDNo.9)并用于進一步轉化不同的大腸桿菌菌林，接下來用其研究丙酮的形成。質粒pUC19ayt的構建作為該構建的基礎的是質粒pUC19att。利用引物ybgcpUCBamfw(CTCTAGAAGGATCCTGTTTAACTTTAAG)和ybgcpUCAccrev(ATTGGGTACCTCATTGCATACTCCG)通過PCR由基因組DNA擴增來自流感嗜血桿菌的酰基輔酶A硫酯酶YbgC的基因一gc。此種情況下，所述的引物介導在所述擴增片段的5，端摻入5awHI切割位點，在3'端摻入Jcc65I切割位點。根據制造商的說明應用TaqMastermix(Qiagen，Hilden)在下述條件下進行<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>獲得了預期大小約為490bp的片段。首先將其亞克隆到pJET栽體(Fermentas，St.Leon-Rot),按照制造商的說明進行(pJetjbgcpUC)。然后，用限制性內切核酸酶5fl/nHI和Jcc651將^6gc片段再從該質粒上切割下來(465Bp)并進行凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；peqlabBiotechnologieGmbH，Erlangen，按照制造商的說明進行)。同樣地，用限制酶fiawHI和Zcc65I對載體pUC19att進行處理以提取^/;/片段(468bp)。所述混合物在瓊脂糖凝膠中分離，并將包含剩余栽體的條帶(4633bp)通過凝膠洗提(凝膠提取試劑盒；peqlabBiotechnologieGmbH，Erlangen，按照制造商的說明進行)。然后將所迷的栽體與所述片段用快速連接試劑盒，按照制造商的說明進行(FermentasGmbH，St.Leon-Rot)連接。用10pi的連接混合物轉化100Hi的CaCl:r感受態大腸桿菌XL1-B細胞。所得的克隆在LB-氨節青霉素液體培養基中生長，并分離所述的質粒DNA。所分離的質粒通過限制性酶切分析檢測(SamHIA4cc65I)并測序(AgowaGmbH,Berlin)。所得的質粒稱作pUC19ayt(SEQIDNo.11)并用于進一步轉化不同的大腸桿菌菌抹，接下來用其研究丙酮的形成。本發明的質粒構建體總結于表1。表l:質粒構建體質粒大小bo插入物啟動子pSKatt5771麵)lacpKSatt5925pUC19att5409脇)lacpUC18att5589脇)皿pUC19avt5101脇)pUC19act5964"續滅，,)lac實施例5:大腸桿菌中形成丙酮在大腸桿菌克隆菌林HB101中利用所得的全部質粒變體(參見表l)研究丙酮的形成。所述的分析以5ml的規模在含氨芐青霉素(IOOjxg/ml)的LB培養基中進行，進行分析之前先經過從合適的預培養物接種并于37。C、200轉/分鐘條件下進行培養的過程。利用光度計測定光密度(600nm)為約0.5-0.6時，通過添加1mMIPTG(異丙基多危代-(3-0-半乳糖苷)誘導所述克隆基因的表達，誘導3-4小時后加入葡萄糖(20g/l)。受硫解酶啟動子控制的變體未被誘導，這是因為假設發生了組成型表達。在約48小時的過程中，于特定的時間點進行采樣，通過氣相色語確定無細胞的培養基上清中的丙酮和乙酸鹽濃度。在誘導后4小時或者與誘導同時，可任選地另外添加不同劑量(在10-40g/1的范圍)的葡萄糖。檢測到大腸桿菌HB101中的全部質粒變體均產生顯著量的丙酮。圖11示例性的顯示單獨的變體相對于形成的丙酮和乙酸鹽的量的生長曲線。關于最高丙酮濃度的小結如表2所示。圖11顯示在每種情況下，所選定的時間點的光密度(600nm)與丙酮和乙酸鹽濃度(mM)。黑色的箭頭表示在各情況下添加IPTG(lmM)的時間，綠色的箭頭代表添加葡萄糖(20g/l)。表2:質粒pSKattDKSattpUC19attpUC18attpUC19avtoUC19actml培養物中單獨的質粒變體的最高丙酮濃度概要插入物g/4^(at/c,脇)v6g"C^c,/顯啟動子1bclaclac最高丙酮濃度菌株培養基34mM(2.0e/1,HB101,LBAmp)36mMf2.1e/1,HB101,LB"30mM".7e/1，HBIOI，LBAmp)35mMaOe/1，HBIOI，LBa，)60mMG.5g/1,HB101,LB")46mM(2.7e/1,HB101,LB一實施例6:比較涉及由流感嗜血桿菌克隆的ybgC基因的丙酮途徑與僅由梭菌基因組成的丙酮途徑接下來的試驗試圖在100ml變體pUC19ayt的培養物(LBAmp)中再現所得的結果，pUC19act為對照(37。C，200轉/分鐘)。用相應的1ml預培養物接種主培養物，用1mMIPTG在OD6oonm為0.5時進行誘導。與前述試驗不同的是，在第一次添加葡萄糖后的18小時重復添加葡萄糖(20g/l)。此外，在各采樣時間點平行地確定培養物中的的葡萄糖含量，以確定葡萄糖的消耗。通過如Bergmeyer(1970)所述的光-酶試驗確定葡萄糖，其中葡萄糖在己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶以及所添加的ATP和NADP+的作用下，葡萄糖分兩步轉化成6-磷酸葡萄糖和NADPH(Bergmeyer，H.U.(主編)MethodsofEnzymaticAnalysis,2ndEdition,VerlagChemie，Weinheim-DeerfieldBeach-Basel1970)。在此情況下所形成的NAPDH的量與存在的葡萄糖的量成正比，可利用光度計測定340nm波長下的吸光度變化來確定。所述結果如圖12A和12B所示。顯然，在培養物A(大腸桿菌HB101pUC19ayt)在進行第二次添加時已經被完全消耗掉了。然而，重新添加葡萄糖沒有如所希望的那樣使丙酮的量進一步增加，也沒有被消耗，因為顯然沒有檢測到下降。由于光密度沒有進一步的增加，因此假定此時的生長受到其他因素的限制。最高形成67mM(3.9g/l)的丙酮。含有對照質粒pUC19act的培養物B在相同的條件下進行試驗，得到類似的結果。在進行第二次添加時，葡萄糖還沒有被完全消耗掉，但是同樣地，也沒有因重新添加葡萄糖使所形成的丙酮的量相應增加。最高形成20mM(1.2g/l)的丙酮。與僅包含梭菌基因的對照培養物相比，具有來自流感嗜血桿菌的克隆基因基因在這些條件下可產生三倍于對照培養物的丙酮。圖12顯示每一情況下，在所選擇的時間點的光密度(600nm)，丙酮和乙酸鹽的濃度(mM)以及葡萄糖含量(g/1)。黑色的箭頭表示添加IPTG(lmM)的時間，綠色的箭頭表示添加葡萄糖(20g/l)的時間；上部E.co//HB101pUC19ayt，下部co/,'HB101pUC19act(對照)。序列表<110>EvonikDegussaGmbH<120>利用可再生原材料由新的代謝途徑通過通過發酵生產丙酮<130〉200700792<160〉21<170〉Patent工nversion3.4<210>1<211>246<212〉PRT<213>氺古草芽抱桿菌(aaciJJiissubtilis)<400〉1MetGlyGinLeuPheLysSerPheAspAlaSerGluLysThrGinLeu151015lieCysPheProPheAlaGlyGlyTyrSerAlaSerPheArgProLeu202530HisAlaPheLeuGinGlyGluCysGluMetLeuAlaAlaGluProPro354045GlyHisGlyThrAsnGinThrSerAlalieGluAspLeuGluGluLeu505560ThrAspLeuTyrLysGinGluLeuAsnLeuArgProAspArgProPhe65707580ValLeuPheGlyHisSerMetGlyGlyMetlieThrPheArgLeuAla859095GinLysLeuGluArgGluGlyliePheProGinAlaVallie工leSer100105110Ala工leGinProProHislieGinArgLysLysValSerHisLeuPro115120125AspAspGinPheLeuAspHislielieGinLeuGlyGlyMetProAla130135140GluLeuValGluAsnLysGluValMetSerPhePheLeuProSerPhe145150155160ArgSerAspTyrArgAlaLeuGluGinPheGluLeuTyrAspLeuAla165170175GinlieGinSerProValHisValPheAsnGlyLeuAspAspLysLys180185190CyslieArgAspAlaGluGlyTrpLysLysTrpAlaLysAsplieThr195200205PheHisGinPheAspGlyGlyHisMetPheLeuLeuSerGinThrGlu210215220GluValAlaGluArgliePheAlalieLeuAsnGinHisProlielie225230235240GinProGlySerArgSer245<210〉<211〉<212>〈213〉<400>atgggccaactttgccggcggsgatgctcgctcgaagsgcgtgctgttcgcgtgaaggc3ggaatgcccgcgatcagattcctgttcatgaagaagtgggC3sccggg3t2741DNA丙酮丁醇梭菌(CMostridiu/nacetOjbuty』icu/n)2七CttC333tCatttgatgcgcacagctcatctgttttccg60gctattcggcgtcgtttcgccctctccatgcttttttgcsgggggsgtgc120ctgccgsgccgccgggacacggcacgaatc33scgtcsgccsttgsggst180tgscggstttgasctgsaccttcgccctgatcggccgttt240gacacagtatgggcggaatg3tC3CCttC3ggctggcgcs333gcttgag300tctttccgcaggcggttatcatttctgcaatccsgccgcctcatattcag360tgtcccacctgcctgatgatcagtttctcg3tC3t3tt3tccaattaggc420cagagcttgtgaggtcatgtcctttttcctgccttctttc480accgggctcttg33C33tttgagctttacgatctggcccagatccagtcg540tctttaacgggcttgatgataaaaaatgcatacgagstgcggaagggtgg600C3C3ttCC3tcaatttgacggcgggcacstgttcctgctg660aagaagtcgc3gsscgg3tttttgcgatcttgaatcaigcstccgatcatt720ccagatctta3741<210>3<211>650<212〉PRT<213>苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiu/nmeJiloti)<400〉3MetGinAlaGluArgProLeuTrpValProAspArgGlu工leValGlu151015ArgSerProMetAlaGluPhelieAspTrpCysGlyGluArgPheGly202530ArgSerPheAlaAspTyrAspAlaPheHisAspTrpSerValSerGlu354045ArgGlyAlaPheTrpThrAlaValTrpGluHisCysLysVallieGly505560GluSerGlyGluLysAlaLeuValAspGlyAspArgMetLeuAspAla65707580ArgPhePheProGluAlaArgLeuAsnPheAlaGluAsnLeuLeuArg859095LysThrGlySerGlyAspAlaLeuliePheArgGlyGluAspLysVal100105110SerTyrArgLeuThrTrpAspGluLeuArgAlaLeuValSerArgLeu115120125GinGinAlaLeuArgAlaGinGlylieGlyAlaGlyAspArgValAla130135140AlaMetMetProAsnMetProGlu145150AlaSerValGlyAlalieTrpSer165GinGlyValLeuAspArgPheGly180ValCysAspGlyTyrTrpTyrAsn195200LysValArgAlaValAlaLysSer210215ThrlieAlaLeuMetLeuAlaThr155160SerCysSerProAspPheGlyGlu170175GinlieAlaProLysLeuPhelie185190GlyLysArgGinAspValAspSer205LeuGlyAlaProThrVallieVal220ProTyrAlaGlyAspSerAlaAlaLeuAlaProThrValGluGlyGly225230235240ValThrLeuAlaAspPhe工leAlaGlyPheGinAlaGlyProLeuVal245250255PheGluArgLeuProPheGlyHisProLeuTyrlieLeuPheSerSer26026527039GlyThrThrGlyValProLysCyslieValHisSerAlaGlyGlyThr275280285LeuLeuGinHisLeuLysGluHisArgPheHisCysGlyLeuArgAsp290295300GlyGluArgLeuPheTyrPheThrThrCysGlyTrpMetMetTrpAsn305310315320TrpLeuAlaSerGlyLeuAlaValGlyAlaThrLeuCysLeuTyrAsp325330335GlySerProPheCysProAspGlyAsnValLeuPheAspTyrAlaAla340345350AlaGluArgPheAlaValPheGlyThrSerAlaLysTyrlieAspAla355360365ValArgLysGlyGlyPheThrProAlaArgThrHisAspLeuSerSer370375380LeuArgLeuMetThrSerThrGlySerProLeuSerProGluGlyPhe385390395400SerPheValTyrGluGlylieLysProAspValGinLeuAlaSerlie405410415SerGlyGlyThrAsp工leValSerCysPheValLeuGlyAsnProLeu420425430LysProValTrpArgGlyGlulieGinGlyProGlyLeuGlyLeuAla435440445ValAspValTrpAsnAspGluGlyLysProValArgGlyGluLysGly450455460GluLeuValCysThrArgAlaPheProSerMetProValMetPheTrp465470475480AsnAspProAspGlyAlaLysTyrArgAlaAlaTyrPheAspArgPhe485490495AspAsnValTrpCysHisGlyAspPheAlaGluTrpThrProHisGly500505510GlylieVallieHisGlyArgSerAspAlaThrLeuAsnProGlyGly515520525ValArg工leGlyThrAlaGlulieTyrAsnGinValGluGinMetAsp530535540GluValAlaGluAlaLeuCys工leGlyGinAspTrpGluAspAspVal545550555560ArgValValLeuPheValArgLeuAlaArgGlyValGluLeuThrGlu565570575AlaLeuThrArgGlulieLysAsnArglieArgSerGlyAlaSerPro580585590ArgHisValProAlaLys工le工leAlaValAlaAsplieProArgThr595600605LysSerGlyLyslieValGluLeuAlaValArgAspValValHisGly610615620ArgProValLysAsnLysGluAlaLeuAlaAsnProGluAlaLeuAsp625630635LeuPheAlaGlyLeuGluGluLeuLysSer640645650<210>4<211〉1953<212>DMA<213>苜蓿中華根瘤菌<400>4atgcaagcagsscgacctttgtgggttccggacagggagatagtcgascgcsgcccgstg60gctgagttcattgactggtgcggggagcgcttcgggcgcagcttcgccgactstgatgcc120tttcatgactggtcggtgagcgsgcgcggcgcgttctggaccgccgtatgggsscsttgc180aaggtcatcggcgaaagcggggagaaggcgctcgtcgacggcgaccggstgctcgatgcc240cgtttctttccgg33gcg3ggctcaacttcgccg3333cctgctgcgc33gacggggsgc300ggcgatgccttgatcttccgcggcgaggacsaggtgagctaccggctgacctgggacgaa360ctgcgcgccctggtgtcgcgtctgcaacaggcgctgagggcgcaggggstcggcgccggc420gaccgcgtctccgcgatgatgccgaacatgcccgagacgatcgcsctcstgcttgcgscc480gcttccgtcggcgccatctggtcgtcctgttcgcccgatttcggcgagcagggcgtcctc540gsccgcttcggccagatcgcccccaagctcttcatcgtttgcgaicggctsctggtacssc600ggcaagcggcsggacgtggsctcgaaggtgcgtgcggtggccaagtcgctcggcgcgccc660accgtcatcgttccctatgccggagacagcgccgcgcttgcgccgaccgtcgagggcggg720gtgacgcttgccgstttcstcgccggattccaggccggaccgcttgtcttcgagcgcctg780ccgttcggccatccgctctacatactgttctcctcgggcacgsccggcgtacccaaatgc840atcgtccattcggccggcggaacgctgctgC3gcscctc3aggaacatcgcttccattgc900gggctgagggacggcgagcggctgttctatttC3CC3CCtgcggctggatgatgtggaac960tggctggcctcgggcctcgccgtgggcgcaactctgtgcctctatgactgctcscctttt1020tgccccgacggcaacgtgctcttcgattatgccgccgccgaacgcttcgccttgttcggc1080acctcggcgawtststcgscgccgtgcgcsagggcgggttcaccccggcaaggacgcac1140gatctgtcgtccttgcgggtca_tga_cgtccsccggctcgccgctttcgccggagggcttc1200tccttcgtctatgagggcatcaagcccgatgtccagctcgcctcgatttccggcggcscc1260gacatcgtctcctgcttcgtgctcggcsatcccctgaaacccgtgtggcgcggagagatt1320csgggccccggcctcgggctcgccgtcgatgtctggaacgacgaaggcasgccggtgcgc1380ggggaasagggcgaactcgtctgcaccagggcgtttccgtcgatgcctgtcatgttctgg1440aacgatccggscggcgcgaagtatcgagccgcctatttcgaccgcttcgacaatgtctgg1500tgccacggcgattttgccgaatggacaccgcstggcggcatcgtcstccscggccgttcc1560gacgcgacattg33ccccggcggcgtgcgcatcggcacggcggagatctacaatcaggtc1620gaacagatggatgaagtcgccgaagcactgtgcatcggccaggsctgggsggacgatgtc1680cg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